Nghiên cứu một số đặc tính hoá sinh và khả năng hạ đường huyết của dịch chiết từ vỏ cây mắc mật

Mục đích nghiên cứu Luận văn tập trung vào mục tiêu nghiên cứu thành phần hoá học từ vỏ cây Mắc mật có tác dụng giảm trọng lượng và đường huyết, điều hòa mỡ máu trên chuột BP và ĐTĐ thực

Bộ giáo dục và đào tạo

Trường đại học sư phạm hà nội 2

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu

cả về vật chất và tinh thần, cũng như kiến thức chuyên môn của rất nhiều người xung quanh tôi

Trước tiên tôi xin bầy tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS TS Đỗ Ngọc Liên khoa sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội Thầy đã giao đề tài, tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và động viên khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập, trong cuộc sống, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi để hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này

Tiếp đến tối xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau đại học, khoa sinh KTNN, Ban giám đốc Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ- Đại học Sư phạm Hà Nội 2, nơi tạo điều kiện tốt cho tôi hoàn thành chương trình của khoá học

Tôi xin bầy tỏ lòng biết ơn tới sở GD và ĐT Bắc Giang, Ban giám hiệu trường THPT Cẩm Lý, THPT Lục Nam đã tạo mọi điều kiện để tôi tham gia

và hoàn thành khóa học Để hoàn thành đề tài này tôi xin chân thành cảm ơn

sự giúp đỡ nhiệt tình và hiệu quả của các cán bộ, sinh viên làm việc tại Phòng Miễn dịch học thuộc Trung tâm nghiên cứu khoa học Sự sống, Trường Đại học KHTN- Đại học Quốc gia Hà Nội

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm, chăm sóc, chia sẻ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, làm công việc cũng như trong cuộc sống

Một lần nữa xin trân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày 06 tháng 10 năm 2010 Học viên

Vũ Văn Khánh

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Xã hội phát triển làm cho mức sống của người dân ngày càng được nâng cao, nhưng mặt trái của sự phát triển lại làm tỉ lệ bệnh tật trong dân cư gia tăng nhanh chóng như bệnh đái tháo đường (ĐTĐ), bệnh béo phì (BP), bệnh tim mạch, bệnh truyền nhiễm, bệnh ung thư

Mức sống được nâng cao, ăn uống nhiều chất dinh dưỡng, vận động ít, khả năng cung cấp năng lượng vượt quá nhu cầu của cơ thể là nguyên nhân chính làm cho tình trạng thừa cân, BP tăng lên với mức độ báo động, không những

ở các quốc gia phát triển mà ở cả các quốc gia đang phát triển Theo thông báo của tổ chức quốc tế theo dõi bệnh BP (IOTF), hiện nay thế giới có khoảng 1,7 tỉ người thừa cân và BP [3], [72] Ở Việt Nam, theo điều tra mới nhất của Viện Dinh dưỡng cho thấy tình trạng thừa cân và BP (2007) cũng đang tăng nhanh, trong đó tỉ lệ BP của người trưởng thành, từ 25 – 64 tuổi lên tới 16,8

% [14] Với những hiểu biết hiện nay thừa cân, BP được coi là những đối tượng “nghiễm nhiên” tiến tới ĐTĐ type 2 [3]

Đái tháo đường là bệnh nội tiết phổ biến nhất, theo hiệp hội tiểu đường quốc tế (IDF) số người mắc bệnh ĐTĐ năm 1994 là 110 triệu người, năm

2000 là 146 triệu người, dự đoán hết năm 2010 là 220 triệu người và đến năm

2025 có khoảng 300 – 330 triệu người, chiếm 5% dân số thế giới [3] Ở Việt Nam, số người mắc bệnh ĐTĐ năm 2007 khoảng 2 triệu người, đến nay có khoảng 4,5 triệu người, đáng lo ngại là độ tuổi mắc bệnh này càng trẻ hoá Tổ chức y tế thế giới coi ĐTĐ là “cơn sóng thần” tàn phá sức khoẻ toàn cầu [49], gây ra hàng loạt các biến chứng như: mù mắt, suy gan, thoái hoá thần kinh, tim mạch, hoại tử cơ qua vận động như chân, tay Tỉ lệ tử vong do ĐTĐ gây lên đứng thứ 3 thế giới chỉ sau bệnh tim mạch và ung thư

Thừa cân, BP và ĐTĐ, nhất là ĐTĐ type 2 vừa có tốc độ gia tăng nhanh chóng lại có nhiều biến chứng nguy hiểm Điều nay không chỉ là mối quan tâm lớn của ngành y tế, của các nhà khoa học mà còn thu hút sự chú ý của các nhà quản lý xã hội Ngày nay có rất nhiều loại thuốc tổng hợp dùng điều trị

BP và ĐTĐ do tổ chức an toàn thực phẩm và dược phẩm Mỹ phê chuẩn (FDA) như metformin, orlistat, sibutramin, ephedrin nhưng vô cùng tốn kém và nhiều khi có tác dụng phụ nguy hiểm Ví dụ như năm 1997 kinh phí nước Mỹ chi cho điều trị BP là 47,6 tỉ USD, nhưng cho ĐTĐ lên đến 98,2 tỉ USD [3] Trước tình hình đó Uỷ ban chuyên gia của WHO đã khuyến khích phát triển, sản xuất và sử dụng các thuốc có nguồn gốc thảo dược sẵn có, dễ

sử dụng, ít độc, ít tác dụng phụ, giá thành rẻ rất phù hợp với một nước nghèo như Việt Nam

Hơn thế, Việt Nam là nước có tài nguyên sinh vật vô cùng phong phú, có nền y học dân tộc phát triển lâu đời Từ xa xưa nhân ta đã biết sử dụng cây cỏ sẵn có như một nguồn dược liệu quý giá để trị bệnh và bảo vệ sức khoẻ

Họ Cam tranh (Rutaceae) khá phổ biến ở nước ta, hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu về các loài thuộc chi Clausena [22], [23], [60] cho kết quả khả quan trong điều trị BP và ĐTĐ Tuy nhiên, chưa có tác giả nào nghiên cứu đặc tính dược học và tác dụng trị bệnh ĐTĐ của cây Mắc mật Vì vậy chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính hoá tính hoá sinh và khả năng hạ đường huyết của dịch chiết từ vỏ cây Mắc mật

(Clausena excavata Burm.f.) trên mô hình chuột thực nghiệm”

2 Mục đích nghiên cứu

Luận văn tập trung vào mục tiêu nghiên cứu thành phần hoá học từ vỏ cây Mắc mật có tác dụng giảm trọng lượng và đường huyết, điều hòa mỡ máu trên chuột BP và ĐTĐ thực nghiệm, tạo cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm thuốc chữa bệnh theo y học cổ truyền

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Đưa ra quy trình chiết, tách các hợp chất tự nhiên từ vỏ cây Mắc mật bằng các phức hệ dung môi hữu cơ

3.2 Khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong vỏ cây Mắc mật 3.3 Thiết kế mô hình chuột béo phì thực nghiệm và chuột ĐTĐ type 2

3.4 Nghiên cứu tác động của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ cây Mắc mật đến trọng lượng, đến một số chỉ số hoá sinh trong máu của chuột béo phì thực nghiệm và khả năng điều hoà nồng độ đường huyết của chuột ĐTĐ type 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng

- Thực vật: Vỏ cây Mắc mật (Clausena excavata Bumr f.) được thu hái

vào tháng 7 năm 2009 tại Lục Ngạn - Bắc Giang đã được định tên phân loại

do tiến sĩ Võ Văn Chi nêu ra [6]

- Động vật: Chuột nhắt trắng chủng swiss (Mus musculus) 4 tuần tuổi ( 14- 16g/con) và thức ăn chuẩn được mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp

4.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu một số đặc tính sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết (cao ethanol, cao n-hexan, cao chloroform, cao ethylacetat) từ vỏ cây Mắc mật trên mô hình chuột BPTN và chuột béo phì gây ĐTĐ type 2

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1 Phương pháp chiết tách các phân đoạn dịch chiết

5.2 Phương pháp định tính thành phần hoá học của vỏ cây Mắc mật

5.3 Phương pháp phân lập các hợp chất bằng kĩ thuật sắc kí lớp mỏng,

5.4 Phương pháp định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Cicalteau

5.5 Xây dựng mô hình chuột: béo phì thực nghiệm, chuột ĐTĐ type 2

5.6 Phương pháp định lượng một số chỉ số hoá sinh

5.7 Phương pháp xử lý thông kê

6 Đóng góp mới của đề tài

- Đưa ra quy trình tách chiết phân đoạn các hợp chất tự nhiên từ vỏ cây

Mắc mật (Clausena excavata Burm.f.)

- Đánh giá được được tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ cây Mắc mật đến khả năng giảm trọng lượng và một số chỉ số hoá sinh của chuột BPTN

- Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ cây Mắc mật đến khả năng hạ glucose huyết và điều hoà một số chỉ số hoá sinh ở chuột ĐTĐ type 2

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các hợp chất thực vật thứ sinh(Plant secondary metabolites)

Hợp chất hợp chất thực vật thứ sinh là các sản phẩm của quá trinh trao đổi chất được sinh ra ở thực vật Chúng là các chất hoá học được tổng hợp và chuyển hoá từ các chất trao đổi bậc nhất như axit amin, axit nucleic, carbonhydrate, lipid, peptid hoặc các sản phẩm trung gian của chu trình đường phân, chu trình pentose- phosphate, chu trình axit citric các chất trao đổi bậc nhất giữ vai trò trung tâm và tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất của cơ thể Các hợp chất thực vật thứ sinh không phải là các yếu tố đặc biệt cần thiết cho quá trình sinh trưởng, phát triển, quang hợp [75] Chúng được tạo ra trong các tế bào chuyên biệt với vai trò điều hoà mối quan hệ qua lại giữa các tế bào trong cơ thể và là các hợp chất phòng thủ giúp thực vật chống lại các bệnh xâm nhiễm thực vật đối với môi trường xung quanh [66] Căn cứ vào cấu tạo và tính chất lý hoá học của chúng mà các hợp chất thực vật thứ sinh được chia thành 3 nhóm chính: nhóm phenolic, nhóm terpen, nhóm alkaloid [31],[36] Gần đây nhiều công trình nghiên cứu cho thấy các hợp chất polyphenol (thuộc nhóm phenolic) ngày càng có nhiều ứng dụng rộng rãi trong điều trị một số bệnh nan y như: ung thư, béo phì, tiểu đường [50],[58],[61],63],[72]

nhận biết từ các nguồn khác nhau trong tự nhiên [52] Các hợp chất phenolic

có thể tồn tại ở dạng aglycons tự do, dạng ether, este, dạng glycoside, dạng phức hợp với protein, dạng carbonhydrate hoặc các dạng khác [13],[15],[37] Dựa vào cấu tạo và tính chất hoá học, hợp chất phenolic được chia thành 2 nhóm lớn: Nhóm phenol đơn giản (simple phenol) và nhóm polyphenol Nhóm phenol đơn giản lại được chia thành 2 nhóm chính: nhóm phenolic acid

và nhóm coumarin Nhóm polyphenol cũng chia thành 2 nhóm chính: Nhóm flavonoid và nhóm tannin [6], [32], [37], [45], [54]

1.1.1.1 Phân nhóm phenolic acid

Khái niệm phenolic trong thực vật dùng để chỉ tất cả các hợp chất thực vật thứ sinh có tối thiểu một nhóm hydroxyl phenolic, gần đây các nhà khoa học thường giới hạn phân nhóm phenolic acid chỉ gồm các chất là dẫn xuất của acid benzoic (C6–C1) và acid cinamic(C6–C3) [8]

coi là một trong số các chất “phòng thủ hoá học hữu hiệu” giúp thực vật tránh được những bất lợi do môi trường và dịch bệnh gây ra Trong đời sống hàng ngày, coumarin được sử dụng làm nước hoa, hương liệu, bán tổng hợp các chất hoá học khác nhau, đặc biệt là các chất chống đông máu và chất diệt loài gặm nhấm Trong y học, tác dụng đáng chú ý của dẫn chất coumarin là tác dụng chống co thắt, làm giãn nở động mạch vành, làm bền và bảo vệ thành mạch Nhiều chất coumarin có tính kháng khuẩn, một số chất khác có tác dụng kháng viêm, kháng nấm, kháng khối u, trừ giun sán, giảm đau và hạ nhiệt

Coumarin 1.1.1.3 Phân nhóm Flavonoid

Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phenolic thường gặp trong tự nhiên Chúng thường là những sắc tố, phần lớn có màu vàng (flavon, flavonol, chancol), dễ tan trong nước nên có tên là “flavonoid” (flavus có nghĩa là màu vàng Ngoài ra còn có một số sắc tố khác như xanh, đỏ, tím hoặc không màu cũng được xếp vào nhóm flavonoid vì chúng có chung đặc điểm cấu tạo hoá học Màu sắc của flavonoid còn thay đổi theo pH của môi trương (Anthocyanes có màu đỏ trong môi trương acid, màu xanh trong môi trường kiềm) [31], [43], [44]

Trong cây, flavonoid có thể tồn tại ở hai dạng là dạng tự do aglycon tan nhiều trong các dung môi hữu cơ như ether, ethanol, acetone và hầu như không tan trong nước Dạng liên kết với đường gọi là glycoside tan trong nước và hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ Khi thuỷ phân các

flavonoid băng acid hoặc enzyme thì chúng sẽ phân tách thành phần glycon

và phần đường tương ứng [59]

Về hoá học, khung cacbon của flavonoids là C6–C3-C6, gồm 15 nguyên tử cacbon, 2 vòng bezen A và B nối với nhau qua vòng pyran C, trong đó A kết hợp với C tạo thành khung chroman [31], [37]

9 10 8

5

7 6

2 3

O

1

4

1' 5' 6' 4'

3' 2'

B

Flavan (2-phenyl chroman) Tuỳ theo mức độ oxy hoá của mạch 3 cacbon, sự có mặt hay không có mặt của nối đôi giữa C2,C3 và nhóm cacbonyl ở C4 mà flavonoid có thể chia thành nhiều nhóm phụ khác nhau [67]

Hiện nay đã có hơn 4500 các loại flavonoid khác nhau tồn tại trong cơ thể thực vật đã được nhận dạng [67] Trong cây, flavonoid giữa rất nhiều vai trò

quan trọng mang chức năng sinh lí, sinh thái có ý nghĩa sống còn như: Điều chỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây (flavonol, anthocyanes), làm tăng hiệu quả quang hợp, bảo vệ cây chống lại được những bức xạ sóng ngắn, có tính kháng khuẩn, kháng nấm, giúp cây tránh được bệnh tật, hấp dẫn động vật thụ phấn cho hoa Trong y học, falvonoid được sử dụng làm thuốc điều trị những bệnh khác nhau như: thuốc làm bền thành mạch, thuốc chống oxy hoá, thuốc kháng viêm, chống nấm, chống dị ứng, chống ung thư, làm thay đổi hoạt tính của enzyme tham gia điều hoà tổng hợp protein, thuốc làm giảm BP và lipid máu, thuốc hạ đường huyết [11],[21],[29],[39],[42], [47],[48],[62]

1.1.1.4 Phân nhóm tannin

Tannin là những hợp chất phenolic rất phổ biến trong thực vật bậc cao Horvath (1981) đã đưa ra khái niệm về tannin như sau: “Tannin là những hợp chất phenolic có trọng lượng phân tử cao, có chứa các nhóm hydroxyl và các nhóm chức khác (chẳng hạn như nhóm cacbonyl), có khả năng tạo phức với protein và các phân tử lớn khác trong điều kiện đặc biệt” [8], [9]

Về hoá học, tannins được cấu tạo dựa trên acid tannic và acid gallic, phổ biến trong cây ở dạng tự do hoặc ở dạng glycoside kết hợp với đường Tannin thường là các hợp chất vô định hình, có màu trắng, màu vàng nhạt hoặc gần như không màu, có tính quang học, có vị chát, dễ bị oxy hoá khi đun nóng và

để ngoài ánh sáng và có trọng lượng phân tử dao động từ 5.000- 20.000 [40].Tannin tan nhiều trong nước (tốt nhất là trong nước nóng), tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, hoà tan một phần trong acetone, ethylacetat và hầu như không tan trong các dung môi kém phân cực như chlorform, benzene Tannin tạo phức màu đặc trưng với kim loại nặng, tạo phức với protein, với tinh bột, cellulose và muối khoáng

Về tác dụng sinh học, tannin là các chất bảo vệ cây trước sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh, các loại động vật và côn trùng ăn lá [46], [52] Về tác dụng

y học, tannin được sử dụng làm thuôc cầm máu, thuốc chữa đi ngoài, chữa ngộ độc kim loại năng, thuốc chống ung thư, thuốc chữa trĩ, viêm miệng,viêm xoang, điều trị cao huyết áp và chống đột qụy [38]

Procyanidin Quebracho

1.1.2.Nhóm các hợp chất terpene

Terpene là nhóm hydrocacbon thực vật lớn nhất và đa dạng nhất, đựơc hình thành từ quá trình polyme hoá các tiểu đơn vị isopren 5-carbon (C5H8), có công thức cấu tạo chung là (C5H8)n Trong thực vật, terpenes được tổng hợp thông qua con đường trao đổi chất acetate/mevalonane hoặc con đường glyceraldehyde 3-phosphate/pyruvate Hầu hết các terpene đều thuộc nhóm hydrocarbon, tuy nhiên chúng có thể bị khử hoặc bị oxy hoá để hình thành các hợp chất terpenoid khác như alcohol, ketone, acid và aldehyd Vì vậy một số tác giả dùng thuật ngữ “terpene” để chỉ chung một nhóm lớn các hợp chất bao gồm cả terpen và terpenoid [67] Terpene là thành phần chính của tinh dầu, được dùng trong công nghệ hương mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm Terpene bậc cao thường là các chất có hoạt tính sinh học

1.1.3 Phân nhóm alkaloid thực vật

Alkaloid là những hợp chất chứa nitơ, đa số dị vòng, gặp ở cả động vật và thực vật Đa số alkaloid không màu, không mùi, vị đắng, một số vị cay, ở dạng rắn màu trắng, trừ một số có màu vàng như berberin, palmatin Các

alkaloid dạng base thường không tan trong nước [36] Trong cây alkaloid tồn tại dưới 3 dạng là dạng tự do, dạng muối của các axit phổ biến như axit citric, lactic, oxalic, axetic, malic, và dạng oxit nitơ Nguyên tử nitơ có thể là một phần hay không phải là một phần của hệ thống dị vòng Đa số alkaloid dị vòng chứa oxi thì ở thể rắn (caffeine), không có oxi thường ở thể lỏng dễ bay hơi (nicotin) Alkaloid có cấu trúc phân tử phức tạp có hoạt tính sinh dược học rõ rệt và phân bố hạn chế trong giới thực vật [64] Dưới đây là ba dạng alkaloid điển hình: Caffeine, nicotin, morphine

Caffeine Morphine Nicotin Alkaloid có thể liên kết với kim loại nặng tạo phức và phản ứng với một số thuốc thử như: Bouchardat ( tạo kết tủa màu nâu sẫm), vars-mayer (tạo kết tủa màu vàng) hay dragendroff (tạo kết tủa màu da cam, nâu đỏ)

Hiện nay đã có hơn 12000 alkaloid khác nhau đươc phân lập Chúng không phổ biến rộng rãi ở tất cả các loài thực vật mà tập trung ở các loài thực vật có hoa (khoảng 20% loài thực vật có hoa sản sinh được alkaloid) [36]

Về vai trò sinh học, các alkaloid là một trong những “hàng dào phòng thủ hữu hiệu” bảo vệ cây trước sự tấn công của vi sinh vật gây bệnh, côn trùng, sâu ăn lá [67] Về mặt y học, alkaloid được sử dụng rất đa dạng làm thuốc gây

ức chế hoặc thuốc kích thích hệ thần kinh trung ương, thuốc điều hoà huyết

áp, chữa loạn nhịp tim, thuốc diệt kí sinh trùng, kháng khuẩn, chống ung thư Một số nghiên cứu gần đây cho thấy alkaloid chiết xuất từ thực vật có tác dụng hạ đường huyết như berberin (Tinospora cordifolia, Coptis sisensis), Casuaine 6-O-αglycoside (Syzygium malaccense )

1.2 Bệnh béo phì (Obesity)

1.2.1 Khái niệm và phân loại bệnh béo phì

Tổ chức y tế thế giới (WHO) định nghĩa về béo phì là tình trạng tích luỹ

mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng hay toàn bộ cơ thể gây ảnh hưởng tới sức khoẻ

Để đánh giá mức độ BP gầy WHO thường dùng chỉ số khối lượng cơ thể (BMI- Body Mass index) Chỉ số khối lượng cơ thể được tính theo công thức sau:

2

H

W BMI  Trong đó: W- Khối lượng (kg)

Nhẹ cân < 18.5 < 18.5 Thấp, nguy cơ suy dinh dưỡng

và các bệnh khác Bình thường 18.5- 24.9 18.5- 22.9 Bình thường

Quá cân 25- 29.9 ≥ 23 Nguy cơ tăng cân

BP độ I 30- 34.9 23- 24.9 Nguy cơ cao của bệnh BP

BP độ II 35- 39.9 25- 29.9 Nguy cơ nặng của bệnh BP

BP độ III ≥ 40 > 30 Nguy cơ rất nặng của bệnh BP

1.2.2 Thực trạng béo phì trên thế giới và Việt Nam

Theo WHO cho biết, hiện nay số người BP trên thế giới đã lên đến 1,7 tỉ người Trong đó cứ 4 người trưởng thành thì có một người béo phì, tức tỉ lệ

BP ở người trưởng thành là 25% Tình trạng BP đang tăng lên với mức độ báo động và có xu hướng trẻ hoá Mỹ là nước có số dân mắc BP cao nhất thế giới, hiện nay có khoảng 60 triệu người (chiếm 30% dân sô), tăng gấp 3 lần so với

năm 1991 Tại châu Âu, Anh là quốc gia đứng đầu với 23% dân số mắc bệnh Châu Mỹ, Braxin có tới 16% dân số mắc bệnh Châu Á, tỉ lệ thừa cân và BP ở Thái Lan là 3,5%; Philipin là 4,27%; Malaysia là 3,0%; Hàn Quốc là 2,08%; Trung Quốc có 12% thanh niên và 8% trẻ em mắc bệnh [34]

Theo tiêu chuẩn châu Á, Việt Nam hiện có 16,8 % người trong độ tuổi 25-

64 là thừa cân, BP Tỉ lệ người mắc bệnh ở thành thị cao gấp 3 lần so với nông thôn Tình trạng thừa cân và BP đặc biệt tăng mạnh ở độ tuổi trên 45 (chiếm 2/3 số người BP) và ở nữ giới có tỉ lệ BP cao hơn nam Đối với trẻ em tình trạng thừa cân, BP cũng rất đáng lo ngại Theo kết quả điều tra của Viện dinh dưỡng: Hà Nội có tới 4,9% độ tuổi từ 4- 6 tuổi bị béo phì Thành phố Hồ Chí Minh tỉ lệ này còn cao hơn nhiều, lên đến 6% số trẻ dưới 5 tuổi và 22,7%

số trẻ đang học cấp I bị thừa cân và BP Đây thực sự là mối đe doạ tiềm ẩn trong tương lai, ảnh hưởng đến sức khoẻ của mỗi người và sự phát triển kinh

tế của xã hội [3]

1.2.3 Nguyên nhân gây ra béo phì

Yếu tố di truyền: Yếu tố di truyền có thể có một vai trò nhất định đối với

những trẻ BP thường có cha mẹ béo Tuy nhiên, nhìn trên đa số cộng đồng yếu tố này không lớn mà chủ yếu do cách sống cũng như ăn uống của cha mẹ

Khẩu phần ăn và thói quen ăn uống: Năng lượng đưa vào cơ thể qua thức

ăn, thức uống được hấp thụ và được oxy hoá để tạo thành năng lượng Năng lượng ăn quá nhu cầu sẽ được dự trữ dưới dạng mỡ Chế độ ăn nhiều chất béo (lipid) có liên quan chặt chẽ với gia tăng tỉ lệ BP

Hoạt động thể lực kém: Cùng với yếu tố ăn uống, sự gia tăng tỉ lệ BP đi

song song với sự giảm hoạt động thể lực trong một lối sống tĩnh tại hơn, thời gian dành cho xem ti vi, đọc báo, làm việc bằng máy tính nói chuyện qua điện thoại nhiều hơn Những người hoạt động thể lực nhiều thường ăn thức ăn giàu

năng lượng, khi họ thay đổi lối sống, hoạt động nhưng vẫn giữ thói quen ăn nhiều nên bị béo phì

Yếu tố kinh tế xã hội: Ở các nước đang phát triển, tỉ lệ người BP ở tầng lớp

nghèo thường thấp (do thiếu ăn, lao động chân tay nặng, phương tiện di lại khó khăn) và BP thường được coi là một đặc điểm của giàu có Ở nhiều nước

tỉ lệ người béo lên tới 30- 40%, nhất là ở độ tuổi trung niên và chống BP trở thành mục tiêu sức khoẻ cộng đồng quan trọng Ở Việt Nam tỉ lệ người béo

có khuynh hướng gia tăng nhanh, nhất là ở các đô thị [3],[9]

1.2.4 Tác hại của bệnh béo phì

Chứng thừa cân và BP gây nhiều tác hại cho cuộc sống con người như mất thoải mái trong sinh hoạt, giảm hiệu suất lao động, kém lanh lợi do khối lượng cơ thể nặng nề

Người BP có nguy cơ bệnh tật cao hơn so với người người thường do nhiễm độc mỡ máu, tiêu biểu là:

- Bệnh tim mạch: Do mỡ tạng làm tim khó co bóp và mỡ máu làm xơ cứng mạch vành và các mạch máu khác gây nhồi máu cơ tim, tăng huyết áp

- Rối loạn lipid máu: Rất hay gặp ở người béo bụng và có biểu hiện đặc trưng là tăng triglycerid và lipid có hại (LDL-c), giảm lipid có lợi (HDL-c)

- Tiểu đường: Béo phì toàn thân có nguy cơ mắc ĐTĐ type 2

- Đột quỵ: Những người có BMI > 30 dễ bị tử vong do bệnh liên quan đến mạch máu não

- Ngoài ra BP còn làm gia tăng nguy cơ của nhiều bệnh khác: làm xấu đi tình trạng rối loạn tiền mãn kinh ở phụ nữ, suy giảm chức năng hô hấp, rối loạn hoạt động cơ xương, ung thư, sỏi mật và các vấn đề bệnh lý tâm thần khác [4], [14, [34]

1.2.5 Rối loạn trao đổi lipid máu

Huyết thanh người bình thường có 5-7 g/l lipid toàn phần bao gồm acid béo

tự do triglycerid, cholesterol toàn phần với hai dạng cholesterol tự do và cholesterol este, các photpholipid Vì không tan trong nước nên các lipid được vận chuyển trong máu dưới dạng kết hợp với các protein đặc hiệu Các acid béo tự do được vận chuyển chủ yếu bởi albumin, các lipid khác được lưu hành trong máu dưới dạng phức hợp lipoprotein như các hạt chymomicron, và các lipoprotein có tỉ trọng khác nhau liên kết với cholesterol như VLDL-c, HDL-c, IDL-c, LDL-c Các lipoprotein này có kích thước, tỉ trọng, chức năng khác nhau trong quá trình chuyển hoá lipid [10], [24], [55]

Để đánh giá lượng mỡ trong máu, người ta làm xét nghiệm với các chỉ số:

 Cholesterol toàn phần (2,9- 5,2 mmol/l)

lệ thành phần của lipid máu có sự thay đổi Khái niệm này chỉ rõ rối loạn chuyển hoá lipid máu có thể xảy ra từ rất sớm nay từ khi chưa có sự tăng các giá trị tuyệt đối nồng độ của các thành phần trong máu[3] Rối loạn này có thể

do tiền phát do di truyền hoặc thứ phát sau các bệnh khác như BP, ĐTĐ, nghiện rượu, suy giáp trạng Fredrickson căn cứ vào kĩ thuật điện di và siêu li tâm với các thành phần huyết thanh đã phân loại chứng tăng lipid máu thành 5 type dựa trên những thay đổi thành phần lipoprotein Cách phân loại này đã được WHO chính thức sử dụng vào năm 1970 [20] Nhiều nghiên cứu đã

chứng minh người bệnh BP có nguy cơ cao mắc các bệnh rối loạn lipid máu dẫn đến xơ vữa động mạch (liên quan chủ yếu đến các lipoprotein) hoặc hiện tượng “nhiễm độc mỡ tế bào” [17], [20]

1.2.6 Mối quan hệ giữa béo phì với đái tháo đường

Béo phì và ĐTĐ là hai bệnh không truyền nhiễm nguy hiểm nhất thế kỷ 21 Hai căn bệnh này có mối quan hệ chặt chẽ với nhau thể hiện ở chỗ tỉ lệ người

BP luôn tăng tương đương với số bệnh nhân bị ĐTĐ Một cuộc khảo sát gần đây của Mỹ cho thấy 58% số người bị ĐTĐ type 2 được quy cho là do BP Béo phì liên quan đến ĐTĐ type 2 thông qua sự đề kháng insulin Nồng độ acid béo tự do cứ tăng lên 100 µM thì mức đề kháng insulin tăng lên 5- 10% [3] Thiếu insulin dẫn đến tăng trọng lượng cơ thể, tăng đường máu, cuối cùng dẫn đến ĐTĐ type 2

Có nhiều nhân tố ảnh hưởng tới mối quan hệ giữa BP với ĐTĐ type 2 bao gồm: Chỉ số khối lượng cơ thể, thời gian BP, chế độ dinh dưỡng, sự vận động thân thể Một thống kê chỉ ra rằng người có chỉ số khối cơ thể lớn hơn 30kg/m2 trong 10 năm có nguy cơ mắc ĐTĐ type 2 cao gấp hai lần người bị

BP dưới 5 năm và nếu trọn lượng cơ thể tăng 1 kg thì rủi ro về bệnh ĐTĐ type 2 tăng 4,5% [34] Đây chính là cơ sở để Reed và cộng sự đưa ra phương pháp gây ra ĐTĐ thực nghiệm ở động vật bằng cách tiêm STZ liều đơn cho chuột đã được vỗ béo nhiều ngày [65], [74] Tại Việt Nam, Trần Thị Mai Chi

áp dụng phương pháp này và đạt hiệu quả 90% chuột xuất hiện ĐTĐ type với nồng độ glucose máu ≥ 10 mmol/l [17]

Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy acid béo tự do có vai trò trong bệnh sinh ĐTĐ type 2 Phần lớn người BP có nồng đọ acid béo trong huyết tương tăng cao Sự tăng này gây ức chế quá trình hấp thụ glucose ngoại vi dưới tác dụng của insulin, ức chế sử dụng glucose của toàn cơ thể, ức chế oxy hoá glucose ở cơ [35]

ĐTĐ đặc trưng bởi sự rối loạn chuyển hoa glucid, rối loạn này ảnh hưởng đến môi trường nội môi do kéo theo hoặc làm cho quá trình rối loạn chuyển hoá lipid ở mỗi loại ĐTĐ mang những đặc trưng riêng Đặc điểm chung của

sự rối loạn chuyển hoá lipid trong ĐTĐ là sự tăng triglycerid, giảm HDL-c và LDL-c vẫn nằm trong giới hạn bình thường Tuy nhiên ở ĐTĐ type 1 rối loạn tăng triglycerid sẽ mất đi khi kiểm soát được glucose máu khác với type 2, rối loạn này có thể vẫn kéo dài mặc dù điều trị có giảm glucose máu thích hợp LDL-c của type 2 cũng có sự tăng nhẹ và xuất hiện nhiều LDL-c với kích thước nhỏ và nặng hơn khi việc kiểm soát glucose kém Đây chính là yếu tố làm tăng nguy cơ bệnh xơ vữa động mạch [17],[34]

1.2.7 Cách phòng trị [3],[27]

Nguyên tắc phòng là mỗi cá nhân, thực hiện chế độ ăn uống hợp lý và hoạt động thể lực đúng mức để duy trì ổn định cân nặng của cơ thể Trên phạm vi

xã hội, cần tập trung vào nhóm có nguy cơ mắc bệnh này

Điều trị bệnh BP chủ yếu vẫn là thực hiện chế độ ăn uống, luyện tập thể lực hợp lý Những can thiệp của y tế chỉ được đặt ra khi các biện pháp khác can thiệp không có hiệu quả

- Chế độ ăn đảm bảo năng lượng, ít đường, ít chất béo, đủ đạm và vitamin, nhiều rau quả

- Xây dựng nếp sống năng động, tăng cường các hoạt động thể lực

- Sử dụng thuốc chỉ áp dụng cho người có BMI > 27 và có vấn đề về sức khoẻ Thuốc chống béo phì có hai nhóm lớn: Nhóm tác động lên hệ thần kinh trung ương và nhóm tác động lên hệ tiêu hoá, phổ biến nhất hiện nay là metformin thuộc nhóm 2, nó tác động ức chế phân giải glycogen thành glucose ở gan, nên hàm lượng đường huyết giảm, giảm HbA1C Vì thế dùng cho cả bệnh nhân BP và tiểu đường

- Phẫu thuật giảm cân: Chỉ áp dụng với bệnh nhân có BMI > 35 và kèm theo bệnh lý và các rối loạn liên quan Phẫu thuật mang lại thành công lớn, nhiều người giảm được 50% trong lượng trong 1- 2 năm sau phẫu thuật Tuy nhiên, nếu không thực sự cần thiết thì không nên dùng thuốc và phẫu thuật vì nó sẽ gây ra nhiều tác dụng phụ, đôi khi làm nguy hiểm đến tính mạng

1.3 Bệnh đái tháo đường (Diabetes mellitus)

1.3.1 Khái niệm

Danh từ đái tháo đường (Diabetes mellitus) có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp (Diabetes: nuớc chảy trong ống syphon) và tiếng La tinh (Mellitus: ngọt) [71] ĐTĐ là bệnh phổ biến nhất và đang ngày càng phat triển trên toàn cầu Biểu hiện của bệnh là sự tăng đường huyết, không dung nạp glucose dẫn đến ĐTĐ ĐTĐ cũng là nguyên nhân gây ra các biến chứng mù mắt, suy gan, thần kinh, tim mạch, hoại tử cơ quan vận động như chân tay .[77] Nguyên nhân của ĐTĐ là do tế bào β của tuyến tụy langerhan bị phá huỷ mất khả năng sản xuất insulin, một hormone điều hoà nồng độ glucose trong máu (ĐTĐ type 1) hoặc

do rối loạn trao đổi chất lipid-glucid dẫn đến kháng insulin (ĐTĐ type 2) [25], [54] Theo Tạ Văn Bình, ĐTĐ là một hội chứng có đặc tính biểu hiện tăng đường máu, do hậu quả của việc mất hoàn toàn insulin hoặc là do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin Bệnh ĐTĐ được xác định dựa vào những tiêu chí dưới bảng 1.2 [3]

Bảng 1.2 Các tiêu chí để chẩn đoán ĐTĐ theo WHO (Đơn vị: mmol/l)

huyết lúc đói

Đường huyết 2 giờ sau khi làm nghiệm pháp tăng đường huyết

Đường huyết tại thời điểm bất kì

chứng uống nhiều, đái nhiều

1.3.2 Thực trạng đái tháo đường trên thế giới và ở Việt Nam

Cùng với các bệnh không lây nhiễm khác ĐTĐ đang phát triển với tốc độ nhanh chóng theo sự phát triển của kinh tế xã hội Tỉ lệ mắc ĐTĐ thay đổi theo dân tộc, lứa tuổi và các vùng địa lý khác nhau, theo sự phát triển kinh tế của mỗi nước [76] Những số liệu mới nhất tại hội nghị thượng đỉnh quỹ ĐTĐ thế giới năm 2006 cho thấy, tỉ lệ ĐTĐ ở châu Á hiện nay đã vượt xa so với châu Âu nơi vẫn được xem là ổ bệnh Số người bị bệnh ở châu Âu là 5% thì ở châu Á lên đến 10 – 12% và ở những quốc đảo thuộc Thái Bình Dương là 30 – 40% Điều nguy hiểm là chấu Á đang có chiều hướng gia tăng bệnh ĐTĐ ở thanh thiếu niên và trẻ nhỏ Cũng theo tổ chức này thì năm 1994 thế giới có

110 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, năm 2000 là 146 triệu người, dự đoán năm

2010 có khoảng 220 triệu người và đến năm 2025 có khoảng 300-330 triệu người mắc ĐTĐ, chiếm 5% dân số thế giới [3]

Ở Việt Nam tỉ lệ mắc ĐTĐ gia tăng nhanh chóng Năm 1991 tỉ lệ mắc ĐTĐ ở Hà Nội là 1,1%; Huế là 0,96%; ở thành phố Hồ Chí Minh là 2,3% Năm 2002 tỉ lệ ĐTĐ trên toàn quốc là 2,7%; riêng ở các thành phố tỉ lệ này là 4,4% trong khi ở các khu vực khác dao động từ 2,1-2,7% Hiện nay có khoảng 2 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, nhưng có đến 65% số người bệnh không biết mình đã mắc căn bệnh này Trong 10 năm qua số bệnh nhân mắc ĐTĐ tăng gấp 3- 4 lần ở khu vực thành thị, khu vực nông thôn trước đây tỉ lệ này rất ít thì nay bệnh này đã trở lên phổ biến [3]

Như vậy, ĐTĐ đang có chiều hướng phát triển nhanh chóng nhất là ở châu

Á Mối liên quan chặt chẽ giữa dinh dưỡng- lối sống và bệnh ĐTĐ từ lâu đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới công nhận Dinh dưỡng không hợp lí dẫn đến thừa cân, BP và rối loạn chuyển hoá là một trong những cơ chế quan trọng trong sinh bệnh học của rối loạn dung nạp glucose và bệnh ĐTĐ Hơn nữa bệnh ĐTĐ lại có nhiều biến chứng về tim mạch, thần kinh, mù loà, tổn

thương thận, gây đột quỵ, giảm tuổi thọ Vì thế ĐTĐ không chỉ mối quan tâm của ngành y tế mà còn thu hút cả sự chú của các nhà quản lý xã hội 1.3.3 Phân loại bệnh đái tháo đường

Năm 1997, Uỷ ban chuyên gia về chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ của WHO đưa ra đề nghị phân loại ĐTĐ mới dựa trên những tiến bộ khoa học trong những năm gần đây [78] Phân loại này dựa vào những hiểu biết về nguyên nhân sinh bệnh, cách phân loại này như sau:

- ĐTĐ type 1: Là kết quả của sự phá huỷ tế bào β tuyến tuỵ Vào lúc ĐTĐ xuất hiện, thì hầu hết các tế bào β tuyến tụy đã bị phá huỷ, quá trình phá huỷ này là do cơ chế tự miễn [25], [33] Bản thân cơ thể sinh sản ra các kháng thể chống lại các kháng nguyên của tổ chức tuyến tuỵ, như chống lại glutamic acid decarboxylase (GAD), chống lại insulin (IAAS) Loại tiểu đường này xảy ra ở bất kì lứa tuổi nào, nhưng thường xảy ra ở trẻ em và thanh niên [33]

- ĐTĐ type 2: Hai yếu tố đóng vai trò quan trọng cơ chế sinh bệnh tiểu đường type 2 là khiếm khuyết chức năng tế bào β tuyến tụy và hiện tượng kháng insulin Tuy nhiên hai yếu tố này lại tác động qua lại với nhau Khiếm khuyết chức năng bài tiết insulin có thể làm xuất hiện hiện tượng kháng insulin hoặc ngược lại [68] ĐTĐ type 2 do nhiều nguyên nhân: Tác động của nhiều gen kết hợp yếu tố môi trường [34]

- ĐTĐ thời kì thai nghén: Cơ thể của phụ nữ thay đổi nhiều trong thời kì mang thai, thai phụ có thể mắc bệnh tiểu đường này [77]

1.3.4 Cơ chế sinh bệnh ĐTĐ

1.3.4.1 Cơ chế sinh bệnh ĐTĐ type 1

Nguyên nhân chính của ĐTĐ type 1 còn gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin (IDDM) do tế bào β của đảo tuỵ Langerhan bị phá huỷ dẫn đến mất khả năng sản xuất insulin, một hormone điều hoà nồng độ glucose máu Quá trình huỷ hoại các tế bào β này do cơ chế sinh bệnh tự miễn dịch [33] Khoảng 18 vùng

gen có liên quan đến nguy cơ tiểu đương type 1, mỗi vùng này có thể chứa vài gen được gắn nhãn IDDM1 đến IDDM18 Ngoài ra, các yếu tố môi trường cũng đóng vai trò khởi động quá trình bệnh lý như virus (Coxsackie B, Cytomegalovirus, Echo, Epstein ), thức ăn (sữa bò, caffeine ), điều kiện sống (strees, thường xuyên tiếp xúc với tế bào β như vascor ) [33],[78] Khi tác nhân môi trường tác động, lúc này hệ thống miễn dịch được hoạt hoá, tấn công vào các tiểu đảo tuỵ [33] Mặc dù diễn biến lâm sàng yên lặng, nhưng bên trong cơ thể các tiểu bào đã bị thâm nhiễm các bạch cầu đơn nhân, các đại thực bào và các tế bào lympho T gây độc hoạt hoá Quá trình thâm nhiễm tự miễn này gọi là viêm đảo tụy theo cơ chế tự miễn, diễn biến kéo dài

và khi tế bào β tuyến tuỵ chưa bị phá huỷ nhiều, lượng insulin máu vẫn đủ cho nhu cầu hoạt động cơ thể, thì lâm sàng chưa biểu hiện gì, đây gọi là giai đoạn tiền ĐTĐ, diễn ra dài hay ngắn tuỳ theo từng cá nhân [33],[78] Khi tế bào β tuyến tuỵ bị phá huỷ càng nhiều thì lượng insulin sản xuất ra không đáp ứng đủ nhu cầu hoạt động của cơ thể làm cho glucose huyết tăng lên, lúc này bệnh biểu hiện rõ ràng

1.3.4.2 Cơ chế sinh bệnh ĐTĐ type 2 (ĐTĐ không phụ thuộc insulin)

Mặc dù ĐTĐ type 2 (còn gọi là NIDDM) thường gặp hơn (chiếm 80- 90% người bệnh) và có tính quy tụ gia đình Hai yếu tố đóng vai trò quan trọng trong cơ chế sinh bệnh ĐTĐ type 2 là khiếm khuyết chức năng tế bào β tuyến tuỵ và hiện tượng kháng insulin, hai yếu tố này tác động qua lại lẫn nhau [3], [30],[33],[68],[78] Giữa hai yếu tố này, yếu tố nào chiếm ưu thế và yếu tố nào xuất hiện trước cho đến nay vẫn chưa xác định được [3], [41], [78] Cùng với yếu tố môi trường như chế độ ăn uống sinh hoạt, BP cũng làm thúc đẩy và phát triển bệnh vì đã có nhiều bằng chứng cho thấy từ 70-80% bị ĐTĐ type 2 liên quan chặt chẽ tới triệu chứng BP [34],[35],[54],[68] Sinh bệnh ĐTĐ type

2 diễn biến qua 3 giai đoạn như sau [78]:

- Giai đoạn 1: Mặc dù nồng độ glucose trong máu vẫn ở mức bình thường, nhưng có hiện tượng kháng insulin vì mức insulin tăng cao hơn mức bình thường trong máu

- Giai đoạn 2: Tình trạng kháng insulin có xu hướng tăng nặng dần và xuất hiện tăng glucose huyết sau bữa ăn

- Giai đoạn 3: Sự kháng insulin không thay đổi, nhưng bài tiết insulin suy giảm và tăng glucose huyết lúc đói, bệnh ĐTĐ biểu hiện ra ngoài

BP là một trong những nguyên nhân đóng vai trò thúc đẩy sự phát triển bệnh được đề cập nhiều nhất Chính BP làm gia tăng tình trạng kháng insulin [41] Nhiều bằng chứng cho thấy các biện pháp giảm BP cũng làm giảm đáng

kể tình trạng kháng insulin và kiểm soát tốt nồng độ glucose huyết [34], [72] 1.3.5 Cách phòng và điều trị đái tháo đường

Phòng bệnh: Trừ nguyên nhân di truyền thì ăn uống, sinh hoạt hợp lí điều

độ và khám sức khoẻ định kì là phương thức chung để phòng bệnh nói chung

và ĐTĐ nói riêng

Điều trị: Để điều trị ĐTĐ có kết quả thì trước hết phải tìm hiểu đặc điểm

bệnh nhân, mắc ĐTĐ type 1 hay type 2, từ đó điều trị bằng cách kết hợp giữa

3 yếu tố là chế độ ăn uống, luyện tập và dùng thuốc hợp lí [3], [28] Dựa vào

cơ chế tác dụng mà các loại thuốc điều trị ĐTĐ được chia thành 3 nhóm chính:

1.3.5.1 Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin

Insulin: Là hormone do tế bào β của tuyến tuỵ bài tiết, đóng vai trò chủ yếu

trong cơ chế điều hoà glucose huyết của cơ thể Cấu tạo insulin gồm 2 chuỗi polypeptide: chuỗi A có 21 amino acid, chuỗi B có 30 amino acid, được nối với nhau bằng hai cầu S-S Các amino acid trong chuỗi thay đổi theo loài Sự khác biệt cơ bản giữa insulin người, insulin lợn và insulin bò là các amino

acid ở vị trí số 8, 9, 10 của chuỗi A

Cơ chế bài tiết insulin: dưới tác dụng của các chất kích thích bài tiết insulin

(các amino acid, glucose, alcol) đặc biệt là glucose, các tế bào β tuyến tuỵ bài tiết insulin Quá trình bài tiết insulin gồm 2 pha, pha đầu xuất hiện nhanh và tồn tại vài phút, pha sau xuất hiện chậm và kéo dài hơn Sự xuất hiện insulin này có liên quan ít nhât đến 2 con đường truyền tín hiệu, con đường phụ thuộc vào kênh K- ATP và con đường không phụ thuộc kênh K- ATP Ở con đường thứ nhất, sự chuyển hoá tăng cường glucose trong cơ thể dẫn đến tăng tỉ lệ ATP/ADP trong tế bào làm kênh K+ nhạy cảm với ATP (KATP) đóng lại gây khử cực tế bào và hoạt hoá kênh Ca2+ phụ thuộc điện thế, Ca2+ ồ ạt tràn vào tế bào làm khởi động việc chuyển các hạt insulin đến bề mặt tế bào và giải phóng insulin ra ngoài

Ngoài ra có các thuốc như:

Các sunfonylurea: Được tìm ra năm 1942, ngày nay đã có nhiều thuốc

sunfonylurea ra đời bao gồm các thuốc thế hệ I (tolbutamin, chlorpropamid)

và các thuốc thế hệ II (glyburide, glypisid) Thuốc này không có tác dụng với bệnh nhân cắt tuỵ hoặc ĐTĐ type 1

Nateglinid (starlix): Kiểm soát glucose sau bữa ăn nên kiểm soát được tình

trạng tăng glucose sau bữa ăn của bệnh nhân ĐTĐ type 2

1.3.5.2 Các thuốc làm tăng độ nhạy cảm của mô đích với insulin

Các biguanid: Thuốc thuộc nhóm này gồm các thuốc như metformin,

phenformin và buformin Nhóm thuốc này chống tăng glucose huyết Hiện nay metformin là thuốc sử dụng rộng rãi nhất vì ít gây tăng acid lactic máu hơn

Các thuốc nhóm thiazolidinedion: Nhóm này bao gồm rosiglitazon và

pioglitazon Tác dụng chung của nhóm này là cải thiện tình trạng kháng insulin, tăng tổng hợp glycogen và làm giảm sản xuất glucose ở gan Hiện nay

2 loại thuốc này đang rất có triển vọng trong điều trị ĐTĐ type 2

1.3.5.3 Thuốc chống tăng glucose huyết sau bữa ăn (thuốc ức chế enzime α-glucosidase)

Acarbose là thuốc ức chế enzime α-glucosidase của tế bào niêm mạc ruột nên làm giảm hoặc chậm quá trình hấp thụ tinh bột, tránh được tăng glucose huyết sau bữa ăn

1.3.6 Đái tháo đường với y học cổ truyền

Theo quan niệm của Đông y thì bệnh ĐTĐ thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều Do ăn nhiều chất béo, cay, ngọt sẽ làm mất cân bằng âm dương trong cơ thể, tạo thành hoả nhiệt, uất nhiệt làm phần âm của phủ tạng như âm, vị, thận bị hao tổn Hoả nhiệt làm phế hư gây chứng tiêu khát, vị âm gây chứng gầy đói, thận âm hư gây chứng tiểu nhiều và tiểu ra đường Xuất phát từ quan niệm trên, nên phương pháp điều trị chủ yếu là dưỡng âm, thanh nhiệt sinh tân dịch làm cơ

sở để lập lại cân bằng âm dương trong cơ thể [1], [2], [3], [7]

Các thuốc điều trị ĐTĐ của đông y chủ yếu là các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu như Sinh địa, Cỏ ngọt, Mướp đắng, Hoàng kỳ, Huyền sâm

1.4 Vài nét về cây Mắc mật (Châm châu)

Hình 1.1 Cây Mắc mật

1.4.2 Phân bố, sinh thái

Cây của Á châu nhiệt đới Phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaixia, Inđônêxia và Philippin Ở nước ta, cây mọc phổ biến từ Bắc vào Nam Thường gặp trên các đồi cây bụi, nương rẫy cũ Cũng thường được trồng trong vườn các gia đình miền núi Lá và vỏ thu hái quanh năm, hạt lấy ở những quả già, dùng tươi hay phơi khô

1.4.3 Đặc tính chữa bệnh của cây Mắc mật

Lá, vỏ và thân cây có vị đắng Lá dùng làm gia vị, có tác dụng tiêu viêm, sát trùng và trừ giun Lá dùng trị ho, trừ giun, ghẻ và mụn nhọt, đắp lên chân sưng đau do viêm khớp, trị loét mũi, nấu nước xông Vỏ cây và thân cây bổ

và làm se Vỏ cây dùng chữa đau bụng kém tiêu, ho đờm khản cổ Quả ăn được, có vị chua hơi ngọt; hạt hơi the có tác dụng trừ giun và làm chóng tiêu cơm Rễ cây băm nhỏ, nấu nước ngậm chữa đau cổ [6] Lá Mắc mật thơm nên được dùng quay vịt, lợn, quả có thể ăn tươi hay dùng ngâm ớt, kho thịt

Đơn thuốc: [6]

1 Tê thấp, đầu gối đau thì dùng lá tươi gĩ nát rồi trộn với giấm đắp

2 Ghẻ, mụn nhọt, thì dùng lá tươi giã với lá Đại bi lấy nước đặc bôi Dân gian còn dùng rễ băm nhỏ nấu nước ngậm chữa đau cổ không ăn uống được

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu thực vật

Vỏ cây Mắc mật (Clausena excavata Burm.f.), thu mẫu vào tháng 07 năm

2009 tại huyện Lục Ngạn - Bắc Giang

Xử lí mẫu: Vỏ tươi đem rửa sạch, băm nhỏ rồi sấy khô ở khoảng 50 oC, sau

đó đem nghiền thành bột mịn và bảo quản trong dung dịch ethanol 95o Mẫu thực vật được xác định theo tiến sĩ phân loại thực vật Võ Văn Chi [6]

2.1.2 Mẫu động vật

Chuột nhắt trắng (Mus musculus) chủng Swiss 4 tuần tuổi (14- 16 g/con) do

Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng 22- 25oC với chu kì 12h sáng, 12h tối

- Các dung môi: Ethanol 950, n-hexan, chloroform, ethylacetat

- Các hoá chất thử định tính, định lượng polyphenol tổng số

- Bản mỏng tráng sẵn Silicagel (Merck)

- STZ (streptozotocinz) Sigma, ST.Louse

- Bộ KIT định lượng insulin huyết thanh chuột nhắt bằng kĩ thuật ELISA 2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Quy trình chiết xuất

Vỏ cây mắc mật (1kg) khô nghiền nhỏ đem ngâm và chiết với ethanol 3 lần (Lần 1 ngâm 3 tuần, 2 lần sau ngâm trong 2 tuần) Sau đó gộp dịch chiết ở 3 lần lại, lọc 3 lần qua giấy lọc rồi đem cô thu cao cồn Cao cồn được hoà tan trong nuớc nóng rồi chiết lần lượt với các dung môi n- hexan, chloroform và ethylacetat, sau đó đem cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cao chiết tương ứng

2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hoá học của vỏ cây Mắc mật 2.2.2.1 Định tính một số hợp chất tự nhiên trong vỏ cây Mắc mật [33]

a Định tính Flavonoid: Pha mẫu thử trong ethanol với một lượng thích hợp Sau đó cho vài giọt HCl đặc vào, chia dung dịch nhận được vào hai ống nghiệm rồi tiến hành các thí nghiệm sau

- Phản ứng Shinoda:Cho mẫu vào hai ống nghiệm, một ống đối chứng, ống

kia thêm vài mảnh Mg và đun trên nồi cách thuỷ trong vài phút Phản ứng dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam

- Phản ứng diazo hoá: Cho mẫu vào hai ống nghiệm, một ống đối chứng,

ống 2 thêm vài giọt thuốc thử diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính

- Phản ứng với dung dịch kiềm: Cho mẫu vào hai ống nghiệm, một ống đối

chứng, ống 2 nhỏ thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng da cam

- Phản ứng với acid sunfuric: Cho dung dịch mẫu vào hai ống nghiệm, một

ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay màu nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron

b Phản ứng định tính catechin: Nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HCl đặc Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dương tính

c Định tính tannin:

- Phản ứng với vanilin: Dung dịch được pha như trên, cho vào 2 ống

nghiệm Ống 1 đối chứng, ống 2 nhỏ thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4 Phản ứng dương tính khi dung dịch thu được màu đỏ đậm

- Phản ứng với galetin/NaCl: Galetin 1% trong NaCl 10% Cho và giọt

thuốc thử 1ml dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện kết tủa

- Phản ứng acetate chì: Cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào dung

dịch mẫu, phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa

- Phản ứng với FeCl 3: Pha mẫu như trên rồi cho vào hai ông nghiệm, ống 1 đối chứng, ống 2 nhỏ thêm vài giọt thuốc thử FeCl3 1% trong nước Phản ứng dương tính khi dung dịch có mầu lục, tía, lam, xanh đen hay đen

d Định tính glucoside (Phản ứng keller- Killian)

- Thuốc thử:+ Dung dịch A: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vàd 50ml dung dịch acid acetic 10%

+ Dung dịch B: Thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml dung dịch acid sunfuric đặc

Cho 0,01g cặn dịch chiết vào ống nghiệm Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết mẫu, nghiêng ống nghiệm cho từ từ vào Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa hai lớp chất lỏng

e Định tính alkaloid

Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% với một lượng thích hợp

để làm các phản ứng Chia mẫu cho vào nhiều ống nghiệm, ống 1 đối chứng, ống 2 thử với các thuốc thử khác nhau

- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (Hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HCl): alkaloid cho kết tủa màu nâu sẫm

- Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (10g HgCl2 + 40g KI trong 1000ml nước cất): alkaloid phản ứng cho kết tủa màu trắng hay màu vàng nhạt

- Phản ứng với thuốc thử Đrogendorff

Dung dịch A: 17g Bi(NO3)3 + 400ml H2O = 100ml acetic đặc Dung dịch B: 200g KI trong 500ml nước

Trộn dung dịch A và B ta được dung dịch gốc Lấy 20ml dung dịch gốc +

100 ml nước cất + 20 ml acid acetic đặc ta được thuốc thử Drogendorf

Cho mẫu vào ống nghiệm (2ml), rồi cho vài giọt thuốc thử vào nếu thấy kết tủa mầu da cam thì kết luận là dương tính

2.2.2.2 Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên bằng sắc ký lớp mỏng

Chúng tôi tiến hành chạy sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn silicagen Merck Alufolien 60 F254 Hệ dung môi chạy sắc ký TEAF: 5:3:1:1 (toluen- ethylacetat- acetone- acid formic) Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% Xác định hệ số lưu (Rf) theo công thức: R= a/ b

Trong đó: + a - khoảng di chuyển của chất nghiên cứu

+ b - khoảng di chuyển của dung môi

2.2.2.3 Định lượng hợp chất polyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau [73]

Nguyên tắc dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin- Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic Các bước tiến hành như sau:

- Chuẩn bị mẫu định lượng và hoá chất:

+ Dung dịch acid gallic: 0,5g acid gallic + 10ml C2H5OH + 90ml H2O bảo quản lạnh Như vậy, dung dịch chuẩn acid gallic có nồng độ 5mg/ ml

+ Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800 ml H2O đun sôi Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất đến 100 ml

- Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic:

Chuẩn bị cóng định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0, 1, 2, 3,

5 và 10 ml sau đó dẫn nước cất tới 100 ml ta thu được các nồng độ 0, 50,100,

150, 250 và 500 mg/l acid gallic

Cho vào mỗi cuvert 20 µl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn) + 1,58 ml H2O + 100 µl thuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300 µl Na2CO3 Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 200C rồi xác định ở bước song 765 nm Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn

Bảng 2.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết đến trọng lượng và một số chỉ

Xác định LD50 của dịch chiết vỏ cây Mắc mật bằng đường uống theo phương pháp Lorke [52] Chuột nhịn đói trước 16h thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên và cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng (liều tối đa cho phép), theo dõi biểu hiện của số chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết từ vỏ cây Mắc mật

2.2.3.2 Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, mua về được chăm sóc bình thường trong

3-4 ngày để thích ứng với môi trường mới, sau đó tiến hành phân làm 2 nhóm với 2 chế độ nuôi khác nhau:

- Nhóm 1- Nhóm đối chứng: Các con chuột tiếp tục được chăm sóc bằng

thức ăn thường do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp

- Nhóm 2- Nhóm nuôi béo: Chuột được chăm sóc bằng chế độ ăn giàu chất

béo (lipid và cholesterol) được phối chộn từ các thực phẩm nhiều dinh dưỡng được tính toán với thành phần như bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần thức ăn giàu lipid

số chỉ số hoá sinh như: glucose máu; chỉ số lipid máu gồm cholesterol,

triglycerid, HDL-c, LDL-c, lipase để xác định mức độ khác nhau của các lô theo 2 chế độ ăn

2.2.3.3 Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết lên trọng lượng và một

số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm

Chuột BPTN được chia thành 5 lô, mỗi lô từ 6- 9 con và đem làm thí nghiệm tiếp để đánh giá tác dụng của các phân đoạn dịch chiết đến trọng lượng và một số chỉ số hoá sinh máu Cao của các phân đoạn dịch chiết được hoà vào nước nóng và cho chuột uống hàng ngày vào mỗi buổi sáng

Bảng 2.3 Mô hình nghiên cứu khả năng giảm béo của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ cây Mắc mật

Lô Chế độ ăn Điều trị 21 ngày (1000mg/kg) 1.Béo + EtOH Thức ăn giàu lipid Cao ethanol

2.Béo + n-hex Thức ăn giàu lipid Cao n-hexan

3.Béo + EtOAc Thức ăn giàu lipid Cao ethylacetat

4.Béo + Metf Thức ăn giàu lipid Metformin (500mg/kg thể trọng) 5.Béo + KĐT Thức ăn giàu lipid Nước muối sinh lí (KĐT)

Điều trị trong vòng 21 ngày, trọng lượng của các con chuột được kiểm tra hàng tuần, vào ngày 21 tiến hành xác định trọng lượng và lấy máu chuột đem phân tích một số chỉ số hoá sinh gồm glucose, cholesterol, triglycerid, HDL-c, LDL-c, lipase

2.2.4 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết từ vỏ cây Mắc mật

2.2.4.1 Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2

Chọn những con chuột béo phì thực nghiệm, cho nhịn đói 16h và kiểm tra đường huyết chuột Sau đó, tiến hành gây ĐTĐ type 2 trên chuột bằng cách tiêm vào màng bụng chuột STZ liều đơn (pha trong đệm citrate 0,01M, pH

=4,3) với liều lượng 110 mg/kg thể trong Nồng độ đường huyết những con chuột nào sau khi tiêm STZ 72h đạt ≥ 18mmol/l và ổn định thì được coi là ĐTĐ type 2 và chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo [74]

2.2.4.2 Thử khả năng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết

Chuột ĐTĐ type 2 được phân lô (6con/lô) cho ăn và điều trị hằng ngày bằng thuốc và các phân đoạn dịch chiết (1lần/ ngày) trong vòng 21 ngày như bảng 2.4

Bảng 2.4 Mô hình nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ cây Mắc mật

Lô Chế độ ăn Điều trị 21 ngày (1000mg/kg)

1.ĐTĐ + EtOH Thức ăn béo Cao ethanol

2.ĐTĐ + n-hex Thức ăn béo Cao n-hexan

3.ĐTĐ + EtOAc Thức ăn béo Cao ethylacetat

4.ĐTĐ + Metf Thức ăn béo Metformin (500mg/kg thể trọng)

5.ĐTĐ + KĐT Thức ăn béo Nước muối sinh lý (KĐT)

Sau khi cho uống thuốc và dịch chiết chúng tôi tiến hành đo đường huyết vào thời điểm 2h, 4h, 8h, 10h và ngày thứ 7, ngày 14, ngày 21 Đường huyết trong các trường hợp trên đều được đo sau khi cho chuột nhịn đói qua đêm (12h), chỉ cho uống nước

2.2.5 Phương pháp định lượng một số chỉ số hoá sinh trong máu

2.2.5.1 Định lượng glucose huyết [50]

Định lượng glucose máu bằng máy đo đường huyết tự động và bộ kít thử tương ứng (One Touch Ultra, Jonson & Jonson, USA)

Nguyên lý: Dựa trên phản ứng đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong

kít thử với glucose trong máu tạo thành axit gluconic và H2O2 (phản ứng 1)

H2O2 tạo thành được peroxidase phân huỷ giải phóng oxy, oxy hoá Dianisidin tạo phức chất màu vàng nâu (phản ứng 2)

Glucose + O2 glucose oxidase axit gluconic + H2O2 (1)

O-Dianisidin + H2O2 Phức hợp màu vàng + H2O2 (2) Cường độ màu được xác định theo phương pháp đo quang tương ứng với lượng glucose trong máu cần định lượng

2.2.5.2 Định lượng trigycerid huyết thanh [5],[19]

Nguyên lý: Thuỷ phân trigycerid bằng enzyme lipase, định lượng glycerol

giải phóng ra bằng phương pháp so màu của quinonimin tạo thành từ aminoantiprin và 4-cholorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:

Triglycerid   Lipase Glycerol + acid béo

Glycerol + ATP  GK Glycerol-3-photphate + ADP Glycerol-3-photphate + O2 GOD   Dihydroxyaceton photphate + H2O2

H2O2 + Aminoantipyrine + 4-cholorophenol POD Quinoneimine + 4HCl + 4 H2O

Kết quả: Đo mặt độ quang học quinoneimine ở bước sóng 500nm rồi so với

màu chuẩn

2.2.5.3 Định lượng cholesterol toàn phần trong huyết thanh [5],[19]

Nguyên lý: Thuỷ phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase

(CHE) và oxy hoá bằng cholesterol oxydase (CHO) Đo mặt độ quang quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxydase (POD) theo phản ứng:

Cholesterol este + H2O CHE   Cholesterol + acid béo

Cholesterol + O2 CHO   Cholesterol-3-one + H2O2

H2O2 + 4-aminophenazone + Phenol  POD Quinoneimine + 4H2O

Kết quả: Đo mặt độ quang học quinoneimine ở bước sóng 500nm rồi so với

màu chuẩn

2.2.5.4 Định lượng HDL-c

Nguyên tắc: Xét nghiệm gồm hai bước đặc hiệu Bước thứ nhất cholesterol

trong chylomicron, VLDL-c, LDL-c bị loại bỏ và phá huỷ bằng các phản ứng enzyme đặc hiệu Bước thứ hai cholesterol trong HDL-c được định lượng bằng phản ứng enzyme với sự có mặt của chất surfactant đặc hiệu cho HDL-c Bước 1:

Chylomicron, VLDL-c, LDL-c CHE + CHO Cholesterol + H2O Điều kiện đặc biệt

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Quy trình tách chiết các phân đoạn từ vỏ cây Mắc mật

Quy trình tách chiết có ảnh hưởng quan trọng đến việc phân lập các hợp

chất tự nhiên trong thực vật Qua tham khảo các tài liệu chúng tôi lựa chọn

quy trình tác chiết được mô tả như ở hình 3.1

Phân lớp n-hex Phân lớp nước

Cô loại dung môi Chiết phân đoạn 3 lần với chloroform (1:1)

Phân lớp Chl Phân lớp nước

Cô loại dung môi Chiết 3 phân đoạn 3 lần với ethylaceta (1:1)

Phân lớp EtOAc Phân lớp nước

Cô loại dung môi Cô loại dung môi

Hình 3.1.Quy trình tách chiết các hợp chất tự nhiên từ vỏ cây Mắc mật

Sau khi chiết mẫu 3 lần trong ethanol, thu hồi dịch chiết lọc qua giấy lọc 3

lần và đem cô được cao cồn tổng số Hoà tan cao cồn trong nước cất đun nóng

và tiến hành chiết phân lớp lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần

như sau: n-hexan, chloroform, ethylacetat Các dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được các cao phân đoạn n-hexan, chloroform, ethylacetat và phân đoạn nước Kết quả của quy trình chiết tách cao các phân đoạn của vỏ cây Mắc mật được trình bầy trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Hiệu suất điều chế các phân đoạn từ vỏ cây Mắc mật

Phân đoạn Trọng lượng khô

không khí (g)

Trọng lượng khô tuyệt đối (g)

Hiệu suất chiết (% nguyên liệu khô)

3.2.1 Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong vỏ cây Mắc mật

Sử dụng các thuốc thử đặc trưng cho từng nhóm hợp chất tự nhiên chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhằm xác định thành phần các hợp chất tự nhiên có trong phân đoạn ethanol, phân đoạn n-hexan, phân đoạn chloroform, phân đoạn ethylacetat, phân đoạn nước, thu được kết quả trình bầy trong bảng 3.2