phương pháp chỉ thị phân tử
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 51
hợp các ựặc tắnh tốt của bố mẹ, cụ thể ở nghiên cứu này các ựặc tắnh ựó là tắnh kháng virus PVX và PVỴ Vì thế, cần tiến hành kiểm tra sự có mặt hay hiện diện của các gen kháng này trong các con lai soma bằng phương pháp chỉ thị phân tử.
4.3.1 Kết quả ựánh giá ựặc tắnh kháng virus PVX, PVY của con lai soma
Trong genom khoai tây người ta ựã phát hiện có một số loại gen có khả năng kháng lại bệnh virus Y, ựó là loài S. stolonierum có chứa gen Rysto, Ry- sto
na , Rysto
rns; loài S. tuberosum spp.Andigena có chứa Ryadg; loài S. demisum
có chứa gen Nydms; loài S. hougasi có chứa gen Ryhou ... (Wang Di Zang Ning Si Huaijum (2004)(57). Trong các gen kháng PVY, gen Rysto là một gen có nguồn gốc từ loài S. stoloniferum cho khả năng kháng rất cao ựối với tất cả các chủng PVỴ Hơn nữa không chỉ kháng PVY mà gen Rysto còn cho phép các dòng, giống khoai tây chứa nó kháng ựược một số loại virus khác nữa như PVA, PVV. Vì vậy gen này ựược các nhà nghiên cứu ựặc biệt quan tâm.
Ye-Su Song và cộng sự (2005)(59) ựã sử dụng 12 mồi AFLP và phân tắch trên 106 mẫu giống khoai tây có nguồn gốc từ đức, Hà Lan, Ba Lan ựể ựịnh vị gen Rysto và kết luận locus của gen Rysto nằm ở trên nhiễm sắc thể XII và ựược phát hiện bởi mồi SSR STM0003 Ờ 111. Mồi STM 003 - 111 nhân ựoạn DNA có kắch thước 111bp cùng nằm trên NST XII và liên kết rất chặt với gen Rysto.
Tắnh kháng virus do một số gen quy ựịnh, trong ựó gen Nb có khả năng kháng cao với các chủng PVX thuộc nhóm 1 (chủng PVX ROTH1), nhóm 2 (chủng PVY CP2). Marano và cộng sự (2002)(33) ựã xác ựịnh ựược vị trắ của gen Nb nằm trên NST số V, giữa 2 marker AFLP GM339, GM637. Marker GM339 nhân ựoạn DNA có kắch thước 330bp liên kết rất chặt với gen Nb.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 52
phát hiện ra gen kháng virus PVX, mồi STM0003-111 ựể phát hiện ra gen kháng virus PVỴ
4.3.2 Kết quả chiết tách và ựiện di kiểm tra DNA tổng số
Chúng tôi sử dụng nguyên liệu tách chiết DNA là mẫu lá in vitro của các dòng con lai soma và bố mẹ. Sau bước tách chiết DNA chúng tôi tiến hành kiểm tra ựộ tinh sạch sản phẩm tách chiết trên gel agarose 1%. Sản phẩm ựiện di DNA tổng số ựạt yêu cầu thì tiến hành phản ứng PCR nhằm hạn chế sự bắt cặp linh tinh với nhiều ựoạn khác nhaụ
4.3.3 Kết quả phản ứng PCR
Kết quả phản ứng PCR ựược thể hiện ở sự xuất hiện các băng ADN trên bản gel ựiện dị Mỗi ựoạn ADN ựược nhân lên sẽ cho 1 vạch có vị trắ nhất ựịnh trên bản gel.
Trong phần thắ nghiệm kiểm tra gen kháng virus PVX của các dòng lai tái sinh, chúng tôi sử dụng cặp mồi GM3339 nhân ựoạn DNA có kắch thước 330bp liên kết rất chặt với gen Nb (Marano và cộng sự (2002)(33).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 53
Hình 4.6 Kết quả ựiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ựặc hiệu GM339
Qua kết quả trên nhận thấy rằng: Sản phẩm phản ứng PCR ở tất cả các dòng bố mẹ (trừ dòng A16) và con lai ựều tạo ra một vạch DNA rõ nét có cùng kắch thước, ựối chiếu với vạch băng chuẩn Leader 100bp chúng tôi nhận thấy kắch thước của sản phẩm PCR xấp xỉ 300bp, ựúng với kắch thước của ựoạn DNA liên kết chặt với gen Nb-gen kháng virus PVX. Vì vậy khẳng ựịnh những dòng lai trên mang ựặc tắnh kháng virus PVX thừa hưởng từ bố mẹ dung hợp. Trường hợp riêng con lai 81-2 giữa A16 và B186 nhận gen kháng virus PVX chỉ từ dòng bố B186, dòng A16 không mang gen kháng Nb.
Mục tiêu của dung hợp tế bào trần là tạo con lai soma mang ựặc tắnh kháng cả hai loại virus PVX và PVY ựược tổ hợp từ bố mẹ. Sau khi ựã kiểm tra các dòng lai tái sinh ựều mang gen Nb-gen kháng virus PVX, chúng tôi tiếp tục tiến hành kiểm tra tắnh kháng virus PVY của chúng.
để kiểm tra sự có mặt của gen kháng virus PVY ở các dòng lai tái sinh trên, chúng tôi sử dụng cặp mồi STM 003-111 nhân ựoạn DNA có kắch thước 111bp nằm trên NST XII và liên kết rất chặt với gen Rysto-gen kháng virus PVY(Ye-Su Song và cs (2005)(59).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 54
Hình 4.7 Kết quả ựiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi STM 003 -111
Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi STM 003-111 tạo ra sản phẩm có nhiều vạch với các kắch thước khác nhaụ Trong ựó thấy tất cả các dòng bố mẹ (trừ dòng A15) và con lai ựều xuất hiện ựoạn DNA nhân lên với kắch thước khoảng 100bp, ựúng như kắch thước của ựoạn DNA liên kết chặt với gen Rysto - gen kháng virus PVY (ở ựây dòng A15 ựã ựược kiểm tra không mang gen kháng virus PVY). Vì vậy khẳng ựịnh những dòng lai trên mang ựặc tắnh kháng virus PVY thừa hưởng từ bố mẹ. Trường hợp con lai 76, 79 giữa A15 và A41 nhận gen kháng virus PVY chỉ từ dòng bố A41, dòng mẹ A15 không mang gen kháng
Rysto.
Từ ựó cho thấy tất cả các con lai soma trên ựều mang cả hai gen kháng: Gen Nb-gen kháng virus PVX và gen Rysto - gen kháng virus PVỴ đặc tắnh kháng virus này ựược tổ hợp từ hai bố mẹ dung hợp. Kết quả này khẳng ựịnh con lai soma tạo ra bằng dung hợp tế bào trần hoàn toàn có thể tổ hợp ựược gen kháng virus từ cả hai bố mẹ.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 55
Bảng 4.1 Kết quả ựặc tắnh kháng virus PVX, PVY của các dòng bố mẹ và con lai soma của chúng
Dòng Mang gen kháng virus PVX (gen Nb)
Mang gen kháng virus PVY (gen Rysto) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
A15 + - A16 - + A41 + + B186 + + B208 + + 76 + + 79 + + 21-1 + + 82-2 + + Chú thắch: (+) Có gen kháng (-) Không có gen kháng