Virus khoai tây ựược ựánh giá là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm, làm giảm ựáng kể năng suất và chất lượng củ. Bởi bệnh virus có những ựặc tắnh sau:
- Là bệnh không chữa ựược khi ựã bị nhiễm. Do virus khi xâm nhiễm vào cây trồng chúng không có sự trao ựổi chất riêng và ựộc lập mà phải sử
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 16
dụng vật chất của ký chủ ựể nhân lên, tấn công các tế bào khác từ vị trắ xâm nhiễm. Như vậy, tế bào ký chủ ựã làm nhiệm vụ nhân virus lên, nên nếu tác nhân nào ngăn chặn sự tái bản của phân tử virus ựồng thời cũng ức chế các quá trình sinh tổng hợp của ký chủ.
- Bệnh virus khoai tây có ựặc tắnh di truyền. Ở những cây nhân giống theo con ựường hữu tắnh, bệnh virus rất ắt truyền qua hạt. Ngược lại cây nhân giống vô tắnh, virus có mặt ở mọi tế bào ựang sống nên rất dễ lan truyền. Khi virus xâm nhiễm vào cây chúng nhân lên và di chuyển theo dòng nhựa luyện tới các bộ phận trong cây, tới tận các củ con. Khi ựó, một củ mẹ bị nhiễm bệnh sẽ tạo ra một cây bệnh, cây này lại tạo ra các thế hệ củ con bị nhiễm virus. Do vậy, năm này qua năn khác bệnh càng mở rộng, tăng lên nhanh chóng. Sự xâm nhiễm virus rất khó phát hiện, diễn ra trong suốt quá trình sống của câỵ
- Bệnh virus lan truyền qua các vector truyền bệnh và tiếp xúc cơ giớị Tùy từng kiểu truyền bệnh của côn trùng mà virus ựược truyền ngay hoặc có thời gian tiềm ẩn trong cơ thể côn trùng kể từ khi trắch nạp virus cho tới lúc truyền sang cây mớị
Từ những nguyên nhân trên dẫn tới khi khoai tây bị nhiễm virus sẽ gây nên hiện tượng thoái hóa giống. Nghĩa là làm giảm dần năng suất gieo trồng của củ, biểu hiện củ nhỏ ựi về kắch thước và trọng lượng, chất lượng củ xấu, hàm lượng dinh dưỡng giảm so với trước, thân lá bị biến dạng làm giảm khả năng quang hợp... Nếu hiện tượng này diễn ra dài có thể dẫn ựến tiêu diệt hoàn toàn giống khoai tây nào ựó. Ngoài ra, khi củ giống bị già sinh lý do bảo quản lâu trong ựiều kiện nóng ẩm cũng dẫn ựến hiện tượng thoái hóa củ. Trong ựó virus là nguyên nhân chắnh dẫn tới hiện tượng thoái hóạ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 17
trung bình từ 30 Ờ 50 triệu pound mỗi năm.
Khoai tây khi nhiễm virus PLRV làm sản lượng củ bị giảm khoảng 20 triệu tấn/ha mỗi năm trên thế giớị
Theo Banttari et al. (1993)(14) khi củ khoai tây bị nhiễm virus PVY và PLRV dẫn tới năng suất giảm 80%.
Hiện nay, người trồng khoai tây ựã sử dụng quá nhiều lượng thuốc trừ sâu, với mục ựắch tạo ra củ sạch bệnh và kiểm soát côn trùng truyền bệnh (rệp muội, bọ phấnẦ). Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu của Jones et al (1982), Debok và Vander want (1987)(55), Valkonen et al (1992)(53) cho thấy giải pháp sử dụng thuốc trừ sâu ựể kiểm soát sự nhân lên của virus là không hiệu quả. Do ựó, việc sử dụng thuốc trừ sâu tràn lan không những không cho hiệu quả trừ bệnh mà còn làm tăng tắnh kháng thuốc của côn trùng truyền virus, xuất hiện nhiều loài mới trong quần thể, hơn nữa còn gây ảnh hưởng tiêu cực ựến hệ sinh thái nông nghiệp và môi trường sống xung quanh. Quan trọng nhất là lượng thuốc còn tồn dư trong củ khoai tây sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe người tiêu dùng.
Cho nên hướng ựi theo con ựường tạo giống khoai tây kháng virus, kháng vector truyền bệnh ựược xem là giải pháp tối ưụ Hướng ựi này ựã và ựang nhận ựược sự quan tâm, chú ý của nhiều nhà nghiên cứu nhằm bảo vệ cây khoai tây nói riêng và cây trồng nói chung.
2.3.3 Giải pháp khắc phuc.
2.3.3.1 Các giải pháp về canh tác
Trước những tác hại của bệnh virus trên, các nhà nghiên cứu về cây khoai tây ựã ựề xuất một số giải pháp nhằm canh tác phòng trừ sự nhiễm bệnh virus khoai tây như sau:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 18
Ớ Loại bỏ nguồn cây, củ bị nhiễm virus
Ớ Hạn chế tối ựa sự nhân lên và lan rộng của phân tử virus
Ớ Trồng xen canh, luân canh một sô loại cây trồng có tắnh kháng virus, xua ựuổi côn trùng truyền bệnh virus. Ngoài ra, có thể áp dụng biện pháp dùng côn trùng ựể kiểm soát vector truyền virus, tuy nhiên phương pháp này rất ựắt (Corsini et al.1994; Valkonen et al.1992)(53).
Ớ Hay sử dụng giải pháp phun xịt dầu khoáng dể ngăn chặn vector truyền virus theo kiểu không bền vững (R.M.Solomon-blackburn và H.Barker, 2000)(48)
Ngoài ra, việc áp dụng biện pháp trồng trọt cũng có hiệu quả khắc phục sự thoái hóa khoai tây do nhiễm virus (Guilley và Lehingrat,1986 )(17)
Ớ Chọn vùng trồng thắch hợp, vùng có khắ hậu ôn hòa, mát mẻ, thường xuyên có gió chống rệp. Tránh trồng lại ở các vùng ựất ựã trồng cây họ cà trước ựó.
Ớ Sử dụng các giống sạch thay cho giống bị bệnh trước, thường xuyên kiểm tra và vệ sinh ựồng ruộng, nhổ bỏ cây bị bệnh.
Ớ Chủ ựộng phòng trừ môi giới truyền bệnh, áp dụng biện pháp kỹ thuật cạnh tác, biện pháp phòng trừ tổng hợp và biện pháp sinh học ựể phòng trừ.
2.3.3.2 Giải pháp công nghệ sinh học
Ạ Tạo giống khoai tây chuyển gen kháng virus
- Tắnh kháng bắt nguồn từ gen Cp (CPMR-Coat Protein Mediated Resistance)
Việc chuyển gen sinh protein vỏ virus vào khoai tây ựể tạo giống kháng virus, ựây là hướng nghiên cứu ựầu tiên về tắnh kháng virus bắt nguồn từ tác
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 19
nhân gây bệnh. Trong ựó, Hemenway (1988)(20) ựã chuyển nạp thành công gen Cp của PVX vào khoai tây, thu ựược kết quả tạo khoai tây chống chịu virus PVX.
Cơ chế của tắnh kháng là chống lại sự tắch lũy virus trong câỵ Kawchuk et al (1991)(28) chứng minh nồng ựộ virus PLRV ở cây chuyển gen Cp rất thấp chỉ khoảng 1% giống như cây ựối chứng trong giai ựoạn tiền xâm nhiễm.
Tắnh kháng CPMR thường là tắnh kháng ựặc hiệu dòng virus, nhưng không phải tất cả (Okanoto et al. 1996)(43). Chúng có thể kháng ựược nhiều dòng virus khác và ắt nhất là kháng với chắnh dòng virus mang gen chuyển ựó. Một số dòng chuyển gen Cp ựã ựược kiểm tra về ựặc tắnh kháng virus trên ựồng ruộng và ựã xác nhận kháng virus: PLRV ở Austrailia (Graham et al 1993)(19), ở Mỹ (Thomas et al, 1997)(52), ở Canada (Kawchuk et al, 1991) (28) và kháng virus PVX ở Switzerland (Mal noe et al, 1994)(32), ở Hà Lan (Van Den Elzen et al, 1993)(54).
Tuy nhiên, tắnh kháng CPMR chỉ có hiệu quả với nhóm virus xâm nhập qua lây nhiễm cơ giới, không kháng ựược nhóm virus truyền qua tuyến nước bọt của côn trùng ựối với trường hợp kháng dòng virus PVY (Lawson et al, 1990) và kháng TRV (Ploeg et al, 1993)(44).
-Tắnh kháng bắt nguồn từ protein di chuyển
Virus mã hóa một số loại protein di chuyển hỗ trợ sự lây lan của virus trong câỵ Khi ựó các phân tử protein này chắnh là mục tiêu trong tạo giống kháng virus.
Vào năm 1996, Tacke ựã chuyển trình tự gen ORF của virus PLRV sang cây khoai tây, gen này mã hóa cho protein pr17 giúp virus di chuyển trong mạch phloem. Dòng khoai tây chuyển gen có biểu hiện ựột biến protein
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 20
pr17 thì kháng ựược với virus PVX, PVỴ Ngược lại, dòng không có ựột biến trên thì chỉ kháng virus PLRV nhưng không kháng PVX và PVỴ Khi tiến hành kiểm tra về tắnh kháng với virus PLRV của các cây chuyển gen thấy ựược lượng kháng nguyên (virus) trong cây giảm rõ rệt. Qua nghiên cứu này Tacke chứng minh tắnh kháng PLRV ựược kiểm soát ở mức RNA, trong khi ựó tắnh kháng PVX và PVY là tắnh kháng bắt nguồn từ protein ựược mã hóa của tác nhân gây bệnh. Do ựó, những cây tắch lũy protein này sẽ kháng ựược sự lây nhiễm của nhiều loại virus khác nhau, PVY và PVX. Cơ chế kháng này không mang tắnh ựặc hiệu dòng virus.
-Tắnh kháng bắt nguồn từ gen tái bản (Replicase (polymerase) mediated resistance)
Năm 1990, nhà khoa học Golemboski ựã chuyển vùng gen polymerase của virus TMV (Tobacco Mosaic tobamovirus) vào cây khoai tây, gen này tạo ra tắnh kháng virus theo cơ chế Ộtắnh kháng bắt nguồn từ gen tái bản polymeraseỢ. Tiếp ựó, hàng loạt nghiên cứu về chuyển các kiểu gen polymerase của RNA virus và tương tự như cơ chế kháng trên ựối với nhiều loại virus khác nhau, virus PVX (Braun và Hemenway 1992; Longstaff et al. 1993)(20), kháng PVY (Audy et al. 1994). Nguyên lý của phản ứng kháng là sự ức chế quá trình tái bản của virus (Braun và Hemenway 1992; Mueller et al.1995)(20). Nghiên cứu của Mosanto (1994) ựã chuyển vùng gen polymerase PLRV vào khoai tâỵ Các dòng chuyển gen biểu hiện toàn bộ gen chuyển polymerase và kháng tốt với virus PLRV.Cho tới nay cơ chế kháng này vẫn chưa ựược hiểu rõ ràng.
-Tắnh kháng theo cơ chế làm câm gen hậu phiên mã (PTGS- Postranscriptional Gene Silencing)
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 21
phiên mã RNA tỏ ra ưu thế hơn phương pháp gen mã hóa protein cũng như một vài phương pháp trên. Dougherty năm 1994 cho biết các cây chuyển gen Cp của virus TEV (Tobacco etch potyvirus) không ựược dịch mã thì có biểu hiện tắnh kháng hoặc nhiễm với virus TEV sau vài tuần lây nhiễm. Ông giải thắch hiện tượng trên là do sự phân giải RNA chuyển gen hậu phiên mã ựã xảy ra trong cây, lượng RNA bị giảm mặc dù gen chuyển ựã ựược phiên mã. Tiếp ựó, tắnh kháng virus PVX bằng phương pháp chuyển gen RNA polymerase ựược nghiên cứu bởi Mueller (1995). Kết quả cho thấy những cây có tắnh kháng cao nhất với virus PVX thì lượng polymerase là thấp nhất và số bản sao của gen chuyển nhiềụ Tắnh kháng không ảnh hưởng ựến sự phiên mã của gen chuyển. Cơ chế kháng ở ựây là sự làm câm gen sau phiên mã (PTGS). PTGS không những ựược cảm ứng bởi gen chuyển mà còn bởi virus (Baulcombe 1996) và dường như là phản ứng phòng thủ chung của cây trồng và ựược giải thắch theo nhiều cơ chế bảo vệ cây trồng bắt nguồn từ tác nhân gây bệnh (pathoge-derived protection). Nguyên lý của cơ chế PTGS ựược mô tả theo cơ chế phân giải ựặc hiệu gen chuyển mRNA và RNA mục tiêu, theo cơ chế PTGS ựòi hỏi hai trình tự RNA có mức tương ựồng cao (English et al. 1996).
Hướng nghiên cứu về tắnh kháng virus PVY ở cây khoai tây, Smith et al. (1994) ựã chỉ ra rằng mức ựộ phiên mã gen ngoại cần thiế ựể khởi ựộng PTGS. Có sự tương quan với tăng cường sự giảm RNA (Metzlaff et al. 1997; Holtor et al. 1999). Do ựó sự giảm mRNA không dẫn tới sự giảm quá trình phiên mã nhưng ảnh hưởng tới giảm sự phân giảị (De Carvalho Niebel et al.1995).
Một số virus thực vật mã hóa tạo ra các protein ức chế phản ứng PTGS (Voinenet et al. 2000), dẫn tới làm Ộựảo ngượcỢ tắnh kháng của câỵ Những protein ựược phân thành các nhóm sau:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 22
+ Nhóm 1: Chúng ức chế phản ứng PTGS ở tất cả các mô trong cây
+ Nhóm 2: Chúng ngăn cản sự mở rộng của phản ứng PTGS sang các tế bào mới (Brignetic et al.1998)
+ Nhóm 3: Chúng ức chế sự làm câm gen, bằng việc ỘkhóaỢ các quá trình tổng hợp tắn hiệu làm câm gen có thể khuếch tán.
-Tạo giống khoai tây kháng vector truyền virus
Bệnh virus lây lan qua tiếp xúc cơ giới, truyền qua vector (côn trùng, tuyến trùng)... trong ựó côn trùng là tác nhân truyền bệnh chắnh. Nên ngoài việc tạo giống kháng virus cần tạo giống kháng côn trùng truyền virus. Tắnh kháng côn trùng truyền bệnh virus dựa trên tổ hợp nhiều yếu tố khác nhau: Yếu tố hóa sinh và ựặc ựiểm hình thái (có lông), ựặc biệt là thành phần glycoalkaloid.
Theo nghiên cứu Tingey et al (1978) và Sinden (1982) cho biết hàm lượng glycoalkaloid có mối liên hệ với tắnh kháng vector truyền bệnh virus, nếu hàm lượng càng cao tắnh kháng càng mạnh và ngược lạị Hợp chất này gây ựộc với một số loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng (beetle-insect) ăn lá (Levinson 1976; Raman eta al. 1979; Sanford et al 1996)(45).
Một số loài khoai tây dại S. berthaultii, S. polyadenium, S. wittmackii và S. tarijense có ựặc ựiểm mang nhiều lông, có tuyến dắnh trên lá và thân do ựó làm giảm tắnh ăn của loài rệp Macrosiphum persicae nên ựã hạn chế sự truyền bệnh virus, nhất là virus PVY (Gunenc và Gibson 1980). Ngoài ra tắnh kháng côn trùng truyền bệnh virus còn phụ thuộc vào tuổi cây trong từng loài, ựối với nhóm khoai tây dại S. brevidens các lá non và lá trưởng thành rất ắt bị rệp tấn công ngược lại lá non của S. etuberosum lại dễ bị tấn công hơn lá già nên rất dễ bị nhiễm virus (Valkonen 1992)(53).
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 23
Về yếu tố hóa sinh, liên quan ựế men phân giải các hợp chất nào ựó trong ruột côn trùng. Trong cây mang ựặc tắnh kháng côn trùng sẽ sản xuất ra một số enzyme và protein ựặc hiệu khi côn trùng ăn vào trong ruột sẽ gây ức chế quá trình tiêu hóa của chúng, làm cho sâu có biểu hiện chán, ngán ăn, sau vài ngày có thể chết.
Phương pháp tạo giống kháng côn trùng truyền bệnh virus cũng rất có ý nghĩa tuy nhiên chỉ phù hợp với nhóm sâu non ăn lá, ăn thân, ắt có ý nghĩa với nhóm côn trùng trưởng thành.
B. Tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần
đối với hướng tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần giữa hai hay nhiểu dòng mang ựặc tắnh kháng tỏ ra có nhiều ưu ựiểm: Tổ hợp ựược bộ genome của cả hai bố mẹ tạo thành một cấu trúc genome dị hợp tử mới, không có sự biệt lập trong quá trình giảm phân, rút ngắn thời gian chọn tạo, khắc phục những rào cản về mặt di truyền trong lai hữu tắnhẦ Cho nên trở thành công cụ ựầy hứa hẹn phục vụ chương trình chọn tạo giống cây khoai tây kháng virus.
Trong tự nhiên tồn tại khá nhiều nguồn gen kháng virus, theo một số nghiên cứu ựã xác ựịnh có khoảng 206 loài khoai tây dại mang củ, 7 loài nguyên thủy và một loài khoai tây trồng Solanum spp, cũng như một số loài dại không mang củ có ựặc tắnh kháng virus tốt (Spooner và Hijmans , 2001). Trong số ựó dòng S. etuberosum có ựặc tắnh kháng cao với bệnh virus PVY, PVAẦ(Valkonen et al, 1992; Thieme et al, 2000)(53)(45), S. tarnii rất kháng với dòng virus PVY (Thieme et al, 2003)(46), loài khoai tây S. cardiophyllum Lindl và S. etuberosum Lindl thuộc chi Pinnatisecta và Etuberosa (Hawkes, 1990) thể hiện tắnh kháng cao với nấm Phytophthora infestans (Hanneman và Bamberg 1986). Chúng ựược thu thập và thăm dò về tắnh kháng virus và tác
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 24
nhân gây bệnh khác kể cả sâu hạị Một số nghiên cứu về khoai tây ở Châu Âu khẳng ựịnh 90% loài khoai tây dại trong quỹ gen thu thập là nguồn gen kháng mới có ý nghĩạ đây là nguồn gen kháng quan trọng phục vụ chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần. Nếu lai tạo giống theo phương pháp truyền thống giữa những dòng dại có tắnh kháng virus và dòng trồng thường gặp rào cản về mặt di truyền, thời gian chọn tạo lâụ..
Rất khó khăn ựể có thể tập hợp nguồn gen dại vào dòng khoai tây trồng Châu Âu bằng lai hữu tắnh, do ựó dung hợp tế bào trần là phương pháp hữu hiệu ựể ựưa nguồn gen ựó vào quỹ gen của loài S. Tuberosum, vượt qua ựược tắnh không tương hợp trong lai hữu tắnh và sự phân tách gen trong chương trình chọn tạo giống (Millam et al, 1995)(35). Sự dung hợp giữa tế bào trần của loài khoai tây dại không có củ S. Brevidens với loài khoai tây trồng S. Tuberosum tạo con lai soma biểu hiện tắnh kháng cao với một số nhóm virus và kháng vector truyền bệnh (Austin et al, 1985b; Fish et al, 1987; Gibson et al, 1988; Pehu et al, 1990; Vankonen et al, 1992)(53)(40).