Bacillus subtilis Natto là dòng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn an toàn và có khả năng tổng hợp Nattokinase, một enzyme phân giải huyết khối. Chúng có tiềm năng ứng dụng làm probiotic trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến tim mạch. Nghiên cứu này kiểm tra đặc tính probiotic như khả năng chịu muối mật, khả năng chịu đựng điều kiện dịch dạ dày nhân tạo và khả năng làm tan huyết khối của B.subtilis Natto.
Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (3), 2020 ĐẶC TÍNH PROBIOTIC VÀ KHẢ NĂNG LÀM TAN HUYẾT CỦA CHỦNG BACILLUS SUBTILIS NATTO Đoàn Thị Ngọc Thanh*, Phạm Nguyễn Kim Lài, Phạm Thị Thúy Ngoan Trường Đại học Tiền Giang *Tác giả liên lạc: dtnthanh@tgu.edu.vn (Ngày nhận bài: 10/7/2020; Ngày duyệt đăng: 28/9/2020) TÓM TẮT Bacillus subtilis Natto dịng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn an tồn có khả tổng hợp Nattokinase, enzyme phân giải huyết khối Chúng có tiềm ứng dụng làm probiotic phòng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh liên quan đến tim mạch Nghiên cứu kiểm tra đặc tính probiotic khả chịu muối mật, khả chịu đựng điều kiện dịch dày nhân tạo khả làm tan huyết khối B.subtilis Natto Kết cho thấy chủng vi khuẩn chịu điều kiện khảo sát Sau ủ môi trường chứa 0,3% 0,6% muối mật; mật độ trì 96,8% 85,5% so với ban đầu tương ứng với 7,87± 0,08 6,95± 0,10 log CFU/mL Sau ủ môi trường pH = 2, vi khuẩn có khả tồn với mật độ đạt 6,73±0,04 log CFU/mL tương ứng tỷ lệ sống 79,11% so với ban đầu Sau ủ môi trường dịch dày nhân tạo pH = 2,5 có bổ sung 0,3% enzyme pepsin, mật độ trì 6,71±0,02 log CFU/mL ứng với tỷ lệ 83,31% so với mật độ ban đầu B subtilis Natto có khả kháng lại loại vi khuẩn gây bệnh nghiên cứu Escherichia coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonus aegurinosa ATCC 25853 với vịng vơ khuẩn tương ứng 8,0; 9,0; 10,0 8,0 mm Khả hòa tan huyết khối khẳng định dịch nuôi cấy sau 36 có khả làm tan 25% lượng huyết khối tươi sau ủ, tương ứng với hoạt tính 167 FU/mL enzyme Nattokinase thương phẩm Từ khóa: Bacillus subtilis natto, probiotic, tan huyết, kháng khuẩn PROBIOTIC PROBERTIES AND FIBRINOLYTIC ABILITY OF BACILLUS SUBTILIS NATTO Doan Thi Ngoc Thanh*, Pham Nguyen Kim Lai, Pham Thi Thuy Ngoan Tien Giang University *Corresponding Author: dtnthanh@tgu.edu.vn ABSTRACT Bacillus subtilis Natto is one of GRAS safety bacteria and produces Nattokinase, a fibrinolytic enzyme The bacteria has potential to be probiotic using for prevention and treatment of cardiovascular diseases This study has tested the bacteria’s probiotic properties such as bile salt tolerance, simulated gastric fluid tolerance and fibrinolytic ability The results showed that the bacteria resisted to set conditions After 3-hour incubating in 0.3% and 0.6% bile salt containing media, survival percentage of bacteria were 96,8% and 85,5% corresponding to 7,87±0,08 and 6,95±0,10 log CFU/mL, respectively After exposure to pH = for hours, survival density of bacteria was 6,73±0,04 log CFU/mL or 79.11% of initial density After 3-hour incubation in simulated gastric conditions, pH = 2.5 and 0.3% pepsin, survival density of bacteria was 6,71±0,02 log CFU/mL or 83.31% of initial density B subtilis showed antibacterial activity against pathogenic bacteria: Escherichia coli ATCC 8739 (8,00±0,76mm), Salmonella typhimurium ATCC 14028 (9,00±0,40 mm), Staphylococcus aureus ATCC 12 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (3), 2020 6538 (10,00±0,58mm) and Pseudomonus aegurinosa ATCC 25853 (8,00±0,29mm) Fibrinolytic activity was determined via clotted degradation; 25% clotted weight was lost after 2-hour incubation with 36-hour cultured broth, which equivalent to activity of 167 FU/mL commercial Nattokinase enzyme Keywords: Bacillus subtilis natto, probiotic, fibrinolytic, antibacterial activity tính có lợi cho vật chủ, đồng thời phải sống sót qua điều kiện khắc nghiệt dày hệ tiêu hóa vật chủ Giá trị pH dày người thường dao động khoảng đến Một số nghiên cứu khảo sát khả sống sót chủng vi khuẩn dùng cho probiotic người mốc pH từ đến từ đến 2,5, muối mật hệ tiêu hóa có nồng độ dao động từ 0,3% đến 0,4% (Sangtiago et al., 2008) Vì vậy, đề tài tiến hành khảo sát đặc tính có lợi chủng B subtilis Natto phân lập Việt Nam tính kháng khuẩn, khả tan huyết, tính kháng kháng sinh, đồng thời khảo sát khả chống chịu lại điều kiện khắc nghiệt hệ tiêu hóa đường ruột người TỔNG QUAN Đột quỵ nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ ba sau bệnh lý tim mạch ung thư, đứng hàng đầu tỷ lệ tàn tật người trưởng thành (Feigin V.L et al., 2009) Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm có 15 triệu người mắc đột quỵ não tồn cầu, có triệu ca tử vong triệu người khác phải chịu đựng khuyết tật vĩnh viễn đột quỵ não gây ra, đặt gánh nặng lên gia đình xã hội, đặc biệt nước phát triển, có Việt Nam (Feigin et al., 2014) Năm 1980, Sumi Hiroyuki phát Natto – loại thực phẩm truyền thống người Nhật lên men cách ủ đậu tương nấu chín với B subtilis Natto Vi khuẩn tiết enzyme Nattokinase có khả tiêu fibrin mạnh, enzyme trực tiếp tác động lên tơ huyết làm tan tơ huyết đồng thời giúp cải thiện chức enzyme làm tan huyết khối thể Dựa nguồn gốc thực phẩm hoạt tính làm tan huyết khối mạnh, Nattokinase nghiên cứu, sản xuất thương mại hóa nhờ tác dụng phịng ngừa đột quỵ có hiệu kéo dài (Sumi H et al., 1990) Do đó, bổ sung Nattokinase vào bữa ăn cách hiệu để phịng ngừa cục máu đơng - tượng dẫn đến nguy tai biến đột quỵ Bên cạnh đó, B subtilis Natto thuộc giống B subtilis WHO đánh giá an toàn dùng thực phẩm Ngoài ra, vi khuẩn có tác dụng giảm aldehyde q trình phân giải rượu máu người uống rượu giúp giải độc nhanh (Sumi H et al., 1995) Nhờ đó, chúng probiotic tiềm sản xuất thực phẩm chức năng, sử dụng phòng ngừa nguy đột quỵ Mặt khác, chủng vi sinh vật có tính chất probiotic cần có đặc VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Chủng vi khuẩn B subtilis Natto chủng vi khuẩn: Escherichia coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas agurinosa ATCC 25853 cung cấp Trường đại học Bách Khoa, Đại học quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Kháng sinh cung cấp cơng ty Nam Khoa Hóa chất môi trường cung cấp hãng Himedia, Ấn Độ Phương pháp Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn Bacillus subtilis Natto Nuôi vi khuẩn B subtilis Natto 10 mL môi trường NB, lắc 150 rpm, 37oC 24 Ly tâm thu sinh khối 5.000 rpm, 15 phút, 4oC Huyền phù sinh khối B subtilis Natto thu 10 mL dung dịch đệm PBS Sử dụng huyền phù cho thí nghiệm 13 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (3), 2020 mm Để yên 30 phút để dịch ngấm vào thạch đem ủ 37oC Đo đường kính vịng vơ khuẩn sau 24 Đường kính vịng vơ khuẩn hiệu đường kính lớn có tượng vơ khuẩn trừ đường kính lỗ thạch Mỗi chủng thí nghiệm lặp lại lần lấy đối chứng âm nước muối sinh lý Khảo sát khả kháng kháng sinh Phương pháp đĩa khuyếch tán theo hướng dẫn Hội đồng quốc gia Hoa kỳ tiêu chuẩn lâm sàng phịng thí nghiệm (Clinical and Laboratory Standards Institude – CLSI, 2012) sử dụng để đánh giá tính kháng kháng sinh B subtilis Natto nuôi môi trường NB, lắc điều kiện 150 rpm, 37oC 24 Thu sinh khối hòa với nước muối sinh lý để đạt độ đục 0,5 Mc Farland Dùng tăm vô trùng thấm vào dịch khuẩn quét lên bề mặt đĩa thạch môi trường MHA (Muller Hinton Agar), để khô mặt thạch 10 phút Đĩa kháng sinh đặt lên mặt thạch ủ 37oC 24 Đường kính vịng vơ khuẩn so sánh với tiêu chuẩn CLSI (2012) để kết luận tính nhạy cảm kháng sinh Các loại kháng sinh sử dụng Amoxcillin 10μg (Ax), Cefotaxime 30μg (Ct), Ciprofloxacin 5μg (Ci), Clindamycine 2μg (cL), Chloramphenicol 30μg (Cl), Erythromycin 15μg (Er), Streptomycine 10μg (Sms), Tetracyline 30μg (Te), Vancomycine 30 μg (Va) Mỗi thí nghiệm lặp lại lần lấy giá trị trung bình Khảo sát khả hịa tan huyết khối Ni vi khuẩn B subtilis Natto môi trường NB 37oC, lắc 150 rpm Sau 24 giờ, 36 48 nuôi, ly tâm 5000 rpm 15 phút, bỏ sinh khối, thu dịch vi khuẩn Cân 2g huyết heo tươi vào ống nghiệm, bổ sung thêm mL dịch chiết enzyme Nattokinase thu vào ống nghiệm, mẫu đối chứng dương bổ sung mL dịch enzyme Nattokinase thương phẩm (Công ty dược Hậu Giang), mẫu đối chứng âm bổ sung mL nước cất Khảo sát khả chống chịu pH thấp, dịch dày nhân tạo muối mật Đối với điều kiện pH thấp: Hút mL huyền phù vào ống nghiệm chứa mL dung dịch PBS có pH = 2; pH = pH = Ủ 37oC (mỗi giá trị pH lặp lại lần) Sau 0, 1, ủ, 0,1 mL dịch vi khuẩn đem kiểm tra mật số vi khuẩn môi trường thạch nutrient agar phương pháp đếm khuẩn lạc Đối với điều kiện dịch dày nhân tạo: thực ống nghiệm có điều kiện pH = 2,5 chứa nồng độ pepsin 0%; 0,2% 0,3% Đối với điều kiện muối mật: thực ống nghiệm có nồng độ muối mật 0%; 0,3% 0,6% (Quách Đức Tín cs., 2013) Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc Mẫu lấy từ thời điểm trước sau ủ trích 100 uL pha lỗng bậc 10 đến 10-7 100 uL dịch pha loãng ba nồng độ cuối trãi môi trường NA, ủ 37oC Sau 18 giờ, tiến hành đếm số khuẩn lạc mọc đĩa tính mật n.D độ tế bào theo công thức N = với N V (CFU/mL) mật độ tế bào, n số khuẩn lạc trung bình nồng độ chọn, V (mL) thể tích mẫu cấy trãi, D hệ số pha loãng chọn Đơn vị mật độ tế bào phần kết biểu diễn logN Khảo sát khả kháng khuẩn Khảo sát khả B subtilis Natto kháng lại chủng gây bệnh Escherichia coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas agurinosa ATCC 25853 Vi khuẩn B subtilis Natto nuôi cấy môi trường NB lỏng 24 giờ, ly tâm lấy dịch, bỏ sinh khối Vi khuẩn gây bệnh nuôi cấy NB lỏng qua đêm, ly tâm hòa với nước muối sinh lý cho dịch khuẩn có độ đục 0,5 Mc Farland Trãi 100 uL dịch khuẩn lên bề mặt đĩa môi trường NB agar Đục lỗ thạch có đường kính 14 Chun san Phát triển Khoa học Công nghệ số (3), 2020 vô trùng Ủ 37oC, sau giờ, cân lại khối lượng khối huyết cịn lại tính tỷ lệ hịa tan huyết khối Mỗi thí nghiệm lặp lại lần (Lê Thị Bích Phượng cs., 2012) Natto cho thấy khả sống sót chủng B subtilis Natto sau pH = 81,15% Trong kết đề tài cho thấy vi khuẩn cịn trì đến 92,98% sau ủ, sau giờ, tỷ lệ sống đạt 81,11% so với ban đầu Tại giá trị pH = 2, xem điều kiện pH khắc nghiệt, nhân tố chọn lọc cho vi khuẩn chịu acid tồn dày Khi vi sinh vật rơi vào mơi trường có pH thấp, protein kênh màng bị tổn hại, nước chất dinh dưỡng vào màng khơng điều hịa, áp suất thẩm thấu màng thay đổi, enzyme nội bào bị ức chế, pH thấp, màng tế bào nhanh chóng bị phá vỡ dẫn đến trao đổi chất bị đình trệ từ dẫn đến tế bào bị chết Do đó, mật độ vi khuẩn B subtilis Natto giảm đáng kể sau ủ mơi trường có pH = Sau ủ, mật độ vi khuẩn sống sót giảm 90,98% 79,11% Trong nghiên cứu Hồ Thị Tường Thy, chủng B subtilis B20.1 có khả tồn môi trường pH = qua nhiều KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khả chống chịu môi trường pH thấp Chủng B subtilis Natto có khả sống sót điều kiện pH thấp, mật độ tế bào sống sót sau ủ giá trị pH thấp trì mức 106 CFU/mL Tại pH = 7, giá trị pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển, mật độ tế bào sau ủ 8,35±0,06 log CFU/mL, tương ứng với tỷ lệ 98,24% so với mật độ ban đầu Tại giá trị pH = 3, tỷ lệ tế bào sống sót sau lên đến 98,16% tương ứng với mật độ 8,35±0,04 log CFU/mL Sau ủ, tỷ lệ sống giảm xuống 81,11% tương ứng với mật độ vi khuẩn 6,90±0,05 log CFU/mL Nghiên cứu Huynh Thi Hong Nhi and Nguyen Thuy Huong (2016) kiểm tra số hoạt tính probiotic chủng B subtilis Bảng Mật độ tế bào Bacillus subtilis Natto dịch pH khác sau thời gian ủ pH pH Giờ ủ Mật độ (log CFU/mL) Tỷ lệ (%) 8,50±0,09 8,46±0,02 8,43±0,02 8,35±0,06 100,00 99,49 99,10 98,24 Mật độ (log CFU/mL) 8,50±0,09 8,35±0,04 7,91±0,04 6,90±0,05 pH Tỷ lệ (%) 100,00 98,16 92,98 81,11 Mật độ (log CFU/mL) 8,50±0,08 8,25±0,03 7,74±0,05 6,73±0,04 Tỷ lệ (%) 100,00 97,02 90,98 79,11 nhẹ 8,07±0,01 log CFU/mL T môi trường pH = 2,5 nồng độ pepsin 0,2%, sau ủ số lượng tế bào vi khuẩn giảm 7,75±0,04 log CFU/mL tương ứng với 96,31% Sau giờ, số lượng tế bào vi khuẩn sống sót tiếp tục giảm xuống, cịn lại 7,13±0,04 log CFU/mL (88,61%) 6,75±0,06 log CFU/mL (83,93%) Trong mơi trường có 0,3% pepsin, số lượng tế bào cịn sống sót thấp mơi trường có 0,2% pepsin Sau Khả chống chịu dịch dày nhân tạo chủng Bacillus subtilis Natto Chủng B subtilis Natto có khả sống sót 80% mơi trường có dịch dày nhân tạo với với nồng độ pepsin 0%, 0,2% 0,3% (bảng 2) Tuy nhiên tỷ lệ sống sót giảm dần theo thời gian từ đến khảo sát Trong môi trường pH = không chứa pepsin, mật độ tế bào vi khuẩn ban đầu 8,05±0,01 log CFU/mL, sau mật độ vi khuẩn tăng 15 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (3), 2020 ủ mật độ tế bào đạt 7,35±0,04 log CFU/mL (91,14%) Sau ủ, mật số tế bào lại 7,04±0,02 log CFU/mL (87,49%) 6,71±0,02 log CFU/mL (83,31%) Điều cho thấy, mật số tế bào ban đầu 108 CFU/mL sau chịu tác động dịch dày nhân tạo suốt giờ, mật số tế bào 106 CFU/mL, điều kiện tiêu chuẩn để chế phẩm phát huy tác dụng (Boylston et al., 2004) Bảng Mật độ tế bào Bacillus subtilis Natto dịch dày nhân tạo sau thời gian ủ 0% Pepsin 0,2% Pepsin Giờ Mật độ (log CFU/mL) Tỷ lệ (%) 8,05±0,01 100,00 8,02±0,02 Mật độ (log CFU/mL) 0,3% Pepsin Tỷ lệ (%) Mật độ (log CFU/mL) Tỷ lệ (%) 8,05±0,02 100,00 8,05±0,01 100,00 99,63 7,75±0,04 96,31 7,35±0,04 91,14 8,04±0,02 99,83 7,13±0,04 88,61 7,04±0,02 87,49 8,07±0,01 100,29 6,75±0,06 83,93 6,71±0,02 83,31 Khả chống chịu môi trường muối mật chủng Bacillus subtilis Natto Mật độ tế bào sống sót dịch chứa 0,3% muối mật sau giảm 7,99±0,12 log CFU/mL, sau 7,96±0,11 log CFU/mL giảm nhẹ sau 7,87±0,08 log CFU/mL tương ứng với 96,80% so với mật độ ban đầu Trong mơi trường có muối mật, áp suất thẩm thấu thay đổi làm ảnh hưởng đến trình vận chuyển chất vào màng dẫn đến sinh lý thay đổi Đồng thời, diện muối mật làm giảm sức căng bề mặt phân tử lipid màng tế bào, với tác động nhu động ruột, hạt lipid vỡ ra, cấu trúc lipoprotein xuyên màng bị phá hủy tế bào bị diệt Do đó, điều kiện muối mật ruột thường tiêu chí đánh giá đặc tính probiotic chủng vi sinh Trong dịch chứa 0,6% muối mật, khả sống chủng B subtilis Natto giảm dần theo thời gian Tại thời điểm mật độ tế bào giảm 7,77±0,11 log CFU/mL tương ứng với 95,57% Sau ủ, mật độ tế bào giảm nhẹ 95,20% Sau ủ, mật độ tế bào giảm nhiều, lại 6,95±0,1 log CFU/mL, tương ứng với tỷ lệ 85,49% so với giá trị ban đầu Tóm lại, dung dịch chứa 0%; 0,3% 0,6% muối mật, sau 0, 1, 2, khảo sát, tỷ lệ sống vi khuẩn dao động từ 85,49% - 100,25% mật độ tế bào sau ủ mức 106 CFU/mL Điều khẳng định B subtilis Natto có khả sống sót điều kiện muối mật hệ tiêu hóa người Khả kháng khuẩn chủng Bacillus subtilis Natto Đường kính vịng kháng khuẩn B.subtilis Natto vi khuẩn Escherichia coli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Psedomonus aegurinosa ATCC 25853 8,00±0,76; 9,00±0,40; 10,00±0,58 8,00±0,29 Kết cho thấy, vi khuẩn B subtilis Natto có khả sinh hợp chất kháng với vi khuẩn gây bệnh Có cơng trình nghiên cứu tính kháng khuẩn B subtilis Natto Trong nghiên cứu tính kháng khuẩn chủng B subtilis khác nhiều Đa số chủng B subtilis từ nghiên cứu cho thấy đường kính vịng kháng khuẩn với vi khuẩn Gram âm lớn so với B.subtilis Natto nghiên cứu Trong nghiên cứu Lê Thị Hải 16 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (3), 2020 Yến Nguyễn Đức Hiền, tính kháng vi khuẩn E.coli sau: B subtilis AG 27 (18 mm), B Subtilis AG 60 (18 mm), B subtilis VL 05 (17 mm) B subtilis VL 28 (27 mm) Khả kháng kháng sinh chủng Bacillus subtilis Natto Kết khảo sát tính kháng kháng sinh thể hình Er cL Cl Val Ct Te Hình Đĩa giấy kháng sinh đĩa môi trường nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis Natto B subtilis Natto kháng 1/9 loại kháng sinh Vi khuẩn kháng với Clindamycin, khảo sát Clindamycine thuộc kháng sinh thuộc nhóm Lincosamide (nhóm có tác dụng nhóm Lincosamide thường sử dụng ức chế sinh tổng hợp protein) nhạy với để điều trị ca nhiễm trùng vi sinh 8/9 loại kháng sinh khảo sát vật kỵ khí, ngồi cịn điều trị mụn trứng Streptomycin thuộc nhóm Amino cá có ích điều trị ca glycosides, Ciprofloxacin thuộc nhóm nhiễm khuẩn Staphylococcus aureus Quinolone, Chloramphenicol thuộc nhóm kháng với thuốc methicillin (MRSA) Do Phenicol, Erythromycin thuộc nhóm đó, q trình điều trị bệnh có dùng Macrolines, Tetracylin thuộc nhóm Clindamycin dùng vi khuẩn Tetracylin (5 nhóm có tác dụng ức chế B.subtilis Natto để tăng cường sức đề sinh tổng hợp protein); Amoxicillin thuộc kháng thể q trình phục hồi nhóm β – lactam, Vancomycin thuộc Khả hịa tan huyết khối chủng nhóm Glycopeptide Cefotaxime thuộc Bacillus subtilis Natto nhóm cephalosporin (3 nhóm có tác Điểm đặc trưng chủng B subtilis Natto dụng ức chế tổng hợp vách tế bào vi khả hoà tan huyết khối Kết khuẩn) Điều cho thấy chủng vi khuẩn khảo sát cho thấy khả tan huyết khảo sát an tồn, khơng có tượng dịch vi khuẩn chứa Nattokinase sinh sau kháng nhiều kháng sinh, tránh nguy 24, 36 48 nuôi khác (bảng lan truyền gen kháng cho vi khuẩn 3) khác Bảng Khả hòa tan huyết khối dịch vi khuẩn Bacillus subtilis Natto Mẫu ủ Khối lượng huyết giảm (g) Tỷ lệ (%) ủ Khối lượng huyết giảm (g) Tỷ lệ (%) Nattokinase 670 FU 1,46±0,26 73,0 % 1,52±0,17 76,0 % Dịch chiết sau 24 nuôi 0,28±0,10 14,0 % 0,43±0,10 21,5 % 17 Chuyên san Phát triển Khoa học Công nghệ số (3), 2020 Dịch chiết sau 36 nuôi 0,40±0,04 20,0 % 0,49±0,03 24,5 % Dịch chiết sau 48 nuôi 0,49±0,05 24,5 % 0,50±0,05 25,0 % Nước cất 0,01±0,01 0,5 % 0,02±0,01 1,0 % So sánh khả hòa tan huyết dịch nuôi cấy chứa Nattokinase từ vi khuẩn với enzyme Natto thương phẩm cho thấy hoạt tính Nattokinase chủng B subtilis Natto sau 48 nuôi cao (tương đương 167,5 FU/mL) Sau ủ với khối huyết, khối lượng huyết giảm 0,49±0,05g tương ứng với 24,5% so với khối lượng ban đầu sau ủ tỷ lệ huyết giảm nhẹ Dịch ni cấy sau 36 có khả tan huyết khối thấp so với dịch chiết sau 48 ni với tỷ lệ hồ tan huyết khối sau ủ 20% sau tăng lên 24,5% tương ứng với khối lượng huyết tan 0,40±0,04g 0,49±0,03g Sau 24 nuôi chưa đủ thời gian để vi khuẩn B subtilis Natto sản xuất lượng enzyme có nên tỷ lệ hịa tan mức thấp 14% sau ủ 21,5% sau ủ Như thời gian để vi khuẩn sản sinh nhiều enzyme khoảng từ 36 đến 48 Trong nghiên cứu Lê Thị Bích Phượng cs., 2012, 40 thời gian thích hợp để vi khuẩn Bacillus sp.7.2 Bacillus sp.NP3 phân lập sản sinh enzyme cao môi trường hạt đậu nành Nattokinase sinh nghiên cứu có hoạt tính tương đương 447 FU/g KẾT LUẬN Vi khuẩn B subtilis Natto khảo sát có khả sống sót điều kiện khắc nghiệt môi trường pH thấp, dịch dày nhân tạo, muối mật cao, khả kháng vi khuẩn gây bệnh, kháng lại kháng sinh khả hòa tan huyết khối Với mật độ ban đầu 108 CFU/mL, sau thời gian ủ mơi trường có điều kiện mơ điều kiện dày nhân tạo, mật độ vi khuẩn trì 106 CFU/mL, mật độ đảm bảo cho vi khuẩn phát huy tác dụng có lợi cho thể Ngồi ra, vi khuẩn khảo sát có khả kháng lại chủng vi khuẩn gây bệnh thông thường kháng 1/9 loại kháng sinh khảo sát Những đặc tính cho thấy chủng B subtilis Natto có tiềm để sản xuất probiotic làm chất bổ sung cho thực phẩm chức năn, góp phần giảm thiểu bệnh tai biến mạch máu não, đột quỵ huyết khối bảo vệ sức khỏe công đồng TÀI LIỆU THAM KHẢO LÊ THỊ BÍCH PHƯỢNG, VÕ THỊ HẠNH, TRẦN THẠNH PHONG, LÊ TẤN HƯNG, TRƯƠNG THỊ HỒNG VÂN, LÊ THỊ HƯƠNG, (2012) Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus sinh tổng hợp Nattokinase, Viện Sinh học nhiệt đới Tạp chí Sinh học, 34(3SE): 99-104 LÊ THỊ HẢI YẾN, NGUYỄN ĐỨC HIỀN, (2016) Khảo sát đặc tính probiotic chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập tỉnh Đồng Sông Cửu Long Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Nơng nghiệp, 2: 26 – 32 QUÁCH ĐỨC TÍNH, TỐNG THÀNH TRUNG, NGUYỄN NGỌC DUY, NGUYỄN THÚY HƯƠNG, (2013) Khảo sát số hoạt tính probiotic Kefir chanh dây truyền thống Kefir chanh dây bổ sung Lactobacillus casei VTCC186 Science & Technology Development, 16 (3): 40 – 47 18 ... Vì vậy, đề tài tiến hành khảo sát đặc tính có lợi chủng B subtilis Natto phân lập Việt Nam tính kháng khuẩn, khả tan huyết, tính kháng kháng sinh, đồng thời khảo sát khả chống chịu lại điều kiện... chín với B subtilis Natto Vi khuẩn tiết enzyme Nattokinase có khả tiêu fibrin mạnh, enzyme trực tiếp tác động lên tơ huyết làm tan tơ huyết đồng thời giúp cải thiện chức enzyme làm tan huyết khối... Hiền, tính kháng vi khuẩn E.coli sau: B subtilis AG 27 (18 mm), B Subtilis AG 60 (18 mm), B subtilis VL 05 (17 mm) B subtilis VL 28 (27 mm) Khả kháng kháng sinh chủng Bacillus subtilis Natto Kết khảo