nghiên cứu sự kháng thuốc của nhóm vi khuẩn pseudomonas spp. trong môi trường ao nuôi cá tra (pangasianodon hypophthalmus) ở tỉnh trà vinh, bến tre và cần thơ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CHÂU HUỲNH THÙY TRÂM NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG THUỐC CỦA NHÓM VI KHUẨN Pseudomonas spp TRONG MÔI TRƯỜNG AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Ở TỈNH TRÀ VINH, BẾN TRE VÀ CẦN THƠ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN Cần Thơ, 5/2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ cô Từ Thanh Dung hướng dẫn tận tình tạo điều kiện cho em hồn thành đề tài tiếp xúc thực tế ao ni thủy sản Xin gởi lời cảm ơn q thầy cô khoa thủy sản truyền đạt kiến thức quý báu trình học thời gian thực đề tài Xin gởi đến cha mẹ, cậu, chị em lời cám ơn chân thành, nguồn động viên tinh thần suốt thời gian qua Xin gởi đến chị Phạm Thanh Hương lời cám ơn sâu sắc giúp đỡ nhiệt tình đóng góp nhiều ý kiến q báu cho tơi hoàn thành đề tài Xin chân thành cám ơn chị Châu Hồng Thúy anh chị làm việc phịng thí nghiệm trường Đại học Trà Vinh giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho trình thu phân tích mẫu tỉnh Trà Vinh Chân thành cám anh chị cán khoa tập thể lớp bệnh học thủy sản 31 giúp đỡ động viên thời gian thực đề tài i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Mục tiêu đề tài đánh giá kháng thuốc nhóm vi khuẩn Pseudomonas spp môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), để có cách nhìn sâu sắc thuốc kháng sinh, từ đưa biện pháp kiểm sốt việc sử thuốc kháng sinh nuôi trồng thủy sản cách triệt để Trước hết, tiến hành phân lập định danh vi khuẩn Pseudomonas spp từ môi trường ao nuôi cá tra số hộ tỉnh Trà Vinh, Bến Tre Cần Thơ Sau tiến hành làm kháng sinh đồ với 12 loại kháng sinh chọn chủng để xác định MIC với loại thuốc (oxytetracycline hydrochloride, chloramphenicol, streptomycin) phương pháp pha loãng Kết cho thấy đa số chủng vi khuẩn Pseudomonas spp kháng với loại kháng sinh thử nghiệm, tất chủng vi khuẩn kháng với cefazolin (CEZ/30 µg), ampicillin (AM/10 µg), kháng với doxycycline (DO/30µg) (6,7%) (xem Bảng 4.1) Mặc khác, thấy có 13 chủng 30 chủng vi khuẩn thí nghiệm kháng với loại kháng sinh trở lên Giá tri MIC chủng vi khuẩn với chloramphenicol nằm khoảng từ 32 đến >256 µg/ml , với oxytetracycline 8-128 µg/ml, với streptomycine đến >256 µg/ml ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC MỤC LỤC Phần I : ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung đề tài Phần II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm bệnh Pseudomonas spp nuôi thủy sản 2.1 Vi khuẩn Pseudomonas 2.2 Một số nghiên cứu Pseudomonas spp môi trường 2.3 Thuốc kháng sinh nuôi thủy sản 2.3.1 Thuốc kháng sinh 2.3.2 Hiện tượng kháng thuốc vi khuẩn 2.3.3 Sự kháng thuốc nhóm vi khuẩn Pseudomonas Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 10 3.2 Vật liệu nghiên cứu 10 3.2.1 Dụng cụ 10 3.2.2 Môi trường, hoá chất vật liệu nghiên cứu 10 3.3 Phương pháp nghiên cứu 11 3.3.1 Địa điểm thu mẫu 11 3.3.2 Mẫu vi khuẩn 11 3.3.3 Phương pháp thu mẫu 11 3.3.4 Phương pháp đếm mật độ vi khuẩn 11 3.3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn 12 3.3.6 Phương pháp lập kháng sinh đồ 12 3.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 13 Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 4.1 Phân lập định danh vi khuẩn 16 4.2 Kết lập kháng sinh đồ 17 4.2.1 Sự kháng thuốc 30 chủng Pseudomonas spp với kháng sinh 17 4.2.2 Sự kháng thuốc 12 chủng Pseudomonas spp với kháng sinh 19 4.3 Kết làm MIC Phần V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 24 5.1 Kết luận 24 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 5.2 Đề xuất 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 PHỤ LỤC 29 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH MỤC BẢNG HÌNH Hình 2.1 Các đường trao đổi kháng thuốc vi khuẩn động vật người (Prescott et al., 2000) Hình 4.1 Vi khuẩn mơi trường GSP 16 Hình 4.2 Kết nhuộm Gram (100X) 16 Hình 4.3 Kết test O/F 16 Hình 4.4 Sự kháng thuốc 30 chủng Pseudomonas spp với kháng sinh 18 Hình 4.5 Kết kháng sinh đồ chủng PTV085 18 Hình 4.6 Sự kháng thuốc 12 chủng Pseudomonas spp với kháng sinh 19 Bảng 4.1: Sự kháng thuốc 30 chủng Pseudomonas spp với kháng sinh 17 Bảng 4.2: Kết giá trị MIC chủng Pseudomonas spp kháng sinh chloramphenicol, oxytetracycline, streptomycin 21 v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phần ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Việt Nam có ngành nuôi trồng thủy sản phát triển mạnh Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đối tượng ni nước, không đáp ứng cho nhu cầu thực phẩm nước mà mặt hàng xuất quan trọng, diện tích sản lượng khơng ngừng gia tăng Điển hình năm 2007, diện tích mặt nước nuôi cá tra cá basa 6.000 (tổng diện tích đất 9.000 ha) diện tích ni tăng gấp lần so với năm 1997, sản lượng đạt triệu tăng gấp 45 lần so với năm 1997 (22.500 tấn) (Dzung, 2007) Để đáp ứng nhu cầu thị trường, nghề nuôi cá tra phát triển mức độ thâm canh ngày cao dẫn đến nhiều bệnh thường xuyên xảy việc sử dụng thuốc kháng sinh phổ biến nuôi thủy sản làm cho tượng kháng thuốc vi khuẩn ngày tăng Theo khảo sát Mai Văn Tài ctv (2004) mơ hình ni sản xuất giống thủy sản có đến 138 loại thuốc kháng sinh sử dụng Trong môi trường nuôi cá tra (ở vùng nước ngọt) có nhiều nhóm vi khuẩn khác nhau, kháng thuốc nhóm vi khuẩn xác định số nghiên cứu: Sarter et al (2007) nghiên cứu kháng thuốc vi khuẩn Gram âm (Enterobacteriaceae (49,1%), Pseudomonads (35,2%) Vibrionaceae (15,7%)) ao nuôi cá tra cá ba sa vùng ĐBSCL Nghiên cứu Stock and Wiedemann (2001) nhạy cảm tự nhiên 71 loại kháng sinh 102 chủng Edwardsiella bao gồm E tarda (42 chủng), E ictaluri (41 chủng) E hoshine (19 chủng) Và tiêu biểu nghiên cứu Từ Thanh Dung ctv (2008) trạng kháng thuốc vi khuẩn E ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra ĐBSCL Tỉnh Trà Vinh có 29.187 đất ni trồng thủy sản, ni trồng thủy sản nước lợ, mặn chiếm 96% đất nuôi trồng thủy sản Năm 2007, tổng sản lượng thủy sản Trà Vinh đạt 149.000 tấn, sản lượng ni trồng đạt 84.000 chiếm đến 81% tổng giá trị sản phẩm ngành thủy sản mang lại (Ðặng Văn Bường, 2008) Sau cá tra nuôi thử nghiệm thành công vùng nước lợ thuộc ấp 5, xã Bình Thắng, huyện Bình Đại, tỉnh Bến Tre vào ngày đầu năm 2008, có khả cá tra mở rộng diện tích ni vùng nước lợ Nhưng tính đến thời điểm chưa có tác giả công bố kháng thuốc vi khuẩn ao ni cá tra vùng nước lợ Vì đề tài “Nghiên cứu kháng thuốc nhóm vi khuẩn PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Pseudomonas spp môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tỉnh Trà Vinh, Bến Tre Cần Thơ” thực 1.2 Mục tiêu đề tài Đánh giá kháng thuốc nhóm vi khuẩn Pseudomonas spp môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), để có cách nhìn sâu sắc thuốc kháng sinh, từ đưa biện pháp kiểm sốt việc sử thuốc kháng sinh nuôi trồng thủy sản cách triệt để 1.3 Nội dung đề tài − Phân lập, định danh vi khuẩn Pseudomonas spp môi trường nuôi cá tra tỉnh Trà Vinh, Bến Tre Cần Thơ − Xác định kháng thuốc vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas spp phương pháp lập kháng sinh đồ theo Kirby Bauer − Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC- Minimum Inhibitory Concentration) vi khuẩn Pseudomonas spp với số loại kháng sinh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm bệnh Pseudomonas spp nuôi thủy sản Pseudomonas thuộc họ Pseudomonadaceae, vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng cong mãnh, khơng có khả sinh bào tử, kích thước 0,5-1,0 x 1,5-5,0 µm, thường di động với nhiều roi, hiếu khí bắt buộc Hầu hết Pseudomonas có oxidase dương tính, có chủng oxidase âm tính xuất Vi khuẩn tạo sắc tố vàng - xanh, xanh xanh nhạt Nhiệt độ thích hợp cho Pseudomonas phát triển 4-430C, phát triển tốt nhiệt độ thấp Pseudomonas phân bố khắp nơi môi trường, đất nước, tác nhân hội gây bệnh người, động vật thực vật Vi khuẩn phân lập từ bên nội tạng cá, gây bệnh cá chủ yếu P fluorescens, P chlororaphis P anguilliseptica, gây nhiễm trùng máu điều kiện nhiệt độ cao quản lý không phù hợp (Inglis and Hendrie, 1993) Pseudomonas spp mầm bệnh nhiều đối tượng nuôi thủy sản kinh tế quan trọng, gây tỉ lệ tử vong cao (Từ Thanh Dung, 2008) Pseudomonas anguilliseptica thông báo gây bệnh đốm đỏ (red spot disease – RSD hay Sekiten-byo) cá chình Nhật Bản Wakabayashi & Egusa vào năm 1972 Theo Muroga et al (1975), cá chình Nhật Bản (Anguilla japonica) nhạy cảm với P anguilliseptica cá chình châu Âu (Anguilla anguila) Vi khuẩn phân lập từ gan, tỳ tạng, tim máu cá bệnh, khuẩn lạc nhỏ môi trường NA sau 72h ủ 25oC Ngược lại, P fluorescens phát triển tốt môi trường NA 22-25oC tạo sắc tố màu vàng – xanh, tạo sắc tố huỳnh quang đèn cực tím (được trích dẫn Inglis and Hendrie, 1993) Kobayashi et al (2004) xác định tác nhân gây bệnh cá thu từ ao nuôi Wakayama Prefecture vi khuẩn Pseudomanas plecoglossicida kỹ thuật ngưng kết lam với kháng thể P plecoglossicida FPC941 Bằng phương pháp mô học phát tổn thương tỳ tạng, thận, gan, ruột, tim mang, xuất vết hoại tử kèm với xuất huyết, đông máu trương phịng phần tủy tỳ tạng, biểu bì mơ thận Ở gan có tượng hoại tử hình thành vùng áp-xe Tuy nhiên, ruột, tim mang bị vi khuẩn P plecoglossicida cơng mức khơng đáng kể, khơng có tổn thương vi khuẩn không xuất não Theo Từ Thanh Dung ctv (2005), bệnh đốm đỏ xuất tất lồi cá ni cá tự nhiên (cá trắm cỏ, cá tra, cá basa, ếch…), có mức độ trạng thái bệnh cá: Bệnh ác tính- khơng biểu triệu chứng đặc PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com trưng, từ xuất đến đàn cá bị bệnh khoảng 10-30 ngày, thời gian ủ bệnh phụ thuộc vào nhiệt độ chất lượng nước; Bệnh cấp tính- có biểu triệu chứng bệnh khơng đầy đủ, khoảng 40-50% đàn cá mắc bệnh, số lượng cá chết lớn vài ngày; Bệnh thứ cấp tính- biểu xuất huyết đốm đỏ da, hai bên thân vùng bụng bị xuất huyết, ứ máu đỏ bầm, vảy dựng lên, bụng phình to…, 30-40% đàn cá bệnh đàn cá bơi lội uể oải, lờ đờ, chậm chạp, cá khỏi bệnh có nhiều vết sẹo sinh trưởng chậm bình thường 2-3 lần; Bệnh mãn tính- kéo dài suốt q trình nuôi, tỉ lệ chết khoảng 10% đàn cá, cá thu hoạch có nhiều vết sẹo nhiều chỗ loét chưa lành Phan Thị Vân ctv (2002) xác định tỉ lệ nhiễm Pseudomonas fluorescens phân lập từ cá trắm cỏ bị bệnh đốm đỏ xuất huyết 23,6-45,2% 0-7,8%, bệnh đốm đỏ xuất chủ yếu cá tháng tuổi, bệnh xảy quanh năm, cao điểm từ tháng 4-5 tháng 10-11 Bên cạnh loài thuộc giống Pseudomonas gây bệnh, có lồi có ích, cụ thể P stutzeri có khả khử nitrate dựa hồn tồn gen mã hóa cho enzyme dị hóa nitrate chứa bên chúng bao gồm: gen nar (nitrate reductase) , gen nir (nitrite reductase), gen nor (nitrite oxide reductase), gen nos (nitrous oxide reductase)(Lalucat et al., 2006) Quá trình khử nitrate thành nitơ phân tử nhờ vi khuẩn khử nitrate có vi khuẩn P stutzeri, chúng khử NO3- qua sản phẩm trung gian đến sản phẩm cuối N2 khơng khí (Lương Đức Phẩm, 2007) Khả khử nitrate đặc tính bền vững vi khuẩn P stutzeri, loài vi khuẩn loài vi khuẩn dị dưỡng khử nitrate hiệu xem hệ thống chuẩn trình khử nitrate vi khuẩn (Zumft, 1997) Carlson et al (1983) nghiên cứu khả khử nitrate vi khuẩn P stutzeri, P aeruginosa Paracoccus denitrificans Kết cho thấy P stutzeri tạo sản phẩm khí nitơ P aeruginosa tạo nhiều khí N2O N2 Thêm vào bất lợi vi khuẩn P aeruginosa làm giảm lượng nitrate (NO3-), nitrite (NO2), nitrous oxide (N2O) chậm khả sinh trưởng khí điều hồn tồn thực vi khuẩn P stutzeri Vì P stutzeri ứng dụng xử lý đạm ao nuôi cá tra (được Đặng Thị Bé trích dẫn, 2008) 2.2 Một số nghiên cứu Pseudomonas spp môi trường Nghiên cứu Kennedya et al (2006) phức hệ vi sinh vật (VSV) trại sản xuất giống tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii), tổng số PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com thường có phổ tác dụng rộng, có tác dụng tốt vi khuẩn thuộc họ đường ruột (trực khuẩn Gram âm khó tính bao gồm Pseudomonas…) Theo Bùi kim Tùng (2001), streptomycin (SM) nhóm aminosid không hấp thu qua ruột nên không dùng không uống mà sử dụng phương pháp tiêm, người SM chủ yếu trị bệnh lao, tỉ lệ kháng (66,7%) cao NM Trong thí nghiệm này, SM có tỷ lệ kháng cao với 30 chủng có đến 20 chủng kháng SM (Hình 4.4), có chủng nhạy Sokari et al (2005) xác định 157 chủng Pseudomonas spp có 56 chủng kháng (35,67%) Trong 30 chủng thí nghiệm có 13 chủng kháng với trimethoprimsulfamethoxazole (SXT), tỉ lệ kháng (43,3%) chưa đến 50%, với chloramphenicol (CHL) tỉ lệ kháng cao đến 60% (Bảng 4.1) So với nghiên cứu Akinbowale et al (2007) tỉ lệ kháng với SXT CHL 50%, chủng vi khuẩn kháng với SXT thấp kháng với CHL cao Theo điều tra Mai Văn Tài ctv (2004), có 373 loại hố chất CPSH sử dụng nuôi thủy sản có loại bị cấm sử dụng có CHL 4.2.2 Sự kháng thuốc 12 chủng Pseudomonas spp với kháng sinh chủng vi khuẩn 14 12 10 12 11 12 11 444 1 kháng sinh NOR CEZ RA AM NM NF Hình 4.6 Sự kháng thuốc 12 chủng Pseudomonas spp với kháng sinh Norloxcin (NOR) hệ II nhóm fluroquinolon, theo Bùi Kim Tùng (2001) nhóm kháng sinh có khả ức chế hoạt động enzym AND gyrase, enzyme can thiệp vào việc chép đảo trình tự nucleotid trình chép AND, lạm dụng fluroquinolon tạo chủng vi khuẩn kháng thuốc vĩnh viễn đột biến Kết nghiên cứu này, thấy có đến chủng Pseudomonas spp kháng với NOR (42% chủng vi khuẩn) Newaj-Fyzul et al (2008) xác định chủng 19 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com chủng Pseudomonas spp phân lập từ nước ao nuôi kháng với NOR (12,5%) Mặc khác, Nguyễn Thị Tiên (2007), nhóm Pseudomonas spp phân lập từ ao nuôi tôm bệnh phân trắng kháng với NOR 25% Đặc biệt với kháng sinh neomycin (NM) có tỉ lệ nhạy, nhạy trung bình, kháng 33.3% (Bảng 4.1), Wooley et al (2004) xác định P aeruginosa kháng NM với giá trị MIC 90 µg/ml Kết kháng sinh đồ cho thấy 12 chủng Pseudomonas spp thử nghiệm kháng với ampicillin (Hình 4.6), giống với nghiên cứu Newaj - Fyzul et al (2008), phân lập chủng Pseudomonas spp mẫu nước ao nuôi cá rô phi Trinidad kháng với ampicillin (100%) Mặc khác, theo khảo sát Trần Thanh Nguyên (2004), có 43,3% số hộ ni cá tra cơng nghiệp Thốt Nốt- Cần Thơ sử dụng ampicillin để điều trị bệnh Tương tự, 100% chủng Pseudomonas spp kháng với cefazolin (CEZ), rifampicin (RA), nitrofurantoin (NF) có 11 chủng kháng số 12 chủng thí nghiệm CEZ chủ yếu để trị bệnh mật người, xuất hoàn tồn qua thận 24h, uống chủ yếu dùng phương pháp tiêm NF thuộc nhóm Nitrofuran, hầu hết chất nhóm khơng hấp thu qua màng ruột, riêng NF hấp thu qua ruột, sau uống NF có nồng độ nước tiểu nên chủ trị bệnh nhiễm trùng đương tiểu người xuất chủ yếu qua thận, không tác dụng với Pseudomonas (theo Bùi Kim Tùng, 2001) Nhìn chung, kháng thuốc chủng Pseudomonas spp cao, 30 chủng thử nghiệm chủng không kháng (Phụ lục 7), nhiên chủng thử với loại kháng sinh, có 13 chủng kháng từ loại thuốc trở lên Nếu chủng vi khuẩn chủng gây bệnh gây khó khăn cho việc điều trị Theo Nguyễn Đức Hiền (2008), cho nguyên nhân làm cho hiệu điều trị bệnh ngày hiệu kháng thuốc vi khuẩn Với kết nghiên cứu kháng sinh đồ thực cá tra bệnh gan thận mủ xuất huyết nuôi trang trại thuộc địa phương Cần Thơ, An Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Hậu giang Bến tre cho thấy mức độ nhạy thuốc vi khuẩn (Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas spp Aeromonas spp.) gây bệnh ngày giảm dần Kết nghiên cứu kháng sinh đồ từ 1/2006–3/2008 với kháng sinh (doxycilin, florfenicol, norfloxacin, enrofloxacin, amoxicilline) cho th độ nhạy đa số kháng sinh khảo sát ngày giảm dần chứng tỏ vi khuẩn gây bệnh ngày kháng thuốc nên dẫn đến tỉ lệ thành công điều trị thấp Theo nghiên cứu Sarter et al (2007) kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn ao nuôi cá da trơn trại nuôi cá da trơn khác nhau, kiểm 20 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com tra kháng thuốc chủng vi khuẩn phân lập với loại thuốc kháng sinh: oxytetracyline (OTC), chloramphenicol (CHL), trimethoprimsulphamethoxazol (SXT), nitrofurantoin (NF), nalidixic acid (NA) ampicillin (AM) Thấy phần lớn chủng vi khuẩn đa kháng, tìm thấy P pseudomallei, P cepacia kháng với AM-OTC-SXT-NA, 10 chủng P cepacia kháng với AM-CHL-NF-SXT-NA Cịn thí nghiệm này, kháng từ loại kháng sinh trở lên chiếm 43%, có chủng PCT0914 kháng đến 11 kháng sinh Từ kết cho thấy, kháng thuốc Pseudomonas spp thí nghiệm mức cao 4.3 Kết làm MIC Sau làm kháng sinh đồ chọn ngẫu nhiên chủng Pseudomonas spp (PTV083, PCT0914, PTV0923, PBT0925) làm MIC kết hợp chủng tham khảo P aeruginosa E coli Kết giá trị MIC chủng chủng đối chứng phù hợp với giá trị MIC kháng sinh có tài liệu CLSI M49-A Kết giá trị MIC chủng Pseudomonas spp trình bày Bảng 4.2 Bảng 4.2: Kết giá trị MIC chủng Pseudomonas spp với kháng sinh chloramphenicol, oxytetracycline, streptomycin Chủng vi khuẩn Giá trị MIC (µg/ml) Chloramphenicol Oxytetracycline Streptomycin 32 PCT0914 >256 128 >256 PTV0923 128 12 >256 PBT0925 64 >256 PTV083 Qua bảng số liệu cho thấy giá trị MIC chủng thấp µg/ml giá trị MIC cao ≥256 µg/ml Nồng độ ức chế chloramphenicol (CHL) với Pseudomonas spp trải dài từ 32 đến ≥ 256 µg/ml , phù hợp với kết kháng sinh đồ (Phụ lục 7) Cả chủng PBT0825; PTV083; PTV0923; PCT0914 kháng với CHL mức độ khác nhau, với giá trị MIC 32; 64; 128; ≥256 µg/ml Theo Đặng Thị Hoàng Oanh ctv (2005) nồng độ ức chế chủng kháng với (CHL) lên đến ≥512 µg/ml Thuốc kháng sinh loại thuốc nằm danh mục thuốc cấm sử dụng sản xuất, kinh doanh thủy sản (Phụ lục 8) độc tính cao gây thối hóa tủy xương, cịi cọc, chậm lớn (Lê Thị Kim Liên ctv., 2008) Vì việc xác định giá trị MIC 21 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com chủng Pseudomonas spp thí nghiệm mang ý nghĩa nghiên cứu, Đặng Thị Hoàng Oanh ctv.(2004) sưu tập 10 chủng vi khuẩn có khả phát triển mơi trường ISA có bổ sung 256 µg/ml CHL để sử dụng cho mục đích khám phá gen qui định khả thích ứng vi khuẩn với hàm lượng CHL cao môi trường, không nên áp dụng vào thực tiễn việc điều trị bệnh nuôi thủy sản Hình 4.7 Kết MIC chủng PTV083 với chloramphenicol nồng độ 64 µg/ml (mũi tên) Chú thích: 1: Ống đối chứng (+); 4: Ống nồng độ 16µg/ml; 7: Ống nồng độ 128µg/ml; 2: Ống nồng độ 4µg/ml; 5: Ống nồng độ 32µg/ml; 8: Ống đối chứng (−) 3: Ống nồng độ 8µg/ml 6: Ống nồng độ 64µg/ml Đối với kháng sinh oxytetracycline, nhóm với tetracycline (TE) nên đối chiếu với kết kháng sinh đồ TE, giá trị MIC chủng PTV083; PCT0914; PTV0923; PBT0925 8; 128; 16; µg/ml (Bảng 4.2) Kết tương đối phù hợp, chủng có giá trị µg/ml kết kháng sinh đồ khác chủng PTV083 nhạy cịn PBT0925 nhạy trung bình, nhiên mức độ chênh lệch khơng nhiều so với khoảng cách nồng độ thuốc làm MIC nên khơng thể xác định xác kết chấp nhận Kim et al (2004) nghiên cứu đa dạng gen kháng thuốc TE vi khuẩn xác định giá trị MIC chủng Pseudomonas 256 µg/ml Giá trị MIC cao chủng >256 µg/ml cho thấy chủng kháng với SM mức cao, SM không hấp thu qua ruột nên thường sử dụng phương pháp tiêm chủ yếu, SM khơng sử dụng phổ biến ni thủy sản, có nhiều ngun nhân, có chuyển đổi gen mơi trường theo nhiều đường khác (Hình 2.1) Để xác định nguyên nhân cần có nghiên cứu sâu chất kháng thuốc vi khuẩn Pseudomonas spp Tuy nhiên, khơng tìm thấy khác biệt tính kháng thuốc vi khuẩn Pseudomonas spp mơi trường ao nuôi cá tra tỉnh Trà Vinh, Bến Tre Cần Thơ Vì Pseudomonas phân bố khắp nơi môi trường, đất, nước, tác nhân gây bệnh nhiều đối tượng (người, động vật thực vật), mà lan truyền tính kháng thuốc vi khuẩn người động vật, môi trường…qua nhiều đường khác (Hình 2.1), nên khơng thể thấy khác biệt tính kháng thuốc chủng vi khuẩn tỉnh đề tài 23 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Kết định danh 30 chủng Pseudomonas spp từ môi trường ao nuôi cá tra tỉnh Trà Vinh, Bến Tre, Cần Thơ Qua kết kháng sinh đồ cho thấy chủng Pseudomonas spp kháng tỉ lệ kháng cao ampicillin cefazolin 100%, kế nitrofurantoin rifampicin (91,7%), kế streptomycin (66,7%), chloramphenicol (60%), kháng sinh lại tỉ lệ kháng thấp 50%, thấp doxycycline (6,7%), từ cho thấy doxycycline nhạy với chủng Pseudomonas spp thí nghiệm Nồng độ ức chế tối thiểu MIC chủng Pseudomonas spp (PTV083, PCT0914, PTV0923, PBT0925) với chloramphenicol khoảng từ 32-256 µg/ml , với oxytetracycline 8-128 µg/ml, với streptomycine 4256 µg/ml 5.2 Đề xuất Cần mở rộng địa bàn thu mẫu tăng lượng mẫu nhằm đánh giá toàn diện khả kháng thuốc vi khuẩn Pseudomonas spp ao nuôi cá tra Cần định danh Pseudomonas spp ao ni đến lồi có nghiên cứu sâu chế kháng thuốc loài vi khuẩn này, từ đưa giải pháp khống chế trạng kháng thuốc có hiệu nuôi thủy sản 24 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Akinbowale, O.L., H Peng and M.D Barton, 2005 Antimicrobial resistance in bacteria isolated from aquaculture sources in Australia The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology 100 School of Pharmaceutical and Medical Sciences, University of South Australia, Adelaide, Australia p1103–1113 Akinbowale, O.L., H Peng and M.D Barton, 2007 Diversity of tetracycline resistance genes in bacteria from aquaculture sources in Australia Journal compilation The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology 103 (2007): p2016–2025 Alderman, D J, 2000 Antimicrobial drug use in aquaculture In S Giguere, J.F Prescott, D Baggot, R.D.Walker, and P.M Dowling (eds.) Antimicrobial therapy in veterinary medicine Lowa State University Pree/Ames P 705-706 Al-Harbi, A.H and N.Uddin, 2003 Quantitative and qualitative studies on bacterial flora of hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O aureus) cultured in earthen ponds in Saudi Arabia Aquaculture Research, Volume 34 p 43-48 Barrow, G.I and R K A Feltham, 1993 Cowan and Steel’s manual for the indentification of medical bacteria, rd edn Cambridge Univesity 262pp Bauer, A.W and W.M Kirby, 1966 Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disc method American Jounal of Clinical Pathology, V 45, p493-496 Bùi Kim Tùng, 2001 Thuốc kháng sinh Sở khoa học công nghệ Bà Rịa- vũng Tàu 255 trang Bùi Thị Tho, 2003 Thuốc kháng sinh nguyên tắc sử dụng chăn nuôi Nhà xuất Hà Nội 323 trang Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006 Methods for borth dilution susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals: M49-A Clinical and Laboratory Standards Institute Wayne USA 10 Đặng Thị Bé, 2008 Xử lí đạm nước ao nuôi cá tra vi khuẩn Pseudomonas stutzeri vi khuẩn Rhodopseudomonas spp Luận văn tốt nghiệp đại học Khoa thủy sản Trường Đại học Cần Thơ 43 trang 11 Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Minh Hậu Nguyễn Thanh Phương, 2004 Thiết lập sưu tập vi khuẩn kháng thuốc kháng 25 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com sinh chloramphenicol khoa thủy sản, đại học Cần Thơ Tạp chí Nghiên cứu Khoa học 2004 Trường Đại học Cần Thơ Trang 76-81 12 Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, Temdoung Somsiri, Supranee Chinabut, Fatimah Yussoff, Mohamed Shariff, Kerry Bartie, Geert Huys, Mauro Giacomini, Stefania Berton, Jean Swings and Alan Teale, 2005 Xác định tính kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phân lập từ hệ thống nuôi thủy sản đồng sông Cửu Long, Việt Nam Tập chí nghiên cứu khoa học Trường Đại học Cần Thơ 13 Đặng Thị Hoàng Oanh, Từ Thanh Dung, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005 Giáo trình bệnh học thủy sản Đại học Cần Thơ Trang 47-48 14 Dung, T.T., F.Haesebrouck, N.A.Tuan, P.Sorgeloos, M.Baele, A.Decosrere, 2008 Antimicrobial susceptibility pattern of Edwardsiella ictaluri isolates from natural outbreaks of bacillary necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in Vietnam Microbial drug resistance, volume 14, number 4, 2008 p 311-316 15 Dzung, N H, 2007 Vietnam pangasius and World Markets Global trade conference on Aquaculture, Qingdao, 29-31 May 2007 16 Inglis, V and M S Hendrie, 1993 Pseudomonas and Alteromonas infections Bacterial disease of fish Institute of Aquaculture, Scotland, UK p 169-172 17 Kim, S.R., L Nonaka and S Suzuki, 2004 Occurrence of tetracycline resistance genes tet(M) and tet(S) in bacteria from marine aquaculture sites FEMS Microbiology, Letters 237: 147–156 18 Kobayashi,T., M Imai, Y Ishitaka and Y Kawaguchi, 2004 Histopathological studies of bacterial haemorrhagic ascites of ayu, Plecoglossus altivelis (Temminck & Schlegel) Journal of Fish Diseases 27: p451–457 19 Lê Thị Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, Nguyễn Thị Như Ngọc, Phạm Thanh Liêm, 2008 Bài giảng thuốc hóa chất ni trồng thủy sản Khoa thủy sản Đại học Cần Thơ Trang 76.(79 trang) 20 Le, T X., Y Munekage and S Kato, 2005 Antibiotic resistance in bacteria from shrimp farming in mangrove areas Science of the Total Environment 349 (2005): 95-105 21 Mai Văn Tài, Tống Hồi Nam, Lý Thị Thanh Loan, Phạm Văn Tình,…, 2004 Điều tra đánh giá trạng loại thuốc, hóa chất chế phẩm sinh học dung ni trồng thủy sản nhằm đề xuất giải pháp 26 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com quản lý Báo cáo đề tài khoa học, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 24 trang 22 Newaj-Fyzul, A., A Mutani, A Ramsubhag and A Adesiyun, 2008 Prevalence of bacterial pathogens and their antimicrobial resistance in Tilapia and their Pond Water in Trinidad Journal compilation Blackwell Verlag Zoonoses Public Health 55 (2008): p 206–213 23 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 2002 Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục Hà Nội Trang 14 24 Nguyễn Thị Tiên, 2007 Xác định đặc điểm sinh hóa khả kháng thuốc mầm bệnh phân lập tôm sú (Penaeus monodon) bệnh phân trắng Luận văn tốt nghiệp đại học Khoa thủy sản Đại học Cần Thơ 48 trang 25 Phan Thị Vân, Nguyễn Thị Hà, Kim Văn Vạn, Phạm Thị Yến, Trần Thị Kim Chi, Phạm Văn Khang, Đặng Thị Lụa, Phạm Văn Thư Nguyễn thị Nguyện, 2002 Xác định tác nhân gây bệnh đốm đỏ xuất huyết cá trắm cỏ Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản trang 26 Sarter S, H N K Nguyen, L.T Hung, J Lazard and D Montet, 2007 Antibiotic resistance in Gram-negative bacteria isolated from farmed catfish Food Control 18 p 1391-1396 27 Sazakli, E , M Leotsinidis, A Vantarakis and M Papapetropoulou, 2005 Comparative typing of Pseudomonas species isolated from the aquatic environment in Greece by SDS-PAGE and RAPD analysis Journal of Applied Microbiology, 99: 1191–1203 28 Stock, I and B Wiedemann, 2001 Natural Antibiotic Susceptibilities of Edwardsiella tarda, E ictaluri, and E hoshinae Antimicrobial agents and Chemotherapy, Vol 45, No 8: p2245–2255 29 Trần Thanh Nguyên, 2004 Khảo sát tình hình sử dụng thuốc hóa chất nghề ni cá tra công nghiệp ao Thốt Nốt- Cần Thơ Tiểu luận tốt nghiệp đại học Khoa thủy sản Trường Đại học Cần Thơ 30 trang 30 Từ Thanh Dung, 2008 Bài giảng bệnh vi khuẩn động vật thủy sản Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ 127 trang 31 Wooley, R.E, Branson W Ritchie, Victoria V Burnley, 2004 In vitro effect of a buffered chelating agent and neomycin or oxytetracycline on bacteria associated with diseases of fish Diseases of aquatic organisms, 59 (2004): 263–267 27 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 32 Bến Tre: Con cá tra “bơi” vào vùng nước lợ http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=1015068&news_ID=13253 432 (cập nhật ngày 13/2/2008) 33 Dương Thị Mỹ Hận, Phức hệ vi sinh vật trại sản xuất giống tôm xanh (Macrobrachiumrosenbergii) http://www.mekongfish.net.vn/modules/news/article.php?storyid=91 (Cập nhật 18/03/2007) 34 Đặng Văn Bường, 2008 Nuôi thủy sản Trà Vinh http://www.mdec.vn/index.php?cgi==QHZXFXUpF1Rz0DNtZSPz0mJ1A DMwQ3Z9ITbmM3dl52X3VWa21TMtZSbh5Gdllmd9ATb (Cập nhật ngày 17/10/2008) 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC Phụ lục PHIẾU THU MẪU Số TT:…… Ngày thu mẫu: Họ tên người nuôi: Địa chỉ: Điện thoại: Loài cá: Tuổi hay cỡ cá: Trọng lượng (g): Chiều dài (cm): Chiều cao (cm): Kích thước ao: Dài (m): Rộng (m): Sâu (m): Kích thước bè: Dài (m): Rộng (m): Sâu (m): Số lượng cá thả ao hay bè: Mật độ cá thả (con/m2, con/m3): Ngày thả cá: Nguồn giống: Vệ sinh, cải tạo ao/bè (có/khơng): Hóa chất sử dụng, liều lượng: Vôi: Thuốc tím: Các loại khác: Loại thức ăn: Ngày mua thức ăn: Thức ăn tươi sống: % thức ăn/trọng lượng thể: Tần số cho ăn: Thức ăn chế biến: % thức ăn/trọng lượng thể: Tần số cho ăn: Nguồn nước: 29 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Chất lượng nước: Các tiêu môi trường: pH: NH4+: Độ kiềm: Màu nước ao hay bè: Có thay nước hay khơng: Thời gian thay nước: Ngày xuất bệnh: Số cá chết hàng ngày: Tăng/giảm: Ngày bắt đầu dung thuốc: Các loại thuốc sử dụng, liều lượng: Loại thuốc sử dụng có hiệu khơng: Người thu mẫu …… 30 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phụ lục Xác định tiêu (Theo cẩm nang Cowan Steel (Barrow Feltham, 1993)) Quan sát tính di động Sự di động vi khuẩn quan sát phương pháp giọt nước treo vật kính 40X Các bước thực sau: Giọt dung dịch vi khuẩn lame vaseline Cho Vaseline lên bốn góc lamelle đặt ngửa lamelle bàn Dùng que cấy tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle Tiệt trùng que cấy, lấy vi khuẩn cho lên lamelle hồ vào nước muối sinh lý Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước treo ngược lamelle Đặt lame lên kính hiển vi quan sát tính di động vi khuẩn vật kính 40X Nhuộm Gram Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ giọt nước cất lên lame, dùng que cấy nhặt vi khuẩn trãi lên giọt nước cất Để khô nhiệt độ phịng sau hơ lướt lame lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn lame Các bước nhuộm Gram: Nhuộm crystal violet khoảng phút Rửa nước cho hết màu tím lame (khoảng giây), để khơ nhiệt độ phịng Nhuộm iodine phút, rửa lame nước Rửa dung dịch 95% cồn: 5% aceton để tẩy màu cách nghiêng lame nhỏ từ từ dung dịch giọt nước cuối lame khơng cịn màu tím Rửa để khơ nhiệt độ phịng Nhuộm safranin khoảng phút Rửa để khơ nhiệt độ phịng Quan sát kính hiển vi vật kính 40X, vật kính 100X (có giọt dầu) Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh Vi khuẩn Gram âm (G-) có màu hồng đỏ 31 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phản ứng oxidase Sử dụng test Bactident Oxidase Dùng que cấy phết vi khuẩn lên giấy tâm cytochrome oxidase Vi khuẩn cho phản ứng oxidase (+) làm giấy chuyển sang màu tím tím đen vịng 60 giây ngược lại Phản ứng catalase Dung que cấy nhặt vi khuẩn lên lame, sau nhỏ lên vi khuẩn giọt H2O2 3% Vi khuẩn cho phản ứng catalase (+) gây tượng sủi bọt dung dịch H2O2 3% ngược lại Khả lên men oxy hố đường glucose (Fermentation/ oxidation: O/F) Mơi trường O/F (xem công thức pha chế nhãn) Đun khuấy cho tan hoàn toàn Tiệt trùng 121oC 15 phút, để nguội 45oC Thêm 1% glucose tiệt trùng Cho ml môi trường vào ống nghiệm Cấy vi khuẩn vào hai ống nghiệm có chứa mơi trường O/F Sau cho phủ 0.5-1 ml dầu paraffin tiệt trùng vào ống nghiệm để tạo thành điều kiện yếm khí ống nghiệm Để ủ tủ ấm 28oC Đọc kết sau 1-7 ngày Lên men (F) ống có phủ paraffin chuyển sang màu vàng Oxidation (O) ống không phủ paraffin chuyển sang màu vàng Không đổi hai ống có màu xanh xanh lơ 32 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phụ lục Bảng nồng độ thuốc dung dịch vi khuẩn cần pha Thể tích nước muối sinh lý (ml) Thể tích dd thuốc kháng sinh (ml) Thể tích dd vi khuẩn (ml) Nồng độ cuối (µg/ml) STT Nồng độ cần pha (µg/ml) 1024 25 (dd thuốc gốc 1) 3 512 512 25 (1024) 25 3 256 256 25 (512 µg/ml) 25 3 128 128 25 (dd thuốc gốc 2) 25 3 64 64 25 (128 µg/ml) 25 3 32 32 25 (64 µg/ml) 25 3 16 16 25 (32 µg/ml) 25 3 8 25 (16 µg/ml) 25 3 25 (8 µg/ml) 25 3 10 25 (4 µg/ml) 25 3 11 25 (2 µg/ml) 25 3 0,5 12 0,5 25 (1 µg/ml) 25 3 0,25 Thuốc kháng sinh (ml) 33 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ... nhân cần có nghiên cứu sâu chất kháng thuốc vi khuẩn Pseudomonas spp Tuy nhiên, khơng tìm thấy khác biệt tính kháng thuốc vi khuẩn Pseudomonas spp môi trường ao nuôi cá tra tỉnh Trà Vinh, Bến Tre. .. hưởng đến động vật nuôi người Sự kháng kháng sinh chủng Pseudomonas spp phân lập từ môi trường ao nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tỉnh Trà Vinh, Bến Tre Cần Thơ xác định, 30 chủng Pseudomonas. .. tỉnh Trà Vinh, Bến Tre Cần Thơ? ?? thực 1.2 Mục tiêu đề tài Đánh giá kháng thuốc nhóm vi khuẩn Pseudomonas spp mơi trường ao ni cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), để có cách nhìn sâu sắc thuốc kháng