nhiễm nhân tạo và test ELISA
Khoai tây là cây trồng có tiềm năng năng suất rất caọ Ở một số nước trên thế giới, năng suất khoai tây ựã ựạt 30 ựến 40 tấn/ha, trong khi ựó năng suất khoai tây ở nước ta mới ựạt hơn 10 tấn/hạ Nguyên nhân làm cho năng suất khoai tây ở nước ta chưa cao là do: khoai tây là cây trồng nhân giống vô tắnh, vì vậy sau nhiều năm trồng liên tiếp sẽ làm củ giống bị thoái hoá. Mặt khác, khoai tây còn là ựối tượng của nhiều loại sâu bệnh gây hại, ựặc biệt là
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 79
một số chủng virus PVY, PVX, PVA, PVS, PVM, PLRV, PAMVẦTrong ựó PVY ựược xem như là chủng virus gây tác hại lớn nhất.
Theo Ross (1961), khoai tây có thể là ký chủ của 60 loài vius, còn Martin (1968) thấy có tới 33 loại virus gây bệnh cho khoai tây chưa kể tới các chủng nòi của chúng . Virus là bệnh hại nguy hiểm làm thoái hóa giống, giảm năng suất từ 50 Ờ 70% thậm chắ lên tới 90%.
Do ựó công tác ựánh giá các vật liệu nhị bội phục vụ cho dung hợp và con lai soma của chúng là rất quan trọng. Trong các nghiên cứu trên, chúng tôi ựã ựánh giá các chỉ tiêu sinh lý và hóa sinh, bước ựầu nhận thấy 4 dòng con lai soma ựều có ưu thế vượt trội so với bố mẹ, và việc sử dụng phương pháp chỉ thị phân tử cũng ựã xác nhận có gen kháng virus PVX, PVY trong các con laị Và ựiều cuối cùng ựể khẳng ựịnh chắc chắn rằng chúng có khả năng kháng virus là lây nhiễm nhân tạo ngoài ựồng ruộng ựể ựánh giá thực nghiệm tắnh kháng ựó. Chắnh vì thế, do thời gian thực hiện luận văn có hạn nên chúng tôi chỉ ựánh giá khả năng kháng virus PVY của các dòng khoai tây khảo sát.
4.8.1 đánh giá ựộ sạch virus PVX trước khi lây nhiễm nhân tạo
Kiểm tra virus trên con lai soma và bố mẹ bằng DAS Ờ ELISẠ Kết quả ựược hiển thị trong bảng sau
Bảng 4.13 Kết quả test ELISA virus PVX trước khi lây nhiễm nhân tạo
Dòng s/n= (OD của mẫu)/ (OD ựối chứng âm) Kết quả
A41 <2 Không nhiễm
A15 <2 Không nhiễm
A41 <2 Không nhiễm
B186 <2 Không nhiễm
B208 <2 Không nhiễm
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 80 79 <2 Không nhiễm 21-1 <2 Không nhiễm 81-2 <2 Không nhiễm đC (+) >2 (out) Nhiễm đC (-) <2 Không nhiễm Chú thắch: đC (+) Ờ đối chứng dương đC (-) Ờ đối chứng âm
Bảng 4.14 Vị trắ các dòng khoai tây in vitro trong bản test ELISA PVX
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
A A15 A15 A16 A16 A41 A41 B186 B186 B208 B208 76 B 76 79 79 21-1 21-1 81-2 81-2 1 1 2 2 C 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 D 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 E 14 14 15 15 16 16 17 17 (+) (+) (-) F (-) 18 18 19 19 20 20 21 21 22 22 G 23 23 24 24
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 81
Kết luận: Bốn dòng con lai soma và bố mẹ của chúng ựều không nhiễm PVX trước khi lây nhiễm.
Bảng 4.15Kết quả test ELISA virus PVY trước khi lây nhiễm nhân tạo
Dòng s/n= (OD của mẫu)/ (OD ựối chứng âm) Kết quả
A41 <2 Không nhiễm
A15 <2 Không nhiễm
A41 <2 Không nhiễm
B186 <2 Không nhiễm B208 <2 Không nhiễm 76 <2 Không nhiễm 79 <2 Không nhiễm 21-1 <2 Không nhiễm 81-2 <2 Không nhiễm đC (+) >2 (out) Nhiễm đC (-) <2 Không nhiễm Chú thắch: đC (+) Ờ đối chứng dương đC (-) Ờ đối chứng âm
Bảng 4.16 Vị trắ các dòng khoai tây in vitro trong bản test ELISA PVY
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B A15 A15 A16 A16 A41 A41 B186 B186 B208 B208 76 76 C 79 79 21-1 21-1 81-2 81-2 + + - - 1 1 D 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 E 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 F 14 14 15 15 16 16 17 17 18 18 19 19 G 20 20 H (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 82
Hình 4.20 Hình ảnh test ELISA virus PVY trước lây nhiễm nhân tạo
Kết luận: Bốn con lai soma và bố mẹ chúng ựều không nhiễm virus PVY trước khi lây nhiễm.
4.8.2 Test ELISA sau khi lây nhiễm nhân tạo trên con lai soma và bố mẹ
Kiểm tra virus trên con lai soma và bố mẹ bằng DSA-ELISA sau 20 ngày lây nhiễm. Sau khi lây nhiễm khoảng 15 - 20 ngày, quan sát trên tất cả các con lai soma ựều không thấy nhiễm virus PVY trong khi cây chỉ thị (cây thuốc lá) có triệu chứng bệnh rất rõ rệt, ựiều ựó bước ựầu chứng tỏ 4 con lai soma có khả năng kháng ựược bệnh virus PVỴ Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ELISA cũng chỉ rõ cả 4 dòng này ựều phản ứng âm tắnh với virus PVỴ
Bảng 4.17 Kết quả test ELISA sau khi lây nhiễm virus PVY
Dòng s/n= (OD mẫu)/ (OD ựối chứng âm) Kết quả
A15 >2 Không nhiễm
A16 <2 Không nhiễm
A41 <2 Không nhiễm
B186 <2 Không nhiễm
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 83 76 <2 Không nhiễm 79 <2 Không nhiễm 21-1 <2 Không nhiễm 81-2 <2 Không nhiễm đC (+) >2(out) Nhiễm đC (-) <2 Không nhiễm Chú thắch: đC (+) Ờ đối chứng dương đC (-) Ờ đối chứng âm
Bảng 4.18 Vị trắ các dòng khoai tây trong bản test ELISA PVY
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B A15 A15 A15 A16 A16 A16 A41 A41 A41 B186 B186 B186 C B208 B208 B208 76 76 76 79 79 79 21-1 21-1 21-1 D 81- 2 81- 2 81- 2 TL TL TL + + + - - - E F G H Chú thắch: TL Ờ Thuốc lá
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 84
Hình 4.21 Hình ảnh test ELISA virus PVY sau lây nhiễm nhân tạo
Kết luận: Dòng A15 bị nhiễm virus PVY, ựiều này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu xác ựịnh A15 không có gen kháng PVY, tuy nhiên cả 4 dòng con lai soma ựều kháng virus PVỴ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 85
KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Dựa vào toàn bộ kết quả ựã thu ựược trong quá trình thực hiện ựề tài chúng tôi bước ựầu ựưa ra một số kết luận sau:
1. Thông qua phương pháp Flow Cytometry chúng tôi ựã xác ựịnh ựược 4 con lai soma là các dòng tứ bội sau dung hợp. Bằng phương pháp isozym ựã xác ựịnh chắnh xác con lai soma của các tổ hợp laị
2. đã chứng minh ựược sự tổ hợp ựặc tắnh kháng virus của bố mẹ cho con lai soma thông qua dung hợp tế bào trần bằng phương pháp chỉ thị phân tư.¡ điều này cũng ựược khẳng ựịnh qua lây nhiễm nhân tạo với virus PVY và test ELISA cho thấy cả 4 dòng con lai ựều kháng với virus PVY
3. đánh giá sự sinh trưởng phát triển, tạo củ và năng suất của bốn dòng con lai soma và bố mẹ chúng trong ựiều kiện in vitro và chậu vại, kết quả cho thấy các con lai ựều sinh trưởng phát triển, tạo củ tốt hơn bố mẹ chúng.
4. Kết quả ựánh giá sự sinh trưởng phát triển, năng suất, tắnh kháng virus, kết hợp với việc xác ựịnh chỉ tiêu hóa sinh con lai ựã xác ựịnh ựược hai dòng 76 và 79 là 2 dòng có triển vọng, có thể giới thiệu ựể tiếp tục chọn lọc, phát triển thành giống khoai tây chế biến có ựặc tắnh kháng virus
5.2 đề nghị
1. Tiếp tục ựánh giá các dòng lai có triển vọng trên diện rộng (ựồng ruộng) về các ựặc tắnh sinh trưởng, phát triển, năng suất, chất lượng cũng như khả năng kháng bệnh virus.
2. Có thể bước ựầu giới thiệu các dòng lai có triển vọng làm vật liệu cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 86 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Tiếp tục thử nghiệm lây nhiễm nhân tạo và test ELISA bốn dòng con lai soma trên với virus PVX ựể khẳng ựịnh rằng chúng có khả năng kháng thực tế với PVX.
4. Có thể sử dụng các kết quả nghiên cứu của ựề tài ựể ựịnh hướng cho các nghiên cứu tiếp tục trong chọn tạo giống khoai tây chế biến kháng virus phục vụ sản xuất
5. So sánh bốn dòng con lai soma này với các dòng khoai tây tứ bội trồng trọt phổ biến nhằm khẳng ựịnh chúng có thực sự vượt trội về các ựặc tắnh nêu trên hay không.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 87
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Hă Họu An (2005), Cẹy cã cự vộ kủ thuẺt thẹm canh- cẹy khoai tẹy, NXB Lao ệéng xU héị
2. ậẫ Kim Chung (2003), Thỡ tr−êng khoai tẹy ẻ Viỷt Nam, NXB Vẽn hoị thềng tin.
3. PGS.TS. Tạ Thu Cúc (2007), Giáo trình cây rau, Tr 141-169
4. NguyÔn Vẽn HiÓn (2000), Giịo trừnh Chản gièng cẹy trăng, NXB Giịo dôc.
5. Mai Thạch Hoành (2003), Giống và kỹ thuật thâm canh cây có củ, Nhà xuất bản nông nghiệp, Tr 98-130.
6. Lương Văn Hưng (2008), đánh giá khả năng kháng virus PVY và sự ựa dạng di truyền của một số dòng khoai tây nhị bội bằng chỉ thị hình thái và phân tử (SSR) phục vụ chọn tạo giống, Luận văn Thạc Sĩ nông ghiệp. 7. Vũ Triệu Mân (1986), Virus hại khoai tây, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội 8. Trương Thị Hồng Minh (2007), Nghiên cứu giải pháp duy trì chất lượng củ
giống phục vụ xây dựng hệ thống sản xuất khoai tây tại Tỉnh Bắc Giang, Luận văn Thạc Sĩ nông nghiệp.
9. PGS.TS. Lê Lương Tề (2007), Giáo trình bệnh cây nông nghiệp, NXB Nông nghiệp
10. Nguyễn Quang Thạch (1993), Một số biện pháp khắc phục sự thoái hóa giống khoai tây (Solanum tuberosum L.) ở vùng đồng bằng Bắc Bộ, Luận án PTS khoa học nông nghiệp.
11. Ngô đức Thiệu (1984), Kỹ thuật trồng khoai tây, NXB Nông nghiệp.
Tài liệu tiếng Anh
12. ẠC.Ward, J.ST-J Phelstead, ẠẸ Gleadle, N.W. Blackhall, S. Cooper- Bland, Ạ Kumar, W.Powell, J.B. Power afn m.R. Davey (1994) ,Interspecific somatic hybrids between dihaploid Solanum tuberosum L.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 88
and the wild species, S. pinnatisectum Dun.
13. Alexander Arthur Theodore Johnson (1998), Protoplast fusion for the production of intermonoploid somatic hybrids in cultivated potato.
14. Banttari et al. (1993), Detection of potato virus Y in potato tubers: a comparison of polymerase chain reaction and enzyme-linked immunosorbent assay
15. Burton (1989), The physics and physiology of storage in the potatọ 730. 16. ButenkọR.G and Kuchko (1980), Somatic hybridization of Solanum
tuberosum and Solanum chacoense Bitt by protoplast fusion, Advances in protoplast research, pergamon press of ford.293-330.
17. Gavrilenko, T.,R. Thieme, Ụ Heimbach, and T.Thieme (2003), Fertile somatic hybrids of Solanum etuberosum (+) dihaploid Solanum tuberosum and their backcrossing progenies: relationships of genome dosage with tuber development and resistance to potato virus Y, Euphytica 131: 323-332.
18. Gordon J. Lightbourn (2004), Development of intermonoploid somatic hybrids of potato and their molecular analysis based on polymorphism of retroelement TST1, Dissertation submitted to the faculty of the Virginia Polytechnic Institute and State University in partial fulfillment of the requirements.
19. Graham et al (1993), cSFRP2 functions in programmed cell death
20. Hemenway (1988), Molecular breeding for virus resistant potato plants.
21. J.G Hawkerkks (1991), Pathogenic mechanisms of the hypocalcemia of the staphylococcal toxic-shock syndromẹ
22. Johnson AAT, Yu S-M, Tester M (2007), Activation tagging systems in rice. In Upadhyaya, NM (Ed.) Rice Functional Genomics: Challenges,
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 89 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Progress and Prospects (pp. 333-353). New York, NY, USA: Springer Science and Business Media
23. Johnson AAT, Nault BA, and Veilleux RE (2003), Transmission of a Bacillus thuringiensis cry3Aa transgene from diploid to tetraploid potato using 4x-2x hybridization: effect of ploidy increase on transgene expression and implications for TPS hybrid production, Plant Breed . 122: 223-228
24. Johnson AAT, Veilleux RE (2003), Integration of transgenes into sexual polyploidization schemes for potato (Solanum tuberosum L.), Euphytica 133: 125-138
25. Johnson AAT, Piovano SM, Ravichandran V, Veilleux RE (2001),
Selection of monoploids for protoplast fusion and generation of intermonoploid somatic hybrids of potato, Amer. J. Potato Res. 78: 19-29 26. Johnson AAT, Veilleux RE (2001), Somatic hybridization and application
in plant breeding, Plant Breed. Rev. 20: 167-225
27. Karlsson, S. B.; Eriksson, T. (1988). Somatic hybridization between anther-derived dihaploid lines of Solanum tuberosum L. (potato). Current Plant Science and Biotechnology in Agriculture 7: 197-198.
28. Kawchuk et al (1991), Relationship between transcript production and virus resistance in transgenic tobacco expressing the potato leafroll virus coat protein genẹ
29. K.G. Ramawat (2002), Plant Biotechnology, chapter10, Page 72-104. 30. Larmande P, Gay C, Lorieux M, Périn C, Bouniol M, Droc G, Sallaud C,
Perez P, Barnola I, Biderre-Petit C, Martin J, Morel JB, Johnson AAT, Bourgis F, Ghesquière A, Ruiz M, Courtois B, Guiderdoni E (2007),
Oryza Tag Line, a phenotypic mutant database for the Génoplante rice insertion line library, Nucleic Acids Res. 36: D1022-1027
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 90
31. Maharaj K. Razdan (University of Delhi - india) and Autar K. mattoo (US department of agriculture Beltsville agricultural research center) (2005) Genetic Improvement of Solanaceous Crops
32. Mal noe et al, (1994), Mutational analysis of the proteinase function of Potato leafroll virus.
33. Marano M. R., Malcuit Ị, De Jong W. (2002), ỘHigh-resolution genetic map of Nb, a gene that confers hypersensitive resistance to potato virus X in Solanum tuberosumỢ, Theor Appl Genet 105:192-200
34. Matteij.W.M and PuitẹK.J (1992), Tetraploid potato hybrid through protoplast fusion and analysis of their performance in the field, Theor.Appl.Genet 83.
35. Millam, S., L.ẠPayne, and G.R.Mackaỵ(1995), The integration of protoplast fusion- derived material into a potato breeding programme- a review of progress and problems, Euphytica 85: 451-455.
36. Mỏllers, C.; Wenzel, G.(1992), Somatic hybridization of dihaploid potato protoplasts as a tool for potato breeding, Bot. Acta 105: 133-139.
37. Munzert, M., M. Scheidt and Ạ Schweis.(1992), Agronomical evaluation of somatic hybrids derived from valuable dihaploid potato clones( S.tuberosum). Proceedings of the Joint Conference EAPR Breeding and varietal assessment section and EUCARPIA potato section, Landernesu France: 170-175.
38. Naoto Kadotani, Keisuke Kasaoka (2004), Method for breeding potatoes and method for producing seed potatoes.
39. Novy RG, Gillen AM, Whitworth Jl (2007), Characterization of the expression and inheritance of potato leafroll virus (PLRV) and potato virus Y (PVY) resistance in three generation of germplasm derived from Solanum Etuberosum, Theor Appl Genet 114: 1161-1172.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 91
40. N. Fish, Ạ Karp and M. G. K. Jones (1988), Production of somatic hybrids by electrofusion in Solanum, Theor Appl Genet (1988) 76:260- 266.
41. N. Fish, Ạ Karp and M. G. K. Jones.(1987), Production of somatic hybrids by electrofusion in Solanum, Theor Appl Gnete (1988) 76: 260- 266
42. N.Q.Thach, UỊFrei, and G. Wenzel (1993), Somatic fusion for combining virus resistances in Solanum tuberosum L, Theor Appl Genet (1993) 85: 863.
43. Okanoto et al (1996), Breeding virus resistant potatoes (Solanum tuberosum): a review of traditional and molecular approaches.
44. Ploeg et al, (1993), Characteristics of a resistance-breaking isolate of potato virus Y causing potato tuber necrotic ringspot diseasẹ
45. Ramona Thiemẹ Elena Rakosy-Tican. Tajana gavrilenkọ Olga Antonovạ Thomas Thieme (2007), Novel somatic hybrids (Solanum tuberosum L. + Solanum tarnii) and their fertile BC1 progenies express extreme resistance to potato virus Y and late blight, Theor Appl Genet (2008) 116 : 691 - 700.
46. Ramona Thieme et. al. (2009), Improving resistance to late blight (Phytophthora Infestans) by using interspecific crosses in potato
47. Ramona Thieme et. al. (2010), Characterization of the multiple resistance traits of somatic hybrids between Solanum cardiophyllum Lindl (cph), and two commercial potato cultivars. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
48. R.M.Solomon-blackburn (2000), Resistance to Potato virus Y in a Multitrait Potato Breeding Scheme without Direct Selection in Each Generation.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 92
50. S.Trabelsi, R.Gargouri-Bouzid, F. Vedel, Ạ Nato, L. Lakhoua and N.Drirạ (2005), Interspecific somatic hybrid of potato Dihaploid (Solanum tuberosum L.) and Diploid wild species S.etuberosum by