trần trên thế giới
Thật là lý tưởng cho công cuộc chống thoái hoá khoai tây do virus gây ra nếu con người chọn tạo ra các giống có khả năng chống virus. Chắnh vì thế
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 26
các nghiên cứu tạo giống chống chịu virus ựã ựược tiến hành gần một thế kỷ naỵ Từ lâu công việc ựó ựã thu ựược kết quả ựối với virus A và X. Do vì việc phòng chống các mô giới truyền bệnh Ờ rệp gặp khó khăn, nên các nghiên cứu tập trung vào việc tạo ra các giống chống chịu virus Y và virus cuốn lá ( PLRV). đây là hai virus ựược truyền vào cây qua rệp. Quá trình chọn tạo giống khoai tây Slanum tuberosum L bằng các phương pháp kinh ựiển như lai tạo, ựột biến, chọn lọc. Vấp phải những khó khăn về mặt di truyền. Trên cơ sở bộ genom tứ bội (tetraploid) (2n=4x=48 NST) tạo ra tỷ lệ phân li lớn sau lai tạo, khiến quá trình chọn lọc sau ựấy rất khó khăn với một quần thể rất lớn. Quá trình tạo một giống mới tốn rất nhiều công sức và thời gian. Tối thiểu phải trên 10 năm ựể ra ựời một giống mớị Mặt khác, các ựặc tắnh di truyền ựa gen cần ựược chuyển nạp khi lai tạo giữa các dòng hoang dại và dòng trồng trọt thường bị thất thoát nhiều, thậm chắ mất hẳn qua quá trình giảm phân của các thế hệ con cháụ Ngay từ 1963, Chase ựã ựề nghị một sơ ựồ tạo giống khoai tây, dựa trên khả năng giảm mức bội thể xuống nhị bội (diploid). Khoai tây nhị bội(2n=2x=24 NST) có thể thu ựược qua kỹ thuật nuôi cấy bao phấn từ các dòng tứ bộị Thể nhị bội này cũng có thể thu ựược theo con ựường mẫu sinh (Parthenogenese) khi lai khoai tây tứ bội với khoai tây dại Solanum phureja. Việc ựưa các thể nhị bội vào công tác giống khoai tây ựã làm ựơn giản hoá tỷ lệ phân ly sau lai tạọ Hơn nữa nhờ có kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn từ các dòng nhị bội này lại có thể thu ựược các dòng ựơn bội (monohaploid 1n=1x=12 NST). Thể ựơn bội này sau khi nhân ựôi nhiễm sắc thể sẽ trở thành nhị bội ựồng hợp tử. Những vật liệu nhị bội ựồng hợp tử này là những vật liệu khởi ựầu rất quan trọng cho việc tạo giống chống chịụ
Tuy nhiên chọn tạo giống trên cơ sở những dòng nhị bội này gặp phải hai khó khăn chắnh :
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 27
+ Khi trở lại dạng trồng trọt (tứ bội ) bằng cách nhân ựôi một cách ựơn giản các thể nhị bội này, sẽ làm giảm ựộ heterozygote, dẫn ựến giảm sức sống và giảm năng suất của cây tứ bội tạo ra (Nguyễn Quang Thạch, 1993)(10).
Hầu hết khoai tây trồng hiện nay thuộc nhóm cây tứ bội (2n=4x=48), do ựó muốn dung hợp ở mức nhị bội cần giảm ựộ bội xuống trước khi tiến hành lai soma bằng kỹ thuật nuôi cây bao phấn.
Sơ ựồ tạo giống khoai tây sử dụng tổng hợp kỹ thuật: Lai tạo, nuôi cấy bao phấn (nuôi cấy hạt phấn), nhị bội hóa và dung hợp tế bào trần. (Wenzzel et al 1976)(58).
Các dòng tứ bội khởi ựầu (4x )
Sự ra ựời của sơ ựồ tạo giống tổng hợp phân tắch của Wenzel et al (1979)(58) là bước ngoặt phối hợp trong việc sử dụng phối hợp các phương pháp kinh ựiển và hiện ựại vào công tác giống khoai tâỵ Bước cuối cùng của
a*1a2a3a4 a1a*2a3a4 a1a2 a*3a4 a1a2a3 a*4
Tạo dòng nhị bội nhờ kỹ thuật parthenogen etic
a*1a a*2a a*3a a*4a
Chọn lọc (2x)
Tạo dòng ựơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn Ờ nhị bội hóa tạo 2x
a*1a*1 a*2a*2 a*3a*3 a*4a*4
Chọn lọc (2x) x x
a*1a*2 (+) a*3a*4
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 28
sơ ựồ tạo giống này là sự dung hợp của hai tế bào trần nhị bội (2x) ựể tạo con lai soma tứ bội (4x). Thể tứ bội này có thể ựược nhân vô tắnh và trở thành một giống ổn ựịnh (Diemling, 1989). Mặt khác thông qua dung hợp tế bào trần hàng rào lai tạo giữa các cây xa nhau về mặt di truyền cũng ựược khắc phục.
Việc nghiên cứu tái sinh tế bào trần khoai tây ựược rất nhiều tác giả quan tâm (Binding và Nehls, 1977; Binding et al, 1978; Bokemaln và Roest, 1983; Schuchman, 1985). Theo hướng giáo sư Wenzel ựã ựề xuất , các công trình nghiên cứu về dung hợp tế bào trần cũng dần ựược tăng lên. Công trình nổi tiếng của Melchers et al (1978) về lai soma giữa loài khoai tây S. tuberosum và cà chua lycopersicom esculentum là một mở ựầu về hàng loạt các nghiên cứu về dung hợp giữa loài khoai tây dại với khoai tây trồng vốn không thể tiến hành bằng con ựường lai hữu tắnh. Butenko và Kuchko (1980) (16) ựã tiến hành dung hợp tế bào trần S. tuberosum với S. chacoense mang ựặ tắnh kháng virus PLRV (Browwn và Thomas ,1979) tạo con lai soma mang ựặc tắnh rất kháng với dòng virus PLRV. Nhiều tác giả (Barsby et al, 1984; Austin et al, 1985; Helgeson et al, 1986; Fish et al, 1987)(40) ựã tập trung nghiên cứu sử sụng S. brevidens như một ỢpartnerỢ nghiên cứu vì giống này chống chịu với rất tốt với virus PVX và PVỴ Khi ựó các ông tiến hành lai soma giữa S. brevidens với loài khoai tây trồng S. tuberosum nhằm tạo con lai mang ựặc tắnh kháng hai loại virus ựó.
Việc xác ựịnh các con lai soma hetezygote là rất cần thiết sau dung hợp tế bào trần. Trước tiên cần xác ựịnh ựộ bội của các thể lai, tiếp ựó bằng các phương pháp di truyền như AFLP, RAPD, RELP, PCR, IsozymẦ có thể xác ựịnh chắnh xác con lai soma hetezygote tổ hợp bộ genome của cả bố và mẹ dung hợp. Ngoài ra, ựể xác ựịnh con lai soma, một số tác giả ựề xuất và nghiên cứu thành phần, hàm lượng alkaloid trong cây laị
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 29
Nghiên cứu của Pehu et al (1990) về dung hợp protoplast giữa S. tuberosum và S. brevidens ựã tạo con lai soma thành công. để xác ựịnh con lai soma ông tiến hành phân tắch thành phần SGAA (Steroidal Glycoalkaloid Aglycone) của cây laị Kết quả cho thấy các thành phần alkaloid của bố mẹ bao gồm solanidine và slanthrene của S. tuberosum, tomatidine của S. brevidens (Laurila et al 1996) ựều có mặt trong cây laị So sánh với bố mẹ, cho biết thành phần SGAA trong cây lai cao hơn so với S. tuberosum nhưng hàm lượng thấp vào khoảng 20 mg/100g tươị
N.Q.Thach, Ụ Frei và G. Wenzel (1993)(42) ựã tạo thành công con lai soma mang ựặc tắnh kháng virus giữa các nhóm khoai tây thuộc loài Solanum tuberosum L, xác ựịnh con lai soma bước ựầu ựánh giá ựộ bội bằng phương pháp ựếm nhiễm sắc thể, sau ựó tiến hành phấn tắch isozym esterase và peroxidase (Deimling et al. 1988), kỹ thuật RFLP (Enzyme cắt là EcoRI). Kết quả cho thấy các con lai ựều có sự biểu hiện của 2 allele trội ựơn gen Rx và Ry từ bố mẹ dung hợp (partners).
Với tổ hợp lai ựiển hình giữa S. tarnii (2n=2x=24) và S. etuberosum cv. Delikat ựã ựược dung hợp xung ựiện thành công. Con lai soma tạo thành ựược xác ựịnh ựộ bội bằng máy Flow Cytometry, xác nhận con lai soma hetezygote bằng kỹ thuật SSR, chỉ thị AFLP và phân tắch ựa hình isozym. Những cây lai soma ựều biểu hiện tắnh rất kháng với dòng virus PVY và kháng nấm P. infestans rất tốt qua phản ứng siêu nhạy (HR-hypersensitive reaction). Thế hệ BC1 và BC2 cũng biểu hiện tắnh kháng virus và kháng nấm cao, không những vậy tắnh kháng này rất bền vững ở cả con lai và thế hệ BC (Ramona Thieme; Elena RakosyỜTican; Tatjana Gavrilenko; Thomas Thieme 2007)(45).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 30
Bảng 2.4 Tổng hợp nghiên cứu dung hợp protoplast trên cây khoai tây
Các kiểu dung hợp Lý do dung hợp Tác giả
Tổ hợp ựặc tắnh tốt, trưởng thành muộn, sản lượng cao
Waara et al. 1992(56)
Tổ hợp gen kháng Rx và Ry trong thể lai soma tứ bội
Thach et al. 1993(10) Tổ hợp tắnh chất sản lượng cao và hình dạng củ ựẹp cùng với tắnh kháng tuyến trùng có khả năng kết bào xác Cooper-Bland et al. 1994 Solanum. tuberosum dihaploid + Solanum. tuberosum dihaploid
Tạo thể lai dị nhân tứ bội Austin et al. 1985b, Warra et al. 1989, Karlsson and Eriksson 1988, Chaput et al. 1990....(56) Solanum. tuberosum dihaploid + S. brevidens dihaploid
Chuyển gen kháng bệnh thối mềm củ khoai tây do nấm Erwinia vào quỹ gen của khoai tây Austin et al. 1996 S. tuberosum ừ Berthaultii hybrid diploid + S. Etuberosum dihaploid Chuyển gen kháng bệnh virus PVY vào quỹ gen của khoai tây
Novy and Helgeson 1994(39)
S. tuberosum dihaploid + S. brevidens dihaploid
Chuyển gen kháng bệnh virus PRLV sang quỹ gen của khoai tây trồng
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 31
S. tuberosum dihaploid + S. brevidens dihaploid
Chuyển gen kháng bệnh virus PRLV tới quỹ gen của khoai tây trồng
Fish and Jones. 1988(40)
S. tuberosum + S. nigrum Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ atrazine sang quỹ gen của khoai tây
Binding et al.1982
S. tuberosum +
Lycopersicon esculentum diploid
Tạo thể lai soma giữa khoai tây và cà chua
Jacobsen et al. 1992
S. tuberosum tetraploid + S. phureja diploid
Nghiên cứu sự ựào thải nhiễm sắc thể trong thể lai soma
Pijnacker et al. 1987
S. tuberosum dihaploid + Nicotiana plumbaginifolia
Nghiên cứu sự mất nhiễm sắc thể trong thể lai soma
Gilissen et al. 1992
2.4.2 Một số kết quả nghiên cứu dung hợp tế bào trên trên cây khoai tây ở Việt Nam
Cùng với những tiến bộ và thành tựu ựạt ựược của thế giới trong nghiên cứu cải tạo giống cây trồng bằng dung hợp tế bào trần, Việt Nam ựang dần kế thừa và bắt ựầu nghiên cứu kỹ thuật dung hợp tế bào trần tạo giống khoai tây kháng virus và bệnh cũng như một số sâu hại nguy hiểm khác.
Trên ựối tượng cây khoai tây, ựã cải tạo nguồn gen của một số dòng khoai tây trồng, loại bỏ hoàn toàn bệnh virus của một số dòng khoai tây như KT2, giống khoai tây Thường Tắn (Ackersegen)Ầbằng việc ứng dụng công nghệ sinh học thực vật gồm các kỹ thuật nuôi cấy mô (nuôi cấy meristemẦ) và các kỹ thuật phân tử khác.
Nghiên cứu dung hợp tế bào trần cây khoai tây còn rất mới mẻ và ựang ựược tiến hành khá thành công tại Viện Sinh Học Nông Nghiệp Ờ Trường đại
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 32
học Nông nghiệp Hà Nội do GS.TS Nguyễn Quang Thạch và TS. Nguyễn Phương Thảo chủ trì ựề tài ỘTạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng dung hợp tế bào trầnỢ giai ựoạn 2006 Ờ 2011. Nghiên cứu ựã bước ựầu thành công ở quy trình tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh protoplast của các dòng khoai tây nhị bội phục vụ cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus. Quá trình nghiên cứu hứa hẹn nhiều thành công và góp phần cải tạo nguồn gen khoai tây trồng, phát triển sản xuất khoai tây giống sạch bệnh virus.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 33
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 đối tượng, vật liệu, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1 đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu trên 9 dòng khoai tây gồm các dòng bố mẹ (nguồn gốc tại Bayer - CHLB đức) và các con lai soma ựược tạo ra sau dung hợp tế bào trần tại Viện sinh học Nông nghiệp Ờ Trường đại học Nông nghiệp Hà nộị
Tên dòng bố mẹ Tên dòng con lai
A15 76 (A15 (+) A41)
A41 79 (A15 (+) A41)
A16 21-1 (B186 (+) B208)
B186 81-2 (A16 (+) B186)
B208 Trong ựó:
Dòng 76 và 79 là con lai soma giữa hai dòng A15 và A41 Dòng 81-2 là con lai soma giữa hai dòng A16 và B186 Dòng 21-1 là con lai soma giữa hai dòng B186 và B208 đặc tắnh kháng virus của các dòng bố mẹ như sau:
Dòng Gen kháng virus X (PVX) Gen kháng virus Y (PVY)
A15 + - A16 - + A41 + + B186 + + B208 + + Chú thắch: (+): Có gen kháng (-): Không có gen kháng
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 34
3.1.2 Vật liệu nghiên cứu
- Các dòng lai ở dạng cây in vitro nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản, với quang chu kỳ chiếu sáng 16h/ngày, nhiệt ựộ phòng nuôi 18 - 22oC. Các dòng bố mẹ cũng ựược nuôi cấy trong ựiều kiện tương tự ựể làm vật liệu ựối chứng cho các con lai somạ
- Cây khoai tây bị nhiễm virus ngoài ựồng ruộng - Cây chỉ thị: cây thuốc lá
3.1.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng cho nghiên cứu
- Hóa chất nuôi cấy mô (phụ lục 1)
- Hóa chất dùng chiết tách DNA (phụ lục 2) - Hóa chất dùng chiết isozyme (phụ lục 3) - Thành phần cho phản ứng PCR (phụ lục 4) - Thành phần cho kỹ thuật ựiện di (phụ lục 5)
- Hóa chất dùng cho lây nhiễm virus PVY (phụ lục 6) - Hóa chất dùng cho test ELISA (phụ lục 7)
- Các dụng cụ và máy móc cần thiết cho các thắ nghiệm: Cối xứ, pipet, cân vi lượng, máy ựiện di, máy PCR, máy ly tâm, máy xung ựiện...
3.1.4 địa ựiểm
đề tài ựược tiến hành tại phòng Công nghệ sinh học khoai tây, vườn thực nghiệm thuộc Viện sinh học nông nghiệp (IAB) Ờ Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nộị
3.1.5 Thời gian
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 35
3.2 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Xác ựịnh con lai soma trong phòng thắ nghiệm
3.2.1 đánh giá ựộ bội bằng phương pháp Flow Cytometry
3.2.2 Xác ựịnh con lai bằng phương pháp Iso enzym
Nội dung 2: đánh giá ựặc tắnh kháng virus PVX, PVY của con lai soma bằng phương pháp chỉ thị phân tử.
3.2.3 đánh giá tắnh kháng virus PVX, PVY thông qua chỉ thị phân tử
Nội dung 3: đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển và hình thành củ trong in vitro của con lai soma.
3.2.4 đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của con lại soma trong ựiều kiện in vitro
3.2.5 đánh giá khả năng hình thành củ in vitro của con lai soma
Nội dung 4: đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất con lai soma trong ựiều kiện in vivo
3.2.6 đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của con lai trong chậu vại
3.2.7 đánh giá khả năng hình thành năng suất của con lai trong chậu vại
Nội dung 5: đánh giá các chỉ tiêu hóa sinh dòng 76, 79 và bố mẹ.
3.2.8 định lượng ựường khử, ựường tổng số, vitamin CẦ
Nội dung 6: đánh giá khả năng kháng virus PVY thông qua lây nhiễm nhân tạo, test ELISA
3.2.9 đánh giá khả năng kháng virus PVY qua lây nhiễm nhân tạo và test ELISA
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 36
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp ựánh giá ựộ bội bằng phương pháp ựịnh lượng DNA nhân nhờ sử dụng máy Flow Cytometry
Quy trình ựánh giá mức ựa bội của tế bào thực vật (phụ lục 8)
3.3.2 Phương pháp xác ựịnh con lai soma hetezygote bằng isozym
Từ kết quả ựánh giá ựộ bội thông qua máy Flow cytometry chúng ta sẽ lọc ựược những dòng tứ bộị Tuy nhiên không phải tất cả các dòng tứ bội ựó ựều là con lai dị nhân (hetezygous) do vậy ựể tìm ra ựâu là con lai dị nhân cần tiến hành theo nhiều phương pháp khác nhaụ Trong phạm vi ựề tài này chúng tôi tiến hành xác ựịnh con lai soma hetezygous theo phương pháp isozym với hệ enzym esterasẹ.
Chuẩn bị mẫu:
Sử dụng mẫu lá từ cây in vitro sau khoảng 3 tuần tuổi, cân khoảng 200 - 300 mg mẫu cho vào cối sứ, bổ sung ựệm nghiền theo tỷ lệ 1:1, tiến hành nghiền ựều cho tới khi ựồng nhất (chú ý: dụng cụ, hóa chất và quá trình nghiền mẫu ựược giữ ở ựiều kiện lạnh). Sau ựó ựưa toàn bộ dịch mẫu vào ống eppendof, ựem ly tâm mẫu 2 lần ở 12000 rpm trong ựiều kiện lạnh (40C). Ly tâm lần 1 trong 10 phút sau ựó dùng pipet hút dịch trong phắa trên ựưa sang ống eppendof mới ựem ly tâm lần 2 trong 5 phút. Dịch enzyme thu ựược giữ