Luận văn thạc sĩ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CON LAI SOMA KHOAI TÂY, ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VIRUS CỦA CHÚNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI    TRẦN VĂN GIÁP NGHIÊN CỨU XÁC ðỊNH CON LAI SOMA KHOAI TÂY, ðÁNH GIÁ ðẶC ðIỂM SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VIRUS CỦA CHÚNG LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI    TRẦN VĂN GIÁP NGHIÊN CỨU XÁC ðỊNH CON LAI SOMA KHOAI TÂY, ðÁNH GIÁ ðẶC ðIỂM SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU VIRUS CỦA CHÚNG LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 60.62.05 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Quang Thạch HÀ NỘI - 2011 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sư dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 08 năm 2011 Tác giả Trần Văn Giáp Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, trong quá trình thực hiện tôi ñã luôn nhận ñược sự quan tâm, chỉ bảo tận tình và chu ñáo của các thầy cô giáo, CBCNV trong khoa Nông học nói chung, Viện Sinh học nông nghiệp nói riêng. ðặc biệt tôi xin ñược bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch ñã giúp ñỡ tận tình, chu ñáo trong quá trình tôi thực tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Luận văn ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật của Viện Sinh học Nông nghiệp- Trường ñại học Nông nghiêp Hà nội. Tại ñây tôi ñã ñược tạo mọi ñiều kiện thuận lợi về trang thiết bị, hoá chất, các ñiều kiện cơ sở vật chất khác ñể học tập, nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp ñỡ quý báu ñó. Nhân dịp này, con xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Bố mẹ và gia ñình ñã nuôi dưỡng, dạy bảo và ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất cho con trong suốt những năm tháng học tập và tiến hành luận văn này. Cảm ơn tất cả các bạn bè thân thiết ñã cổ vũ, ñộng viên và giúp ñỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà nội, tháng 8 năm 2011 Tác giả Trần Văn Giáp Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN • AFLP-Amplified Fragment length polymorphism • BC (Back cross) • EBN-Endosperm balance number • FDA-flouresencein diacetate • ICTV–International Committee on Taxonomy of Viruses • PEG-polyethylen glycol • PLRV. Potato leafroll luteovirus PLRV • PVA .Potato A potyvirus • PVM. Potato M carlavirus • PVM. Potato M carlavirus • PVS. Potato S carlavirus • PVV. Potato V potyvirus • PVX .Potato X potexvirus • PVY.Potato Y potyvirus • SGAA-Steroidal Glycoalkaloid Aglycone • SSR-Simple Sequence Repeat Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Danh mục các từ viết tắt trong luận văn iii Mục lục iv Danh mục các bảng vi Danh mục các hình vii Danh mục các ñồ thị viii MỞ ðẦU 1 1.1. ðặt vấn ñề 1 1.2. Mục ñích và yêu cầu 2 1.2.1. Mục ñích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 3 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3 1.4 Giới hạn phạm vi nghiên cứu ñề tài 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1. Giới thiệu chung về cây khoai tây 5 2.1.1 Nguồn gốc 5 2.1.2 Phân loại 6 2.1.3 ðặc ñiểm thực vật học 7 2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước 9 2.2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới 9 2.2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam 12 2.3 Bệnh virus hại khoai tây và biện pháp khắc phục 13 2.3.1 Tìm hiểu về virus hại khoai tây 13 2.3.2 Tác hại của bệnh virus 15 2.3.3 Giải pháp khắc phục 17 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v 2.4 Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần 25 2.4.1. Nghiên cứu về tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần trên thế giới 25 2.4.2. Một số kết quả nghiên cứu dung hợp tế bào trần trên cây khoai tây ở Việt Nam 31 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1. ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 33 3.2 Nội dung nghiên cứu 35 3.3 Phương pháp nghiên cứu 36 3.4 Xử lý số liệu 44 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 4.1 Kết quả ñánh giá ñộ bội của các dòng cây tái sinh 45 4.2 Kết quả xác ñịnh con lai soma bằng phương pháp isozym 47 4.3 ðánh giá các ñặc tính kháng virus PVX, PVY của con lai soma bằng phương pháp chỉ thị phân tử 50 4.4 Kết quả ñánh giá khả năng sinh trưởng phát triển in vitro của con lai soma tái sinh ñược 55 4.5 ðánh giá khả năng hình thành củ in vitro của con lai soma 60 4.6 ðánh giá khả năng sinh trưởng phát triển, hình thành năng suất của con lai soma trong ñiều kiện in vivo 64 4.7 Một số chỉ tiêu hóa sinh ñánh giá chất lượng củ dòng 76, 79 và bố mẹ 76 4.8 ðánh giá khả năng kháng virus PVY thông qua phương pháp lây nhiễm nhân tạo và test ELISA 77 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 84 5.1. Kết luận 84 5.2. ðề nghị 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây trên thế giới năm 2007 ……………………………………………………………… 10 Bảng 2.2 Sản lượng khoai tây trên thế giới giai ñoạn 1991 – 2007 11 Bảng 2.3 Nhóm virus chính hại khoai tây 14 Bảng 2.4 Tổng hợp nghiên cứu dung hợp protoplast trên cây khoai tây 30 Bảng 4.1 Kết quả ñặc tính kháng virus PVX, PVY của các dòng bố mẹ và con lai của chúng 54 Bảng 4.2 Chiều cao, số lá trung bình của dòng 81-2 và bố mẹ 55 Bảng 4.3 Chiều cao, số lá trung bình của dòng 76, 79 và bố mẹ 57 Bảng 4.4 Chiều cao, số lá trung bình của dòng 21-1 và bố mẹ 58 Bảng 4.5 Số liệu hình thành củ của con lai soma và bố mẹ 61 Bảng 4.6 Chiều cao, số lá trung bình của dòng 81-2 và bố mẹ chúng 65 Bảng 4.7 Chiều cao, số lá trung bình dòng 76, 79 và bố mẹ 66 Bảng 4.8 Chiều cao, số lá trung bình dòng 21-1 và bố mẹ 68 Bảng 4.9 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng khảo sát 70 Bảng 4.10 Phân loại cấp củ sau thu hoạch 73 Bảng 4.11 ðặc ñiểm hình thái củ 74 Bảng 4.12 Các chỉ tiêu hóa sinh 76 Bảng 4.13 Kết quả test ELISA virus PVX trước khi lây nhiễm nhân tạo 79 Bảng 4.14 Vị trí các dòng khoai tây in vitro trong bản test ELISA PVX 79 Bảng 4.15 Kết quả test ELISA virus PVY trước khi lây nhiễm nhân tạo 80 Bảng 4.16 Vị trí các dòng khoai tây in vitro trong bản test ELISA PVY 81 Bảng 4.17 Kết quả test ELISA sau khi lây nhiễm virus PVY 82 Bảng 4.18 Vị trí các dòng khoai tây trong bản test ELISA PVY 83 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1 Kết quả xác ñịnh ñội bội của mẫu nhị bội A15 46 Hình 4.2 Kết quả ñộ bội của các dòng con lai 46 Hình 4.3 Kết quả ñiện di isozym esterase của tổ hợp lai A16 và B186 48 Hình 4.4 Kết quả ñiện di isozym esterase của tổ hợp lai A15 và A41 49 Hình 4.5 Kết quả ñiện di isozym esterase của tổ hợp lai B186 và B208 50 Hình 4.6 Kết quả ñiện di PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu GM 339 52 Hình 4.7 Kết quả ñiện di PCR sử dụng cặp mồi ñặc hiệu STM 003-111 53 Hình 4.8 Minh họa hình ảnh dòng 81-2 và bố mẹ trong in vitro 56 Hình 4.9 Minh họa dòng 76, 79 và bố mẹ in vitro 58 Hình 4.10 Minh họa dòng 21-1 và bố mẹ in vitro 59 Hình 4.11 Minh họa củ dòng 76, 79 và bố mẹ chúng 62 Hình 4.12 Minh họa củ dòng 21-1 và bố mẹ chúng 63 Hình 4.13 Minh họa củ dòng 81-2 và bố mẹ chúng 64 Hình 4.14 Con lai soma 81-2 và bố mẹ chúng (in vivo) 66 Hình 4.15 Dòng 76, 79 và bố mẹ chúng (in vivo) 67 Hình 4.16 Dòng 21-1 và bố mẹ (in vivo) 69 Hình 4.17 Hình ảnh củ của sau thu hoạch của các con lai 72 Hình 4.18 Củ của bố mẹ và các con lai trong ñiều kiện chậu vại 75 Hình 4.19 Hình ảnh test ELISA virus PVX của các dòng khoai tây 80 Hình 4.20 Hình ảnh test ELISA virus PVY trước lây nhiễm nhân tạo 81 Hình 4.21 Hình ảnh test ELISA virus PVY sau lây nhiễm nhân tạo 84 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… viii DANH MỤC CÁC ðỒ THỊ ðồ thị 4.1 Chiều cao, số lá trung bình của dòng 81-2 và bố mẹ 56 ðồ thị 4.2 Chiều cao, số lá trung bình dòng 76, 79 và bố mẹ 57 ðồ thị 4.3 Chiều cao, số lá trung bình dòng 21-1 và bố mẹ 59 ðồ thị 4.4 Chiều cao, số lá trung bình dòng 81-2 và bố mẹ (in vivo) 65 ðồ thị 4.5 Chiều cao, số lá trung bình dòng 76, 79 và bố mẹ (in vivo) 67 ðồ thị 4.6 Chiều cao, số lá trung bình dòng 21-1 và bố mẹ (in vivo) 68 ðồ thị 4.7 Biểu ñồ thể hiện tỷ lệ các cấp củ 74 [...]... l cỏc dũng khoai tõy b m cú cỏc ủ c tớnh khỏng virus PVX, PVY cú ngu n g c t o CHLB c, cỏc con lai soma ủó ủ c t o ra t i Vi n Sinh h c Nụng nghi p Trong ph m vi ủ ti ny, chỳng tụi ch ti n hnh ủỏnh giỏ cỏc ủ c ủi m sinh tr ng phỏt tri n c a con lai soma so v i b m chỳng m cha cú ủi u ki n ủ so sỏnh v i cỏc dũng, gi ng khoai tõy tr ng tr t ph bi n - ti nh m nghiờn c u xỏc ủ nh con lai soma ủó ủ c... xỏc ủ nh con lai soma Tr ng i h c Nụng Nghi p H N i Lu n vn th c s khoa h c nụng nghi p 2 - Xỏc ủ nh ủ c ủ b i con lai thụng qua phng phỏp Flow Cytometry - Xỏc ủ nh con lai b ng k thu t Iso enzym + ỏnh giỏ con lai - ỏnh giỏ kh nng sinh tr ng, phỏt tri n, t o c in vitro - ỏnh giỏ kh nng sinh tr ng, phỏt tri n, hỡnh thnh nng su t ủ ng ru ng - ỏnh giỏ cỏc ch tiờu húa sinh - ỏnh giỏ kh nng khỏng virus. .. giỏ kh nng khỏng virus PVY c a con lai soma, cỏc dũng b m b ng phng phỏp lõy nhi m nhõn t o v test ELISA - ỏnh giỏ kh nng khỏng virus (PVX, PVY) c a con lai soma, cỏc dũng b m b ng phng phỏp ch th phõn t 1.3 í ngha khoa h c v th c ti n c a ủ ti 1.3.1 í ngha khoa h c Vi c nghiờn c u xỏc ủ nh chớnh xỏc con lai soma, v ủỏnh giỏ cỏc ủ c ủi m nụng sinh h c, tớnh ch ng ch u virus ủ ch n l c ra cỏc dũng tri... tỏi sinh con lai sau dung h p, xỏc ủ nh con lai b ng phng phỏp isoenzyme ủỏnh giỏ tớnh khỏng virus PLRV (Potato Leaf Roll Virus) Sau ủú, Naoto Kadotani v Keisuke Kasaoka (2004)(38) cng thnh cụng trong nghiờn c u v dung h p xung ủi n gi a Solanum.tuberosum cv May Queen v S etuberosum, tr i qua cỏc b c tỏi sinh, xỏc ủ nh con lai theo phng phỏp RFLPs , ủỏnh giỏ tớnh khỏng virus, cu i cựng t o cõy lai. .. 1992)(53)(40) Tựy thu c vo thnh ph n gen c a con lai soma m bi u hi n m t s cỏc bi n ủ i v tớnh tr ng hỡnh thỏi v ph n ng l i s xõm nhi m virus PVX b i vector (Thieme et al, 2000)(45) M t s con lai soma ủ c lai l i thnh cụng v i dũng khoai tõy tr ng m v n bi u hi n tớnh khỏng (Willliams et al, 1992; Helges et al, 1993; Thieme et al, 2000)(45) Hng lo t con lai soma c a S etuberosum v S tuberosum v dũng... cùng l dung hợp tế b o trần hai tế b o thể diploid đ chọn lọc để tạo giống khoai tây mong muốn Sau quá trình dung hợp việc xác định thể lai v tái sinh các thể lai có ý nghĩa n y th nh cây ho n chỉnh từ đó nhân th nh giống mới có khả năng kháng virus Trờn th gi i cú khỏ nhi u cụng trỡnh nghiờn c u v t o gi ng khoai tõy khỏng virus b ng dung h p t bo tr n N.Fish, A.Karp and M,G.K.Jones (1988)(40) nghiờn... húa sinh l c c k quan tr ng v c p thi t V i t t th y nh ng m c ủớch ủú, chỳng tụi th c hi n lu n vn: Nghiờn c u xỏc ủ nh con lai soma khoai tõy, ủỏnh giỏ ủ c ủi m sinh tr ng v kh nng ch ng ch u virus c a chỳng 1.2 M c ủớch v yờu c u 1.2.1 M c ủớch Xỏc ủ nh ủ c con lai soma sau dung h p, ủỏnh giỏ cỏc ủ c tớnh cú l i theo tớnh tr ng mong mu n, nh m ch n l c cỏc dũng ủ phỏt tri n thnh gi ng khỏng virus. .. v b nh h i, bi u hi n tớnh r t khỏng v i virus PVY, tớnh khỏng cao v i n m Phytopthera infestans Khi ủú ti n hnh lai soma v i m t s dũng khoai tõy tr ng thu c loi S tuberosum ủ t o th lai m i k th a tớnh khỏng t dũng khoai tõy d i S tarnii Trong s cỏc phng phỏp t o gi ng khoai tõy khỏng virus thỡ phng phỏp lai soma cú nhi u u ủi m v hi u qu hn c V phng phỏp lai h u tớnh g p nhi u khú khn v m t di truy... các giống khoai tây ở nớc ta đều cho năng suất thấp v phẩm chất kém dần, nguyên nhân chủ yếu l do thoái hoá giống với hai tác nhân l virus v sự gi hoá của giống Khắc phục đợc hiện tợng n y sẽ góp phần phát triển nền sản xuất khoai tây ở nớc ta Các phơng pháp chọn tạo giống khoai tây truyền thống chủ yếu nhờ v o kỹ thuật lai tạo vấp phải những khó khăn về mặt di truyền cũng nh việc chọn tạo sau lai Chính... dũng virus PVY Hi n nay n c ta, vi c nghiờn c u v dung h p t bo tr n v cỏc ng d ng c a nú m i ch d ng l i b c ủ u nghiờn c u quy trỡnh tỏch, nuụi c y, dung h p, t o micro callus v macro callus, b c ủ u tỏi sinh ủ c cõy hon ch nh hon thi n quỏ trỡnh nghiờn c u con lai soma sau dung h p, t o gi ng khoai tõy khỏng b nh virus b ng k thu t trờn thỡ vi c nghiờn c u xỏc ủ nh con lai, ủỏnh giỏ cỏc ch tiờu sinh