Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 6/2013 đến tháng 8/2013 tại Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. Vật liệu cho quá trình phân lập (bao gồm 40 mẫu hệ tiêu hóa cá tra giống và thương phẩm, 6 mẫu nước và 6 mẫu bùn ao nuôi cá tra) được thu thập từ hai huyện Thanh Bình và Hồng Ngự thuộc tỉnh Đồng Tháp.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS spp TỪ MÔI TRƯỜNG AO NUÔI CÁ TRA TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh1, Văn Thị Thúy1, Nguyễn Văn Chắc2 TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành từ tháng 6/2013 đến tháng 8/2013 Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản Vật liệu cho trình phân lập (bao gồm 40 mẫu hệ tiêu hóa cá tra giống thương phẩm, mẫu nước mẫu bùn ao nuôi cá tra) thu thập từ hai huyện Thanh Bình Hồng Ngự thuộc tỉnh Đồng Tháp Quá trình phân lập chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic thuộc nhóm Bacillus spp thực theo bước Sàng lọc bước dựa đặc điểm hình thái (Gram dương, trực khuẩn, sinh nội bào tử) phản ứng catalase dương tính, kết có 76 chủng có đặc điểm hình thái tiêu biểu cho nhóm Bacillus Kết sàng lọc bước hai dựa khả sinh loại enzyme ngoại bào (protease, amylase, lipase, cellulase) cho thấy có 46 chủng có khả sinh từ loại enzyme trở lên Kết sàng lọc bước ba dựa vào khả đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh (Edwardsiella ictaluri, Vibrio harveyi, V parahaemolyticus, V alginolyticus) phương pháp thạch khuếch tán vạch thẳng vuông góc, cho thấy có 11 chủng đối kháng với chủng vi khuẩn kiểm định 11 chủng Bacillus tuyển chọn lưu giữ sưu tập giống Phòng Sinh học Thực nghiệm có tiềm ứng dụng làm probiotic ni trồng thủy sản Từ khóa: Bacillus, cá tra, đối kháng, enzyme ngoại bào, probiotic I MỞ ĐẦU Nhóm vi khuẩn Bacillus spp chi lớn (với 51 loài định danh xác nhiều lồi chưa phân loại rõ ràng), thuộc họ Bacillaceae Đặc điểm chung chi Bacillus vi khuẩn hình que, Gram dương, catalase dương tính, vi khuẩn hiếu khí kỵ khí tùy nghi, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ, độ muối rộng Đa số loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả sinh nội bào tử, giúp cho chúng đạt ưu sử dụng làm chế phẩm vi sinh thời gian bảo quản dài, dễ dàng vận chuyển, sức đề kháng cao với điều kiện khô hạn chịu nhiệt độ cao đến 60-70oC Với ưu điểm nêu trên, Bacillus spp có mặt đa số chế phẩm vi sinh lưu hành thị trường nước giới Hiện nay, giới có hàng trăm sản phẩm thương mại chế phẩm vi sinh có chứa nhóm Bacillus thành phần, sử dụng cho người, động vật nuôi nuôi trồng thủy sản (Hong ctv., 2005) Nhóm Bacillus spp ứng dụng rộng rãi nuôi trồng thủy sản Việc sử dụng Bacillus spp vi khuẩn probiotic giúp nâng cao tăng trưởng, tăng sức đề kháng bệnh tăng cường hoạt động hệ enzyme đường ruột đối tượng giáp xác cá biển tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei (Liu ctv., 2010; Nimrat ctv., Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản Email: tinhntn.ria2@mard.gov.vn Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 71 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 2012; Zokaeifar ctv., 2012), ấu trùng tôm hùm Homarus gammarus (Daniels ctv., 2010), ấu trùng cá tráp (Avella ctv., 2010), ấu trùng cá bống mú Epinephelus coioides (Sun ctv., 2013), cá bơn Paralichthys olivaceus (Cha ctv., 2013) Có nhiều báo cáo chủng Bacillus spp phân lập từ môi trường ni trồng thủy sản Chúng tìm thấy mơi trường nước, lớp bùn đáy ao, hệ tiêu hóa cá, giáp xác, nhuyễn thể hai mảnh vỏ tôm (Sharmila ctv., 1996; Gatesoupe, 1999) Hai chế tác động chủ yếu nhóm Bacillus spp., khả sinh enzyme ngoại bào giúp hỗ trợ tiêu hóa khả sinh hợp chất kháng khuẩn đối kháng với vi sinh vật gây bệnh Trong số nghiên cứu khả sinh enzyme ngoại bào nhóm Bacillus spp., kể đến nghiên cứu Ghosh ctv (2002), Nejad ctv (2006) Wang (2007) Các enzyme ngoại bào có khả tiết Bacillus spp bao gồm loại enzyme chính: protease, amylase, lipase cellulase Trong số protease kiềm nhận quan tâm lớn khả ứng dụng cao nhóm enzyme Theo nghiên cứu Dias ctv (2008), hai chủng Bacillus, B subtilis chủng hoang dại Bacillus sp phân lập từ trình lên men cà phê Brazil, đánh giá khả tiết protease kiềm Các chủng nuôi cấy môi trường dinh dưỡng có chứa nồng độ khác bột phơ mai 72 Hoạt tính protease cực đại đạt sau 24 (tương ứng với giai đoạn cuối pha tăng trưởng), đạt 839,8 U mg-1 B subtilis 975,9 U mg-1 chủng hoang dại Chủng B licheniformis RP1 72 nuôi cấy môi trường chứa 30 g L-1 chất thải từ ao nuôi tôm nguồn cacbon nitơ Dịch protease thơ thu có chứa loại protease khác nhau, ứng dụng việc tách đạm để thu hồi chitin từ chất thải ao ni tơm q trình phân hủy lơng vũ gia cầm, có tiềm ứng dụng nhiều q trình cơng nghệ sinh học khác (Haddar ctv., 2011) Khả sản sinh hợp chất kháng khuẩn xem chế chủ yếu để ức chế loại trừ nhóm vi sinh vật gây bệnh hệ tiêu hóa mơi trường Nhóm vi khuẩn Bacillus có khả tiết số lượng lớn hợp chất kháng khuẩn Nhóm hợp chất bao gồm bacteriocin, hợp chất ức chế tương tự bacteriocin (Subtilin, Coagulin), chất kháng sinh (Surfactin, Iturins A, C, D, E, Bacilysin) (Urdaci Pinchuk, 2004) Nhiều chủng Bacillus chứa thành phần chế phẩm vi sinh thương mại biết đến với khả sản xuất chất kháng khuẩn Chủng B clausii sản phẩm Enterogermina® có khả tiết hợp chất kháng khuẩn với hoạt tính ức chế vi khuẩn Gram dương (Duc ctv., 2004) Chủng B polyfermenticus chứa sản phẩm Bispan Hàn Quốc sản xuất loại bacteriocin nhạy cảm với protease khơng bền với nhiệt, polyfermenticum, có đặc tính đối kháng với nhóm vi khuẩn Gram dương (Lee ctv., 2001) Chủng B subtilis var natto có khả ức chế nấm gây bệnh (Candida albicans) đường ruột, thông qua việc tiết hợp chất kháng khuẩn surfactin (Nagal ctv., 1996) Trong nghiên cứu này, tiến hành phân lập số chủng Bacillus spp từ mơi TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN trường ao nuôi cá tra tỉnh Đồng Tháp theo hai tiêu chí khả sinh enzyme ngoại bào khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, nhằm đánh giá khả sử dụng chủng làm chế phẩm vi sinh cho nuôi trồng thủy sản II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Vật liệu cho trình phân lập bao gồm mẫu bùn, nước thu từ ao nuôi cá tra giống thương phẩm, hệ tiêu hóa cá tra giống thương phẩm, thu từ huyện Thanh Bình huyện Hồng Ngự thuộc tỉnh Đồng Tháp Số lượng mẫu thu mô tả Bảng Bảng 1: Số lượng mẫu thu từ môi trường ao nuôi cá tra, tỉnh Đồng Tháp Địa điểm Loại mẫu Nước Bùn Hệ tiêu hóa Thanh Bình, Đồng Tháp (cá thương phẩm) 3 10 Hồng Ngự, Đồng Tháp (cá giống) 3 30 Tổng 6 40 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Sàng lọc chủng Bacillus từ mẫu thu Trước tiên mẫu xử lý để thu thập hỗn hợp vi sinh vật Mẫu hệ tiêu hóa (chỉ thu phần ruột non) cắt nhỏ, cho vào ống falcon có chứa 1ml nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) nghiền chày mẫu đồng Mẫu bùn pha loãng nước muối sinh lý (1 g bùn ml nước muối sinh lý), để lắng thu phần dịch Mẫu nước lấy trực tiếp từ mẫu thu Tiếp theo, tiến hành loại bỏ tế bào sinh dưỡng cách gia nhiệt mẫu bể ổn nhiệt 75oC 15 phút Hút 100 µl dịch gia nhiệt trải môi trường DSM (Difco Sporulation Medium) agar ủ 30oC 24 Lựa chọn khuẩn lạc riêng lẻ dựa vào khác biệt hình thái màu sắc, làm cách cấy ria lặp lại môi trường DSM agar Bước chọn lọc dựa tiêu chí sau đây: chọn lọc chủng trực khuẩn Gram dương, sinh nội bào tử catalase dương tính Tiến hành nhuộm Gram chủng phân lập quan sát hình thái diện nội bào tử kính hiển vi (vật kính 100X) Các tế bào Gram dương bắt màu tím, nội bào tử (thường nằm vị trí trung tâm) khơng bắt màu Phản ứng catalase thực cách nhỏ giọt dung dịch hydrogen peroxide (H2O2) lên khuẩn lạc đặt lame kính Bọt khí xuất vịng 10 giây thể phản ứng catalase dương tính 2.2.2 Phân lập dựa vào khả sinh enzyme ngoại bào a Thử nghiệm amylase Phản ứng sinh amylase (có tác dụng phân hủy tinh bột thành đường đơn) nhận biết nhỏ dung dịch lugol vào môi trường thạch ni cấy có chứa tinh bột Phản ứng dương tính thể qua việc tạo thành vòng suốt xung quanh khóm khuẩn lạc Trong trường hợp phản ứng âm tính mơi trường có màu xanh đậm xung quanh khuẩn lạc TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 73 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN b Thử nghiệm lipase Môi trường thử nghiệm bổ sung CaCl2 Tween 80 (một loại hợp chất béo) Nếu vi khuẩn có khả tiết enzyme lipase phân giải Tween 80 tạo acid béo tự do, acid béo kết tủa có mặt Ca2+, tạo nên vùng mờ đục bên xung quanh khuẩn lạc c Thử nghiệm protease (thử nghiệm hai loại enzyme gelatinase caseinase) Đối với vi khuẩn sinh enzyme gelatinase, enzyme phân hủy gelatine (bổ sung môi trường nuôi cấy) tạo vịng xung quanh khóm khuẩn lạc có mặt dung dịch TCA (Trichloric Acetic Acid) 25% Đối với vi khuẩn sinh enzyme caseinase, enzyme phân hủy casein diện môi trường Skim Milk Agar 1%, tạo vùng phân giải suốt xung quanh khóm khuẩn lạc d Thử nghiệm cellulase Chủng vi khuẩn khảo sát ni cấy mơi trường có bổ sung 1% CMC (Carbonyl Methyl Cellulose) Những chủng sinh enzyme cellulase phân giải CMC, sau nhuộm với lugol tạo vịng suốt xung quanh khóm khuẩn lạc 2.2.3 Phân lập dựa vào khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Sử dụng phương pháp vạch thẳng vng góc (cross-streak) phương pháp thạch khuếch tán (agar diffusion) Thực chủng gây bệnh kiểm định: Vibrio harveyi, V parahaemolyticus, V alginolyticus, Edwardsiella ictaluri a Phương pháp vạch thẳng vng góc (cross-streak) (Jayaseelan ctv., 2013) Chủng vi khuẩn khảo sát cấy thành đường thẳng đĩa thạch Nutrient Agar (NA) Tiếp tục cấy vi khuẩn gây bệnh theo đường vng góc với đường cấy vi khuẩn khảo sát Ủ 30oC Tiến hành đo khoảng cách kháng khuẩn sau 24 48 74 b Phương pháp thạch khuếch tán (agar diffusion) (Vaseeharan Ramasamy, 2003) 50 µl dịch vi khuẩn gây bệnh tráng đĩa NA Sau dùng ống sắt hình trụ tiệt trùng khoan lỗ đĩa thạch, dùng nhíp tiệt trùng gắp bỏ khối thạch để tạo thành giếng 50 µl dịch vi khuẩn khảo sát tráng đĩa NA trước 24 giờ, ủ 30oC Dùng ống sắt hình trụ tiệt trùng khoan lỗ đĩa thạch, dùng nhíp tiệt trùng gắp khối thạch chuyển sang giếng bên đĩa NA tráng vi khuẩn gây bệnh Ủ đĩa tủ ấm nhiệt độ 30oC Tiến hành đo khoảng cách vòng kháng khuẩn (D) tạo thành xung quanh giếng (nếu có) sau 24 48 Đánh giá mức độ đối kháng theo mức: D > mm: Đối kháng mạnh (+++); ≥ D > mm: Đối kháng trung bình (++); D ≤ mm: Đối kháng yếu (+) III KẾT QUẢ 3.1 Kết sàng lọc dựa đặc điểm hình thái, phản ứng catalase khả sinh enzyme ngoại bào Từ 52 mẫu thu ban đầu, sau gây sốc nhiệt trải đĩa môi trường DSM, kết chọn 123 khuẩn lạc dựa vào khác địa điểm thu mẫu, hình thái màu sắc khuẩn lạc Sau khuẩn lạc cấy ria làm môi trường NA Tiếp theo tiến hành sàng lọc bước dựa vào hình thái vi khuẩn phản ứng catalase Chúng chọn lọc 76 chủng Gram dương, hình que, sinh nội bào tử phản ứng catalase dương tính Các chủng tiếp tục chọn lọc bước hai, khảo sát khả sinh loại enzyme ngoại bào (gelatinase, caseinase, amylase, lipase cellulase) Kết sinh enzyme ngoại bào minh họa hình TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Hình 1: Kết khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào chủng Bacillus spp A) Các khuẩn lạc sinh gelatinase; B) Các khuẩn lạc sinh caseinase; C) Các khuẩn lạc sinh amylase; D) Các khuẩn lạc sinh cellulase Kết bảng cho thấy tổng cộng có 46/76 chủng khảo sát có khả sinh từ loại enzyme trở lên Trong có 14 chủng sinh loại enzyme, chủng sinh loại enzyme Số chủng sinh enzyme 23 chủng, chiếm 50% tổng số chủng vi khuẩn khảo sát 3.2 Kết sàng lọc dựa vào khả đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh 46 chủng sàng lọc bước hai (có khả sinh từ loại enzyme trở lên), tiếp tục sàng lọc bước ba, dựa khả đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh Kết cho thấy có 11 chủng có khả đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh kiểm định (Bảng 3) Trong có chủng đối kháng mạnh với E ictaluri (khoảng cách vòng kháng khuẩn 8-18 mm), chủng đối kháng mạnh với V harveyi (khoảng cách vòng kháng khuẩn 7,5-8 mm), chủng đối kháng mạnh với V parahaemolyticus (khoảng cách vòng kháng TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 75 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN khuẩn 11-11,5 mm) chủng đối kháng mạnh với V alginolyticus (khoảng cách vòng kháng khuẩn 9-10 mm) Đặc biệt chủng B14 đối kháng mạnh với hai chủng E ictaluri V harveyi, chủng B98 đối kháng mạnh với E ictaluri V parahaemolyticus, chủng B90 đối kháng mạnh với V parahaemolyticus V alginolyticus Từ 123 khuẩn lạc ban đầu, sàng lọc 11 chủng Bacillus (chiếm 8,9%) sau trình sàng lọc qua ba bước Các chủng giữ giống Ngân hàng vi sinh vật có tiềm sử dụng làm probiotic nuôi trồng thủy sản Bảng 2: Các chủng Bacillus spp có khả sinh từ loại enzyme ngoại bào trở lên Khả sinh enzyme ngoại bào KH chủng 76 Số enzyme Amylase Cellulase Lipase Caseinase Gelatinase ngoại bào B1 + + - + + B4 + + - + + B6 + + - + + B7 + + - + + B8 + + - + + B13 + + + + + B14 - - + + + B15 - - + + + B18 - - + + + B19 + + - + + B23 + + + + + B26 + + + + + B27 + + - + + B29 + + + + + B30 + + - + + B32 + - - + + B35 + + - + + B36 - - + + + B38 + + - + + B39 + + - + + B48 + + + - - B51 + + - + + B56 + + + + + B58 + + + + + B61 + + + + + B68 + + - + + B70 + + - + + TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN B75 + + - + + B78 + + - + + B80 + + - + + B81 + + + + + B84 + - - + + B86 + + - + + B87 + - - + + B89 + + + + + B90 + + - + + B92 - + + + + B93 + - - + + B97 + + - + + B98 + + - + + B99 + - - + + B102 - + - + + B103 - + - + + B110 + + + - - B122 + + + - - B123 - + + + + A B Hình 2: Khả đối kháng chủng Bacillus spp với chủng vi khuẩn kiểm định phương pháp vạch thẳng vng góc (chủng B14 đối kháng với chủng E ictaluri (A) phương pháp thạch khuếch tán (chủng B90 đối kháng với chủng V parahaemolyticus) (B) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 77 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Bảng 3: Kết khảo sát khả đối kháng chủng Bacillus spp sau 48 Thạch khuếch tán KH Nguồn gốc Vạch thẳng vng góc E V para- V V E V para- V V icta- haemo har- algino- icta- haemo- har- algino- luri lyticus veyi lyticus luri lyticus veyi lyticus B7 Mẫu nước ao cá thịt +++ - - - - - - - B14 Mẫu nước ao cá giống +++ - +++ - +++ - - - B15 Mẫu nước ao cá giống - - +++ - - - - - B27 Mẫu bùn ao cá thịt +++ - + - +++ - - + B30 Mẫu bùn ao cá thịt ++ - - - - - - - B35 Mẫu bùn ao cá giống +++ - - - - - - - B51 Hệ tiêu hóa cá thịt + + - - - - - - B56 Hệ tiêu hóa cá thịt +++ - - - +++ - - - B90 Hệ tiêu hóa cá giống - +++ - +++ +++ - - - B97 Hệ tiêu hóa cá giống + - - +++ - - - + B98 Hệ tiêu hóa cá giống +++ +++ - - +++ - - - IV THẢO LUẬN Với đặc điểm ưu việt khả tạo bào tử, khả sinh enzyme ngoại bào khả tiết hợp chất kháng khuẩn, nhóm vi khuẩn Bacillus spp nghiên cứu nhiều số nhóm vi sinh vật có tiềm ứng dụng làm probiotic Theo nghiên cứu gần thực nhóm tác giả Nair ctv (2012) nhằm khảo sát đa dạng quần xã vi sinh vật có đặc tính đối kháng từ mẫu thu thập từ vùng cửa sông Cochin, dọc theo 78 bờ biển tây nam Ấn Độ Trong số 4.870 khuẩn lạc sàng lọc, có khoảng 1% thể đặc tính đối kháng mạnh chủng gây bệnh nuôi trồng thủy sản (Vibrio harveyi, V anguillarum, V alginolyticus, V vulnificus, V parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila) Theo kết định danh phương pháp sinh hóa giải trình tự gen 16S rRNA, chủng đối kháng thuộc hai nhóm Bacillus Pseudomonas, nhóm Bacillus chiếm đến 81% TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN Có nhiều nghiên cứu tiến hành phân lập chủng Bacillus từ môi trường thủy sản với mục tiêu ứng dụng nuôi trồng thủy sản Phương pháp sàng lọc chủ yếu sử dụng thử khả đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh cần quan tâm Chủng Bacillus subtilis VSG1, phân lập từ hệ tiêu hóa cá trơi Labeo rohita, có khả đối kháng mạnh với chủng Aeromonas hydrophila gây bệnh cá, với khoảng cách vùng đối kháng 19-21 mm theo phương pháp thạch khuếch tán (Giri ctv., 2011) Tương tự, chủng B cereus TC-2 phân lập từ chất thải phụ phẩm trái dừa, thể hoạt tính kháng khuẩn mạnh (theo phương pháp vạch thẳng vng góc) V harveyi (khoảng cách vùng đối kháng 13 mm) V parahaemolyticus (khoảng cách vùng đối kháng 12 mm) (Nair ctv., 2011) Theo Yilmaz ctv (2006), B cereus có khả tiết chất kháng sinh cerexin zwittermicin, điều giải thích cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh lồi vi khuẩn LuisVillasenor ctv (2011) nghiên cứu đặc tính đối kháng với nhóm Vibrio gây bệnh chủng Bacillus sp phân lập từ hệ tiêu hóa tơm chân trắng, phương pháp đổ thạch lớp kép phương pháp thạch khuếch tán Kết phương pháp thạch lớp kép cho thấy có hai chủng (YC5-2 YC2-a) ức chế phát triển V campbellii V vulnificus, với khoảng cách vòng đối kháng từ 5-18 mm Kết phương pháp thạch khuếch tán cho thấy có chủng (YC5-2, YC2-a, YC3-b C2-2) ức chế tăng trưởng V parahaemolyticus V harveyi, với khoảng cách vòng đối kháng từ 11-17,5 mm Cả chủng khảo sát ức chế V.alginolyticus Mới đây, Jayaseelan ctv (2013) khảo sát hoạt tính đối kháng với nhóm Vibrio chủng probiotic B licheniformis phân lập từ ao nuôi tôm Kết cho thấy số chủng khảo sát chủng Dahb1 cho vùng đối kháng mạnh (6-12 mm, phương pháp vạch thẳng vng góc) 162 chủng Vibrio spp phân lập từ trại giống ao nuôi tôm sú, bao gồm V harveyi (53 chủng), V anguillarum (42 chủng), V vulnificus (31 chủng) V damselae (36 chủng) Điều đáng lưu ý kết khoảng cách vùng đối kháng nghiên cứu nhóm tác giả Nair ctv (2011), Luis-Villasenor ctv (2011) Jayaseelan ctv (2013) tương tự với kết nghiên cứu chúng tơi Cịn khoảng cách vùng đối kháng nghiên cứu nhóm tác giả Giri ctv (2011) cao nhiều so với nghiên cứu Các nghiên cứu số nhóm tác giả khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào nhóm vi khuẩn Bacillus spp khả kích thích vật chủ tiết enzyme tiêu hóa Wang (2007) Nejad ctv (2006) chứng minh bổ sung lượng vi khuẩn Bacillus vào thức ăn ni tơm hoạt tính enzyme tiêu hóa lipase, cellulase, protease amylase tơm tăng có khác biệt mặt thống kê so với nghiệm thức đối chứng Các tác giả cho diện Bacillus kích thích vật chủ sản xuất lượng lớn enzyme ngoại bào Ngoài ra, nghiên cứu Ghosh ctv (2002) cho thấy Bacillus pumilus có khả tiết enzyme ngoại bào bao gồm amylase cellulase, enzyme quan trọng hoạt động tiêu hóa cá bột Với khả tiết enzyme tiêu hóa ngoại bào nói trên, nhóm Bacillus spp sử dụng thông qua đường bổ sung vào thức ăn để đưa vào hệ tiêu hóa vật chủ, chúng thể đặc tính probiotic mình, cụ thể hỗ trợ cho hệ tiêu hóa nâng cao sức tăng trưởng vật chủ TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 79 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN V KẾT LUẬN Từ 52 mẫu thu thập từ hệ tiêu hóa cá tra, nước bùn ao nuôi cá tra tỉnh Đồng Tháp năm 2013, chọn lọc ban đầu 76 chủng với đặc điểm hình thái tiêu biểu cho nhóm Bacillus: Gram dương, hình que, sinh nội bào tử phản ứng catalase dương tính Kết phân lập dựa vào khả sinh enzyme ngoại bào cho thấy có 46 chủng có khả sinh từ loại enzyme trở lên Trong có 23 chủng sinh enzyme, chiếm 50% tổng số chủng vi khuẩn khảo sát Kết phân lập dựa vào khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh phương pháp thạch khuếch tán phương pháp vạch thẳng vng góc, chúng tơi sàng lọc 11 chủng có khả đối kháng với chủng vi khuẩn gây bệnh (Edwardsiella ictaluri, Vibrio harveyi, V parahaemolyticus, V alginolyticus) 11 chủng Bacillus spp tuyển chọn có tiềm sử dụng làm probiotic ni trồng thủy sản LỜI CÁM ƠN Tác giả chân thành cảm ơn bạn cộng tác viên đề tài bạn đồng nghiệp Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản hỗ trợ cho nghiên cứu thành công TÀI LIỆU THAM KHẢO Avella, M.A., Gioacchini, G., Decamp, O., Makridis, P., Bracciatelli, C., Carnevali, O., 2010 Application of multi-species of Bacillus in sea bream larviculture Aquaculture 305, 12-19 Cha, J.-H., Rahimnejad, S., Yang, S.-Y., Kim, K.-W., Lee, K.-J., 2013 Evaluations of Bacillus spp as dietary additives on growth performance, innate immunity and disease resistance of olive flounder (Paralichthys olivaceus) against Streptococcus 80 iniae and as water additives Aquaculture 402403, 50-57 Daniels, C.L., Merrifield, D.L., Boothroyd, D.P., Davies, S.J., Factor, J.R., Arnold, K.E., 2010 Effect of dietary Bacillus spp and mannan oligosaccharides (MOS) on European lobster (Homarus gammarus L.) larvae growth performance, gut morphology and gut microbiota Aquaculture 304, 49-57 Dias, D.R., Vilela, D.M., Silvestre, M.P.C., Schwan, R.F., 2008 Alkaline protease from Bacillus sp isolated from coffee bean grown on cheese whey World J Microbiol Biotechnol 24, 2027-2034 Duc, L.H., Hong, H.A., Barbosa, T.M., Henriques, A.O., Cutting, S.M., 2004 Characterization of Bacillus probiotics available for human use Appl Environ Microbiol 70, 2161-2171 Gatesoupe, F.J., 1999 The use of probiotics in aquaculture Aquaculture 180, 147-165 Ghosh, K., Sen, S.K., Ray, A.K., 2002 Characterization of Bacilli isolated from gut of rohu, Labeo rohita, fingerlings and its significance in digestion J Appl Aquaculture 12(3), 33-42 Giri, S.S., Sukumaran, V., Sen, S.S., Vinumonia, J., Banu, B.N., Jena, P.K., 2011 Antagonistic activity of cellular components of potential probiotic bacteria, isolated from the gut of Labeo rohita, against Aeromonas hydrophila Probiotics & Antimicro Prot 3, 214-222 Haddar, A., Hmidet, N., Ghorbel-Bellaaj, O., FakhfakhZouari, N., Sellami-Kamoun, A., Nasri, M., 2011 Alkaline proteases produced by Bacillus licheniformis RP1 grown on shrimp wastes: Application in chitin extraction, chicken featherdegradation and as a dehairing agent Biotechnol Bioprocess Engineer 16, 669-678 Hong, H.A., Duc, L.H., Cutting, S.M., 2005 The use of bacterial spore formers as probiotics FEMS Microbiol Rev 29, 813-835 Jayaseelan, B.D., Vaseeharan, B., Maharajan, A., Shanthi, S., Vinoj, G., 2013 Vibriostatic effects of probiotic Bacillus licheniformis Dahb1 and its TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN molecular phylogeny resolved through RAPD markers Ann Microbiol., DOI 10.1007/s13213013-0623-z Lee, K.H., Jun, K.D., Kim, W.S., Paik, H.D., 2001 Partial characterization of polyfermenticin SCD, a newly identified bacteriocin of Bacillus polyfermenticus Lett Appl Microbiol 32, 146151 Liu, K.-F., Chiu, C.-H., Shiu, Y.-L., Cheng, W., Liu, C.-H., 2010 Effects of the probiotic, Bacillus subtilis E20, on the survival, development, stress tolerance, and immune status of white shrimp, Litopenaeus vannamei larvae Fish & Shellfish Immunol 28, 837-844 Luis-Villasenor, I.E., Macías-Rodríguez, M.E., GómezGil, B, Ascencio-Valle, F., Campa-Córdova, A.I., 2011 Beneficial effects of four Bacillus strains on the larval cultivation of Litopenaeus vannamei Aquaculture 321, 136-144 Nagal, S., Okimura, K., Kaizawa, N., Ohki, K., Kanatomo, S., 1996 Study on surfactin, a cyclic depsipeptide II Synthesis of surfactin B2 produced by Bacillus natto KMD 2311 Chem Phar Bull Tokyo 44, 5-10 Nair, A.G.H., Donio, M.T.B.S., Viji, V.R.T., Michaelbabu, M., Citarasu, T., 2011 Isolation from coconut retting effluent of Bacillus cereus TC-2 antagonistic to pathogenic Vibrios Ann Microbiol 61, 631-637 Nair, A.V., Vijayan, K.K., Chakraborty, K., Antony, M.L., 2012 Diversity and characterization of antagonistic bacteria from tropical estuarine habitats of Cochin, India for fish health management World J Microbiol Biotechnol 28, 2581-2592 Nejad, S.Z., Rezaei, M.H., Takami, G.A., Lovett, D.L., Mirvaghefi, A.R., Shakouri, M., 2006 The effect of Bacillus spp bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus Aquaculture 252, 516-524 Nimrat, S., Suksawat, S., Boonthai, T., Vuthiphandchai, V., 2012 Potential Bacillus probiotics enhance bacterial numbers, water quality and growth during early development of white shrimp (Litopenaeus vannamei) Vet Microbiol 159, 443-450 Sharmila, R., Jawahar Abraham, T., Sundararaj, V., 1996 Bacterial flora of semi-intensive pond reared Penaeus indicus and the environment J Aquaculture Tropics 11, 193-203 Sun, Y.-Z., Yang, H.-L., Huang, K.-P., Ye, J.-D., Zhang, C.-X., 2013 Application of autochthonous Bacillus bioencapsulated in copepod to grouper Epinephelus coioides larvae Aquaculture 392395, 44-50 Urdaci, M.C., Pinchuk, I., 2004 Antimicrobial activity of Bacillus probiotics In: Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications (Ricca, E., Henriques, A.O and Cutting, S.M., Eds.), pp 171-182 Horizon Bioscience Vaseeharan, B., Ramasamy, P., 2003 Control of pathogenic Vibrio sp by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon Lett Appl Microbiol 36, 83-87 Wang, Y.B., 2007 Effect of probiotics on growth performance and digestive enzyme activity of the shrimp Penaeus vannamei Aquaculture 269, 259264 Yilmaz, M., Soran, H., Beyatli, Y., 2006 Antimicrobial activities of some Bacillus sp strains isolated from the soil Microbiol Res 161, 127-131 Zokaeifar, H., Balcázar, J.L., Saad, C.R., Kamarudin, M.S., Sijam, K., Arshad, A., Nejat, N., 2012 Effects of Bacillus subtilis on the growth performance, digestive enzymes, immune gene expression and disease resistance of white shrimp, Litopenaeus vannamei Fish & Shellfish Immunol 33, 683-689 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 81 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ISOLATION AND EVALUATION OF PROBIOTIC PROPERTIES OF Bacillus spp FROM STRIPED CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) POND ENVIRONMENT IN DONG THAP PROVINCE Nguyen Thi Ngoc Tinh1, Van Thi Thuy1, Nguyen Van Chac2 ABSTRACT This study was conducted since June to August 2013, at the Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No2 The material for isolation (40 samples from striped catfish’s gut, water samples and sediment sample from the nursing and grow-out striped catfish’s ponds) was collected from Thanh Binh district and Hong Ngu district, Dong Thap province The screening process for probiotic Bacillus bacteria was undertaken in steps Step which was based on morphological screening (Gram-positive, rod shape and the presence of endospores) combined with catalase reaction, resulted in 76 isolates Step which was based on the ability to excrete exogenous enzymes (protease, amylase, lipase, cellulase), resulted in 46 isolates excreting at least enzymes Step was based on the antagonistic ability toward the aquatic pathogens (Edwardsiella ictaluri, Vibrio harveyi, V parahaemolyticus, V alginolyticus) and resulted in 11 isolates which antagonized at least one pathogenic strain These 11 isolates are being preserved in the culture collection of the Department of Experimental Biology and have potential to be used as probiotics in aquaculture Keywords: antagonistic ability; Bacillus; exogenous enzymes; probiotic; striped catfish Người phản biện: TS Đặng Tố Vân Cầm Ngày nhận bài: 12/9/2013 Ngày thông qua phản biện: 20/9/2013 Ngày duyệt đăng: 15/10/2013 Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No Email: tinhntn.ria2@mard.gov.vn Nong Lam University, Ho Chi Minh City 82 TAÏP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - - THÁNG 11/2013 ... tiêu hóa cá tra giống thương phẩm, thu từ huyện Thanh Bình huyện Hồng Ngự thuộc tỉnh Đồng Tháp Số lượng mẫu thu mô tả Bảng Bảng 1: Số lượng mẫu thu từ môi trường ao nuôi cá tra, tỉnh Đồng Tháp Địa... lập từ ao nuôi tôm Kết cho thấy số chủng khảo sát chủng Dahb1 cho vùng đối kháng mạnh (6-12 mm, phương pháp vạch thẳng vng góc) 162 chủng Vibrio spp phân lập từ trại giống ao nuôi tôm sú, bao... CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN V KẾT LUẬN Từ 52 mẫu thu thập từ hệ tiêu hóa cá tra, nước bùn ao ni cá tra tỉnh Đồng Tháp năm 2013, chọn lọc ban đầu 76 chủng với đặc điểm hình thái tiêu biểu cho nhóm Bacillus: