Sau khi ựã xác ựịnh ựược 4 dòng con lai soma trên là tứ bội, chúng tôi tiến hành tìm ra con lai dị hợp tử (hetezygous) mong muốn. Có nhiều phương pháp ựể xác ựịnh con lai soma dị nhân, trong ựó con ựường có khả năng nhất ựể nhận biết thể lai mục tiêu là việc so sánh các protein thực vật ựặc trưng cho mỗi genotypẹ đây chắnh là cơ sở của phương pháp ựiện di protein, rồi nhận biết chúng thông qua phổ isozym trên gel.
Như chúng ta biết các mô khác nhau hoặc cùng một loại mô có thể chứa những enzyme giống nhau nhưng thực tế không phải là isozym. Hiện nay, nhiều tác giả ựịnh nghĩa isozym là Ợcác protein khác nhau với cùng một hoạt ựộng enzymeỢ. Các genotype khác nhau theo quy luật sẽ thể hiện sự sai khác trên các phổ isozym mẹ, sau khi dung hợp tế bào trần con lai sẽ có phổ isozym là sự cộng lại của phổ isozym cả hai bố mẹ. Vì vậy phương pháp isozym thể hiện tắnh hữu hiệu trong xác ựịnh con lai somạ Qua ựó sẽ dễ dàng nhận biết ra thể lai mục tiêụ
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch và Nguyễn Văn Mùi (1995) cho biết sử dụng phương pháp ựiện di và nhuộm màu isozym peroxidase (Vallejos, 1983) và isozym esterase (Shaw và Prassad, 1970) có
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 48
thể xác ựịnh ựược con lai hetezygous tái sinh sau dung hợp tế bào trần cây khoai tâỵ
để xác ựịnh cây lai soma khoai tây, nhiều tác giả ựề xuất và sử dụng các hệ thống isozym sau: Esterase, peroxidase, superoxiđisutase, malatdehydrogenase, lactat-dehydrolasẹ.. Trong ựó hai loại isozym phổ biến esterase và peroxidase thường ựược sử dụng ựể xác ựịnh con lai soma khoai tâỵ
Esterase ựược hiểu là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân este của axit cacbonic, có ba nhóm chắnh: Arylesterase, Aliesterase và Cholinesterasẹ Dựa trên các cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phân tắch hệ isozym esterase của các dòng tái sinh so với bố mẹ nhằm xác ựịnh con lai soma hetezygous.
4.2.1 Với tổ hợp lai A16 và B186
Trong ựó: 1, 2, 81-2 là các con lai soma sinh ra bởi bố mẹ A16 + B186
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 49
Kết quả cho thấy rằng:
Chỉ có phổ isozym ở dòng 81-2 là sự tổ hợp của bố mẹ A16 và B186. Còn ở hai dòng số 1 xuất hiện các vạch băng giống với dòng A16 và dòng số 2 có phổ isozym khá lạ không trùng với bố hoặc mẹ. Vì vậy trong số ba dòng tứ bội tái sinh trên qua phân tắch isozym chỉ tìm ra ựược dòng 81-2 là dòng lai hetezygous, hai dòng kia có thể là con lai homozygous.
4.2.2 Với tổ hợp lai A15 và A41
Trong ựó: 1, 2, 3, 76, 79 là con lai soma của bố mẹ A15 + A41
Hình 4.4 Kết quả ựiện di isozym esterase của tổ hợp lai A15 và A41
Chỉ có phổ isozym của hai dòng 76 và 79 là sự tổ hợp các vạch băng của bố mẹ. Còn hai dòng tái sinh 2 và 3 thì có các vạch băng giống với dòng A15, dòng 1 xuất hiện vạch băng giống dòng A41. Hiện tượng giống bố hoặc mẹ có thể do sự dung hợp ựồng nhân của bố mẹ hay do hiện tượng tự ựa bội hóa, vì vậy mà cây tái sinh sau dung hợp là cây tứ bội nhưng không phải con lai dị nhân. Qua ựó kết luận
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 50
con lai 76 và 79 là con lai hetezygous cần tìm trong số năm dòng tứ bội tái sinh thành công.
4.2.3 Với tổ hợp lai B186 và B208
Trong ựó: 1, 2, 21-1 là con lai soma của bố mẹ B186 + B208
Hình 4.5 Kết quả ựiện di isozym esterase của tổ hợp lai B186 và B208
Phổ isozym của dòng 21-1 là sự kết hợp của hai bố mẹ B186 và B208, ựối với phổ isozym của dòng 1 thì giống với dòng B208 và dòng 2 giống với dòng B186. Hai dòng 1 và 2 là dòng tứ bội ựồng nhân (homozygous) do hiện tượng tự ựa bội hóa hoặc hai tế bào cùng loại dung hợp với nhaụ Trong số ba dòng tái sinh sau dung hợp, dựa trên kết quả ựiện di isozym chúng tôi xác ựịnh ựược dòng 21-1 là con lai hetezygous.