Nghiên cứu đặc điểm và điều kiện lên men sinh tổng hợp nattokinase của vi khuẩn bacillus subtilis natto 5

`Mục Lục `MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Bệnh nghẽn mạch huyết khối 1.1.1 Khái niệm huyết khối 1.1.2 Sự hình thành cục máu đơng phát triển xơ vữa động mạch 1.1.3 Cơ chế hình thành huyết khối 1.1.4 Sự phân hủy huyết khối enzyme nội sinh plasmin 1.2.1 Nguồn gốc đặc tính nattokinase 1.2.2 Cơ chế hoạt động Nattokinase 1.2.3 Ứng dụng Nattokinase 11 1.2.4 Nguồn gốc thu nhận Nattokinase 12 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nattokinase ngồi nước 12 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nattokinase nước 13 1.4 Bacillus số đặc điểm chung Bacillus subtilis 14 1.4.1 Hệ thống phân loại 14 1.4.2 Phân bố 15 1.4.3 Hình thái 15 1.4.4 Cấu trúc 15 1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển vi sinh vật 16 1.5.1 Ảnh hưởng nguồn Cacbon 16 1.5.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 16 1.5.3 Nguồn muối khoáng chất sinh trưởng 16 1.6 Đậu tương 17 1.6.1 Thành phần hóa học 17 1.6.2 Thành phần dinh dưỡng Đậu tương 18 K18-CNSH Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Chủng giống 19 2.1.2 Hóa chất 19 2.1.4 Môi trường 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học 21 2.2.2 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào 23 2.2.3 Phương pháp định tính, định lượng protease nattokinase 23 2.2.4 Nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp nattokinase từ chủng Bacillus subtilis Natto 24 2.2.5 Nghiên cứu động thái trình lên men sinh tổng hợp nattokinase chủng Natto bình tam giác 25 Phần 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Nghiên cứu dặc điểm sinh học chủng Bacillus subtilis Natto 26 3.1.1 Đặc điểm nuôi cấy chủng Bacillus subtilis Natto 26 3.1.2 Đặc điểm hình thái kính hiển vi quang học Chủng Bacillus subtilis Natto 26 3.1.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa chủng Bacillus subtilis Natto 27 3.2 Điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp nattokinase chủng Natto 29 3.2.1 Lựa chọn môi trường lên men 29 3.2.2 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh tổng hợp nattokinase 30 3.2.3.Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 31 3.2.4.Ảnh hưởng độ thơng khí nuôi cấy tới sinh tổng hợp nattokinase 32 3.2.5 Ảnh hưởng tỷ lệ giống tới sinh tổng hợp nattokinase 33 3.3 Nghiên cứu động thái trình lên men sinh tổng hợp enzym nattokinase chủng natto bình tam giác 34 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 K18-CNSH K18-CNSH MỞ ĐẦU Tắc nghẽn mạch (thrombosis) tình trạng đọng mạch máu với cục máu đơng, dẫn tới nhồi máu tim cấp tính đột quỵ thiếu máu cục bộ, hai dẫn tới tử vong Theo Tổ chức Y tế giới (WHO), hàng năm có khoảng 17 triệu người chết bệnh tim mạch (nhồi máu tim, đột quy), mà nguyên nhân hậu chứng huyết khối Theo ước tính thị trường tồn cầu thuốc làm tan huyết khối gần 14 tỷ USD [15] Các loại thuốc làm tan huyết khối Alteplase (t-PA), Streptokinase, Urokinase (UK), Tenecteplase… có hiệu lực tức sau tiêm tĩnh mạch Tuy nhiên hiệu lực hoạt động sinh học loại thuốc tồn không lâu sau tiêm, giá đắt, đồng thời có nguy biến chứng gây xuất huyết Nattokinase enzyme có sản phẩm natto Nhật Bản Nattokinase protease chuỗi đơn chứa 275 amino acid (trọng lượng phân tử 27,727 Da) Hyroyuki Sumi phát khả làm tan huyết khối năm 1980 [38] Nó khơng làm giảm fibrin trực tiếp, mà cịn thúc đẩy tế bào để phát triển mô plasminogen activator để phân huỷ fibrin Hiện nay, nattokinase áp dụng chủ yếu thành phần thực phẩm chức năng, khả ứng dụng loại thuốc nghiên cứu [31] So với thuốc tan huyết khối lâm sàng (urokinase streptokinase), nattokinase thực phẩm chức sở hữu nhiều ưu điểm, chẳng hạn an tồn, chi phí thấp, uống dễ dàng Vì vậy, phát triển sản phẩm nattokinase liên quan thu hút quan tâm đặc biệt toàn giới Do có nguồn gốc thực phẩm, nên dễ chấp nhận mặt y tế, người tiêu dùng sử dụng chế phẩm nattokinase thực phẩm chức để phịng bệnh huyết khối Hoạt tính làm tan huyết khối nattokinase tương đối mạnh, kéo dài, giảm chứng cao huyết áp, phân giải protein dạng amyloid liên quan đến bệnh Alzhemer, bệnh bò điên [35], tăng cường hoạt hóa plasminogen làm bất hoạt plasminogen activator inhibitor [39] Nhiều chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân lập từ loại thực phẩm lên men truyền thống nguồn giống quan trọng có K18-CNSH khả sản xuất enzym làm tan huyết khối, B natto phân lập từ thực phẩm Natto, Nhật [17], Bacillus subtilis LSSE-22 từ Bắc Kinh, Trung Quốc [45], , Bacillus sp CK 11-4 từ Chungkook-Jang Bacillus sp DJ-4 từ Doe-Jang, Hàn Quốc [23] Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch cục máu đông (thrombus) chứng nhồi máu tim hay nhồi máu não tăng cao Việt Nam giới Vì vậy, nattokinase quan tâm nghiên cứu sản xuất sử dụng rộng rãi để phòng ngừa bệnh nghẽn động mạch cục máu đông [32] Cho nên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm điều kiện lên men sinh tổng hợp nattokinase vi khuẩn Bacillus subtilis Natto 5” Đề tài thực phịng Cơng nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam gồm nội dung sau: - Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa chủng natto - Lựa chọn mơi trường thích hợp cho chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto sinh tổng hợp nattokinase - Lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Natto sinh tổng hợp nattokinase - Nghiên cứu động thái trình lên men sinh tổng hợp enzym chủng Bacillus subtilis Natto bình tam giác K18-CNSH PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Bệnh nghẽn mạch huyết khối Tắc nghẽn mạch (thrombosis) tình trạng ứ đọng mạch máu với cục máu đơng, dẫn tới nhồi máu tim cấp tính đột quỵ thiếu máu cục bộ, hai dẫn tới tử vong Khác với việc can thiệp phẫu thuật để lấy thông tắc nghẽn tạo mạch phụ để cấp máu, có cách xử lý uống thuốc thông tắc để phân hủy cục máu đông [32] Streptokinase lựa chọn [25] Ngoài nattokinase quan tâm nghiên cứu sản xuất sử dụng rộng rãi để phòng ngừa bệnh nghẽn động mạch cục máu đông 1.1.1 Khái niệm huyết khối Huyết khối tượng máu đông thành động mạch hay tĩnh mạch nằm sâu bên thể gây tượng như: nhồi máu tim, đột quỵ…và nguy hiểm dẫn đến tử vong đột ngột Sự hình thành huyết khối liên quan đến tổn thương lớn lớp tế bào nội mơ, kết dính – gần tiểu cầu hoạt hóa thrombin Ngồi thành phần của tụ huyết khối phụ thuộc vào số yếu tố khác mức độ tổn thương mạch máu, áp lực bao sức, diện thuốc kháng huyết khối [28] 1.1.2 Sự hình thành cục máu đơng phát triển xơ vữa động mạch Sự tiến triển xơ vữa động mạch trình đa chiều Một bệnh nhân đơn giản xuất huyết khối cục cục máu đông động mạch vành làm cho trái tim bị tổn thương; nhánh động mạch cảnh gây đột quỵ; chi tĩnh mạch gây tắc mạch phổi Huyết khối phát triển trì thơng qua tích tụ nhiều sợi fibrin lớp niêm mạc mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu tập trung vào vùng bị thương để tạo thành nút tiểu cầu Các yếu tố đông máu thể kích hoạt, mạng lưới fibrin hình thành tạo nên cục máu đông K18-CNSH Cục máu đơng hình thành động mạch, tĩnh mạch buồng tim Huyết khối động mạch hình thành áp lực cao dịng chảy cấu tạo tiểu cầu tập hợp liên kết với sợi fibrin Các cục máu đông tĩnh mạch hình thành điều kiện dịng chảy thấp, cấu tạo chủ yếu tế bào màu đỏ với vài tiểu cầu chứa lượng lớn xen kẽ sợi fibrin Những huyết khối có tĩnh mạch Tuy nhiên, cục máu đơng di động bị tắc nghẽn Nếu cục máu đông từ tĩnh mạch chi đến phổi, kết gây nên nghẽn mạch phổi Tương tự vậy, cục máu đông di chuyển từ tim động mạch lên não, gây đột quỵ Cuối cùng, có cục máu đơng đến vị trí làm tắc hay khối động mạch vành, gây nhồi máu tim Có nhiều giả thuyết khác liên quan đến hình thành mạch làm tắc nghẽn mạch dẫn đến đau tim đột quỵ Nó thường chấp nhận rằng, động mạch cứng lại hấp thụ, tiểu cầu tăng lên Quá trình trở nên tồi tệ fibrin dư thừa Tiểu cầu tăng trưởng có nguồn gốc từ yếu tố tăng trưởng gây tế bào trơn thành động mạch để phát triển Các tế bào trơn có kết tăng tính thấm đển tiểu cầu lipid, đặc biệt lipoprotein mật độ thấp (LDL) Như LDL tăng, thâm nhập thêm vào thành động mạch Mảng bám thành động mạch ung thư lành tính tăng trưởng (một đột biến đơn dòng) Fibrin dư thừa, gốc tự do, viêm mãn tính, cholesterol bị oxy hóa, oxy hóa LDL, hydrocarbon mơi trường yếu tố khác làm tăng thêm đột biến [29] Theo giả thuyết gốc tự peroxit lipid gây tổn thương động mạch thẩm thấu thành mạch, tăng thêm oxy hóa lipid, đặc biệt LDL Các gốc tự xâm nhập vào thành động mạch kích hoạt gia tăng tế bào bất thường chép tế bào Các tế bào đột biến di chuyển vào thành động mạch gây hình thành mảng bám Tăng sinh tế bào làm tăng phát triển cục máu đông xung quanh hình thành huyết khối Kháng thể tế bào T điều chỉnh trình Kết tổn thương xơ vữa động mạch chủ yếu từ biến đổi huyết khối tế bào trơn, LDL fibrin K18-CNSH Trong tự nhiên, nattikinase làm tan huyết khối cục tạo tế bào nội mô mạch máu Đối với người già việc sản xuất enzym chậm lại máu dễ bị đông lại hơn, điều gây đông máu Tuy nhiên, cục máu đơng hình thành lứa tuổi Do đó, người trẻ tuổi cần phải dự phịng tìm hiểu rõ bệnh này, khuyến kích người trẻ tuổi xem xét việc sử dụng sản phẩm natto nattokinase để phòng ngừa [29] 1.1.3 Cơ chế hình thành huyết khối Thrombin đóng vai trị trung tâm hình thành huyết khối,h oạt động cầu nối hoạt hóa tiểu cầu q trình đơng máu Thrombin chuyển fibrinogen thành finbrin, tham gia vào thành phần cục huyết khối với vai trị khung cho gia tăng kích thước cục huyết khối Yếu tố VIII thrombin hoạt hóa có vai trị cấu thành sợi dây nối finbrin giúp cho cục máu ổn định bề chặt Thrombin đóng vai trị trung gian q trình polymer hóa fibrin, dẫn đến hình thành finbrin I finbrin II [28] Sự hình thành finbrin qua trung gian thrombin xảy đồng thời với q trình hoạt hóa tiểu cầu nhiều chế Thrombin hoạt hóa theo hai đường nội sinh ngoại sinh cách sử dụng thụ thể màng tiểu cầu phospholipid-yếu tố V yếu tố VIII tác động với phospholipid mang tiểu cầu để hoạt hóa yếu tố X thành Xa chuyển prothrombin thành thrombin bề mặt tiểu cầu Phức hợp tiểu cầu thrombin- yếu tố V có vao trị thụ thể tiểu cầu có lực cao với yếu tố Xa Hậu tốc đọ thối hóa thrombin tăng lên rõ rệt tác động ngược lại làm thúc đẩy hình thành mạng lưới finbrin Quá trình dẫn đến chuyển đổi plasminogen thành plasmin hoạt hóa hệ thống lý giải huyết khối nội sinh [28] 1.1.4 Sự phân hủy huyết khối enzyme nội sinh plasmin Thành phần tiểu cầu- finbrin huyết khối bị phụ thuộc vào dòng chảy chỗ áp lực bao Huyết khối với thành phần chủ yếu tiểu cầu thường xảy K18-CNSH dòng chảy động mạch, thối hóa yếu tố đông máu thường xảy áp lực bao thấp hơn, đặc trưng dòng máu chảy tĩnh mạch Điều cho thấy rằng, hiệu dược tính lý giải huyết khối phụ thuộc vào thành phần finbrin mức độ mạng lưới finbrin Trong hệ thống tuần hồn, chất hoạt hóa plasmingen mơ chuỗi chất hoạt hóa plasmingen urokinase chuỗi hai chất giúp chuyển hóa plasminogen thành plasmin 1.2 Giới thiệu nattokinase Hiện hay, tỉ lệ mặc bệnh nghẽn động mạch cục máu đông chứng nhồi máu tim hay nhồi máu não tăng vô nhanh Việt Nam giới Vì vậy, nattokinase quan tâm nghiên cứu sản xuất sử dụng rộng rãi để phòng ngừa bệnh nghẽn động mạch cục máu đông [32] Nattokinase enzyme làm tan huyết khối tìm thấy loại đậu lên men Natto- ăn truyền thống người Nhật năm 1980 Nattokinase có tác dụng làm tan cục máu đơng vốn nguy gây tắc mạch máu dẫn đến tai biến, đột quỵ Enzym làm giảm nguy gây tắc mạch máu dẫn đến tai biến, đột qụy [30] 1.2.1 Nguồn gốc đặc tính nattokinase Nattokinase phát vào năm 1980 Tiến sĩ Hiroyuki Sumi, nhà nghiên cứu Đại học Chicago sau thử nghiệm 173 loại thực phẩm tự nhiên tác nhân tiêu sợi huyết đặc hiệu, ông tìm kiếm tác nhân tự nhiên mà hiệu hòa tan huyết khối tim mạch máu gây nên bệnh nhồi máu tim hay tắc mạch máu [16] Nattokinase phát Natto, giống dạng thực phẩm mát lên men sử dụng Nhật Bản 1000 năm Natto ăn truyền thống Nhật Bản làm từ đậu nành Để chuẩn bị cho đậu nấu chín sau tác động loại vi khuẩn Bacillus subtilis ssp natto lên men [17] K18-CNSH Trong trình hình thành chất nhầy chất gây liên kết cho đậu Trong phương pháp truyền thống, người ta lên men đậu tương từ vi khuẩn rơm rạ Trong trình sản xuất đại, chủng vi khuẩn nuôi cấy đậu tương, mà việc sử dụng rơm rạ khơng cịn cần thiết [20] Các nguồn thực vật cho nattokinase Glycine max (L.) Merr (tất họ đậu) Nó xuất loại bột mịn màu trắng-vàng [30] Hình 1.1 Natto theo truyền thống gói rơm rạ Nattokinase loại enzym coi phương thuốc hứa hẹn cho chữa bệnh huyết khối hoạt tính tiêu sợi huyết mạnh [38] Nattokinase sử dụng cho bệnh tim mạch bao gồm bệnh tim, cao huyết áp, đột qụy, đau ngực (đau thắt ngực), huyết khối tĩnh mạch sâu, xơ cứng động mạch (xơ vữa động mạch), bệnh trĩ, giãn tĩnh mạch, tuần hoàn kém, bệnh động mạch ngoại biên [ 30] Nó sử dụng để giảm đau, đau xơ cơ, hội chứng mệt mỏi mãn tính, viêm màng con, u xơ tử cung, co thắt cơ, vô sinh, ung thư bệnh tê phù thiếu vitamin B1 [42] K18-CNSH phút Sau tiến hành nhuộm Gram Tiêu quan sát kính hiển vi quang học dịch nuôi cấy quan sát kính hiển vi điện tử quyét, nhằm xác định hình dạng tế bào chủng Bacillus subtilis Natto Kết thể hình 3.1 a c b Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng Natto a, Khuẩn lạc; b, Tế bào nhuộm Gram kính hiển vi quang học (x1000) c, kính hiển vi điện tử quét (x 5000) 3.1.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa chủng Bacillus subtilis Natto Chủng Natto vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, ưa ấm, sinh bào tử, có dạng hình que dài tế bào thường đứng riêng rẽ (Hình 3.1a) Chủng Natto sinh trưởng tốt 20-45°C, pH 5-10 tối ưu 37°C, pH 7,0 Chủng có khả sinh trưởng nồng độ muối NaCl 6%, sinh enzym ngoại bào protease Kết nghiên cứu số đặc điểm sinh hóa dựa kít API 50 CHB chủng Natto thể Bảng 3.2 Từ đặc điểm sinh lý, sinh hóa xác định chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus ST Nguồn T cacbon Đối chứng Khả sử dụng - ST Nguồn T cacbon 25 Esculin Khả sử dụng - Glycerol + 26 Salixin + Erythritol - 27 Xelobiose - D-Arabinose - 28 Mantose + L-Arabinose - 29 Lactose - Ribose + 30 Melibiose - K18-CNSH 27 D- Xylose - 31 Saccarose + L- Xylose - 32 Trehalose + Adonitol - 33 Inulin - - 34 Melezitose - 10 -Metyl-DGlucozit Galactose - 35 Rafinose - 11 Glucose + 36 Tinh bột + 12 Fructose + 37 Glycogen - 13 Manose + 38 Xylitol - 14 Sorbose - 39 Gentiobiose - 15 Rhamnose - 40 D-Turanose - 16 Dulxitol - 41 D-Lyxose - 17 Inozitol - 42 D-Tagatose - 18 Mannitol - 43 D-Fucose - 19 Sorbitol - 44 L-Fucose - 20 - 45 D-Arabitol - - 46 L-Arabitol - + 47 Gluconat + 23 -Metyl-DManozit -Metyl-DGlucozit N-AxylGlucosemin Amygdalin - 48 - 24 Arbutin + 49 2ketogluconat 5ketogluconat 21 22 Chú thích: (+) dương tính; ( -)âm tính - Bảng 3.2 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng Natto (Xác định kit 50 CHB (BioMérieux, Pháp) K18-CNSH 28 Hình 3.2: Khả sử dụng nguồn cacbon chủng Natto kit 50 CHB (BioMérieux, Pháp) Từ kết bảng 3.2 hình 3.2 cho thấy, chủng Bacillus subtilis Natto phát triển mơi trường có chứa Glycerol, Ribose, Glucose, Fructose, Manose, NAxyl-Glucosemin, Arbutin, Salixin,Mantose,Trehalose, Saccarose, tinh bột Gluconat Tuy nhiên chủng Natto khơng phát triển mơi trường có chứa nguồn cácbon cịn lại 3.2 Điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp nattokinase chủng Natto 3.2.1 Lựa chọn môi trường lên men Chất dinh dưỡng bao gồm nguồn cacbon, nguồn nitơ muối khoáng vitamin nguyên liệu cung cấp cho trình sinh tổng hợp chất, enzym tạo thành phần tế bào phục vụ cho trình trao đổi lượng vi K18-CNSH 29 sinh vật Do vậy, việc tìm mơi trường thích hợp với nồng độ chất quan trọng tìm tỷ lệ cacbon/nitơ để q trình lên men thu lượng enzym proteaza kiềm cao nhiệm vụ quan trọng đề tài Trong đề tài lựa chọn số môi trường cho trình sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilis Natto Kết thể hình 3.3 Hình 3.3 Khả sinh nattokinase Bacillus subtilis Natto5 số mơi trường Kết hình 3.4 cho thấy, thành phần mơi trường có tác động lớn đến khả sinh tam huyết khối chủng Bacillus subtilis Natto Chúng có khả tổng hợp enzym tất mơi trường thí nghiệm, nhiên tổng hợp nattokinase cao môi trường MT2 cho lượng huyết khối tan 7,12 g/ml Do vậy, môi trường lựa chọn môi trường thích hợp 3.2.2 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh tổng hợp nattokinase Để đánh giá ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy ban đầu lên sinh trưởng sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilis Natto 5, dịch tế bào nuôi cấy môi trường MT2 nhiệt độ 35oC, 200 vòng/phút với giá trị pH 6; 6,5; 7; 7,5 Sau 48 xác định khả tan huyết khối hoạt tính protease K18-CNSH 30 Hình 3.4 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilis Natto Khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzym chủng Bacillus subtilis Natto phụ thuộc nhiều vào pH ban đầu môi trường lên men Chủng Bacillus subtilis Natto nuôi môi trường pH 7,5 cho hoạt tính protease cao 11,15 U/ml khả hịa tan huyết khối tốt (7,3 g/ml) (Hình 3.4) Trong mơi trường pH 6,5, khả hịa tan khối huyết giảm mạnh khoảng 6072% so với pH tối ưu, môi trường pH lượng huyết khối giảm nhẹ so với pH tối ưu Như vậy, chủng Natto có khả hịa tan khối huyết sinh tổng hợp enzym tốt dải pH trung tính kiềm, mơi trường acid chúng phát triển sinh tổng hợp enzym giảm mạnh Kết tương đồng với số nghiên cứu cho rằng, hầu hết chủng Bacillus subtilis NCIM 2724; Bacillus subtilis natto Bacillus subtilis NLSSE sinh tổng hợp nattokinase tốt mơi trường trung tính kiềm [27, 34, 47] 3.2.3.Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy Để xác định nhiệt độ tốt cho trình sinh nattokinase chủng Bacillus subtilis Natto 5, thay đổi nhiệt độ lên men ban đầu: 25, 30, 35, 37°C K18-CNSH 31 48 giờ, pH 7,5 lắc 200 vịng/phút, sau xác định khả tan huyết khối hoạt tính protease Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy tới sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilis Natto Chủng sinh hoạt tính cao khoảng nhiệt độ 30-37ºC (Hình 3.5) Nhiệt độ thích hợp cho q trình sinh tổng hợp nattokinase 35C đạt 11,15 U/ml (hoạt tính protease) khả hòa tan huyết khối tốt (7,3 g/ml dịch lên men) Khi so sánh nhiệt độ phát triển sinh nattokinase chủng Bacillus subtilis Natto với chủng Bacillus subtilis natto, B subtilis LD-8, B subtilis Bacillus natto khác số nghiên cứu trước đây, nhận thấy phần lớn chủng sinh trưởng sinh enzym điều kiện nhiệt độ từ 30–37°C, nhiệt độ tối ưu cho sinh nattokinase so với chủng B subtilis [11], thấp chủng Bacillus subtilis natto [47], B subtilis LD-8 [44], B subtilis [43] chủng phát triển tốt 37°C 3.2.4.Ảnh hưởng độ thơng khí ni cấy tới sinh tổng hợp nattokinase Oxy yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật hiếu khí q trình trao đổi chất tế bào Lượng dịch lên men chiếm 25% so với thể tích bình lên men thích hợp cho sinh K18-CNSH 32 tổng hợp nattikinase chủng nghiên cứu, hoạt tính enzym thu sau 48 ni cấy đạt 11,54 U/ml (hoạt tính protease) khả hòa tan huyết khối tốt (7,37 g/ml dịch lên men) (Hình 3.6) Hình 3.6 Ảnh hưởng độ thơng khí ni cấy tới sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilis Natto Lượng dịch ni nhiều 25% ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp nattokinase Chẳng hạn, thể tích ni 10% hoạt tính nattokinase thu 5,77 U/ml (hoạt tính protease) khả hịa tan huyết khối tốt (5,3 g/ml dịch lên men) Nếu tăng lượng dịch mơi trường lên đến 30% thể tích bình tam giác, lượng khí cấp vào khơng sinh trưởng chủng vi sinh vật mà kéo theo khả sinh tổng hợp enzym giảm đáng kể, đạt 10,84 U/ml (hoạt tính protease) khả hòa tan huyết khối tốt (7,15 g/ml dịch lên men) Do vậy, chúng tơi chọn độ thơng khí cho sinh tổng hợp enzym chủng Bacillus subtilis Natto Vdịch ni/Vbình 25% (v/v) 3.2.5 Ảnh hưởng tỷ lệ giống tới sinh tổng hợp nattokinase Để nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến trình sinh nattokinase, cố định điều kiện tối ưu lựa chọn nghiên cứu pH, nhiệt độ K18-CNSH 33 thay đổi tỷ lệ giống thay đổi từ (%) 1; 3; 5; 7; 11 Kết trình bày hình 3.7 Hình 3.7 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến khả sinh enzym nattokinase chủng Bacillus subtilis Natto Qua kết hình 3.8 cho thấy, tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp enzym, tỷ lệ tiếp giống 3-7% cho hoạt tính enzym proteaza cao đạt 11,42 U/ml (hoạt tính protease) khả hịa tan huyết khối tốt (7,7 g/ml dịch lên men) Chúng chọn tỷ lệ tiếp giống 5% cho trình nghiên cứu tiếp sau 3.3 Nghiên cứu động thái trình lên men sinh tổng hợp enzym nattokinase chủng natto bình tam giác Kết nghiên cứu động thái trình lên men sinh tổng hợp nattokinase Hình 3.8 cho thấy, pH môi trường giảm nhanh 30 đầu trì ởpH 6,25 kết thúc trình lên men K18-CNSH 34 Hình 3.8 Động thái lên men sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilis Natto Lượng nattokinase sinh tổng hợp tăng mạnh sau 36 lên men đạt cao sau 48 lên men 5,77 U/ml (hoạt tính protease) khả hòa tan huyết khối đạt 5,3 g/ml dịch lên men (Hình 3.8) Ở thời điểm hoạt tính enzym cao xác định hoạt tính nattokinase theo phương pháp Astrup Mullertz (1952) hoạt tính protease đạt 2700 U/ml, thời điểm sinh tổng hợp nattokinase cao chủng Natto sớm so với chủng B subtilis NCIM 2724 (24 giờ) [34] chủng Bacillus 7.2, 12D2, NP1, NP2, NP3 (40 giờ) [4] chậm so với chủng Bacillus subtilis natto [47] Sau thời điểm đó, hoạt tính enzym giảm nhanh Như vậy, thu hồi enzym thích hợp sau 48 lên men K18-CNSH 35 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã nghiên cứu đặc điểm hình thái hình dạng tế bào chủng Bacillus subtilisNatto 5trên số môi trường: MPA LB Sử dụng Kit 50CHB đánh giá khả sử dụng nguồn cacbon chủng Bacillus subtilisNatto Môi trường lên men thích hợp lên khả sinh nattokinase chủng Bacillus subtilisNatto 5đã xác định thành phần gồm (g/l): Sữa đậu nành 10,0; Glucose 10,0; K2HPO4 1,0; MgSO4 0.5;Agar 20,0; H2O 1000 ml; pH 7-7,2 Đã nghiên cứu điều kiện ban đầu thích hợp cho q trình lên men sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilisNatto là: pH 7.5, nhiệt độ 35oC, tỉ lệ tiếp giống 5%, độ thơng khí 25% Nghiên cứu động học xác định động học cho trình lên men sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilisNatto bình tam giác cho thấy, thời điểm sau 48 lên men 5,77 U/ml (hoạt tính protease) khả hòa tan huyết khối đạt 5,3 g/ml dịch lên men Ở thời điểm hoạt tính enzym cao xác định hoạt tính nattokinase theo phương pháp Astrup Mullertz (1952) hoạt tính protease đạt 2700 U/ml KIẾN NGHỊ - Nghiên cứu tối ưu môi trường lên men nhằm nâng cao khả sinh tổng hợp Nattokinase chủng Natto - Nghiên cứu đặc tính nattokinase độ bền enzym K18-CNSH 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Astrup T., Mullertz S., 1952 The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity Archives of biochemistry and biophysics 40 (2), 346-351 Bao Y., Chen J., Qian Z., Ni M., Wang P., 2004 Optimization of the technique of solid fermentation of nattokinase, Journal of Shenyang Pharmaceutical University,21(6): 468-471 Bioresour Technol., 2008 Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology Nov, 99(17), 8170-4 Chang YY., Liu JS., Lai SL., Wu HS., Lan MY., 2008 Cerebellar hemorrhage provoked by combined use of nattokinase and aspirin in a patient with cerebral microbleeds Intern Med, 47 (5): 467–9 Chang YY., Liu JS., Lai SL., Wu HS., Lan MY., 2008 Cerebellar hemorrhage provoked by combined use of nattokinase and aspirin in a patient with cerebral microbleeds" Intern Med 47(5), 9-467 Chen P T., Chiang C J., Chao Y P., 2007 Strategy to approach stable production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis Biotechnol 23(4), 808-813 Chen PT., Chao YP., 2006 Enhanced production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis by the elimination of limiting factors Biotechnology letters 28(19), 1595–1600 Cong Wang., Ming Du., Dongmei Zheng., Fandong Kong., Guoren Zu., Yibing Feng., 2009 Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B12, J.Agric.Food Chem 57, 9722-9729 Deepak V., Kalishwaralal K., Ramkumarpandian S., Babu SV., Senthilkumar SR., Sangiliyandi G., 2008 Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology, Bioresour Technol 99 17 , 8170-8174 10 Dobrovolsky AB., Titaeva EV., 2002 The fibrinolysis system: regulation of activity and physiologic functions of its main components Biochemistry (Mosc) 67, 99-108 11 Fujita M., Hong K., Ito Y., Misawa S., Takeuchi N., Kariya K., Nishimuro S., 1995 Transport of nattokinase across the rat intestinal tract Biol Pharm Bul1 18, 1194-1196 12 Furie BC 2008 Mechanisms of thrombus formation N Engl J Med, 359: 938–949 13 Giang Thị Kim Liên 2009 Bài giảng môn quy hoạch thực nghiệm Trường Đại học sư phạm Đà Nẵng K18-CNSH 37 14 Hymowitz., Theodore.,1995 Evaluation of Wild Perennial Glycine Species and CrossesFor.Resistance.to.Phakopsora Trong.Sinclair,J.B.Hartman,G.L Proceedings of the Soybean Rust Workshop Urbana, IL National Soybean Research Laboratory, 33–37 15 Hoàng Thị Khánh Hồng., Lê Thị Thúy Ái., 2002 luận văn Thạc sỹ Hoàng Thị Khánh Hồng., Thị Thúy Ái., 2012 16 Juan MY., Wu CH., Chou CC., 2010 Fermentation with Bacillus sp As a bioprocess to enhance anthocyanin content, the angiotensin converting enzyme inhibitory effect, and the reducing activity ò black soybeans, Food Microbioloogy 15, 261–266 17 Kim JY., Gum SN., Paik JK., Lim HH., Kim K., Ogasawara K., 2008 Efcsof.nattokinase on blood pressure: a randomized, controlled trial Hypertension Research 31(8), 1583–1588 18 Kim SH., Choi SH., 2000 Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp strain DJ-4 screened from Doen-Jang Biotechnol Biochem, 64: 1722-1725 19 Kim W., Choi K., Kim Y., Park H., Choi J., Lee Y., Oh H., Kwon I., Lee S., 1996 Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 114 screened from Chungkook-Jang Appl Environ Microbiol 62(7): 1488-2482 20 Ku TW., Tsai RL., Pan TM., 2009 A simple and cost-saving approach to optimize the production of subtilisin NAT by submerged cultivation of Bacillus subtilis natto J Agric Food Chem 57(1), 6-292 21 Kunamneni A., Abdelghani TT., EUaiah P., 2007 Stteptokinase-the drug of choice for thrombolytic therapy JThromb Thrombolysis 23, 9-23 22 Kung Ta lee., jung Hao Wang., Lily Y L., and Ria P Chen., 2009, Amyloid degradatingability of nattokinase from Bacillus subtilis Natto Agric Food Chem 57, 503- 508 23 Lê Ngọc Tú., La Văn Chứ., Phan Thị Trâu Châu., Nguyễn Lâm Dũng.,1982 Enzyme vi sinh vật NSB khoa học kĩ thuật, tập 24 Lê Ngọc Tú., Lê Doãn Diên., Phạm Quốc Thắng., La Văn Chứ , Nguyễn Thị Thịnh., Bùi Đức Lợi., 1997 Hóa sinh học cơng nghiệp NSB ĐHTHHCM 25 Lê Thị Bích Phượng., Võ Thị Hạnh., Trần Thạch Phong., Lê Tấn Hưng., Trương Thị Hồng Vân., Lê Thị Hương., 2012 Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus sinh tổng hợp nattokinase Tạp sinh học 34 (3), 99-104 K18-CNSH 38 26 Lee J., Park S., Choi Won A., Lee KyungHee., Jeong Y K., Kong In-Soo., Park S., 1999.Production of a fibrinolytic enzyme in bioreactor culture by Bacillus subtilis BK-17 J Microbiol Biotechnol 9(4), 443-449 27 Liu JG, Xing JM., Chang TS, Ma ZY, Yang CL, Liu HZ, Chen JY., 2004 Optimization of medium composition for the production of nattokinase by Bacillus natto NLSSE Annual AICHE meeting, 1-11 28 Lyden P 2005 Thrombolytic Therapy for Acute Stroke Second Edition.Humana Press Inc 29 Lý Thị Bích Thủy., Đỗ Thị Tuyên., Nguyễn Thị Ngọc Dao, 2006 Tinh xác định số tính chất enzyme thủy phân fibrin tách chiết từ lồi giun quế (Perionyx excavatus) Tạp chí Sinh học 28(3), 77-82 30 Lý Thị Bích Thủy., Nguyễn Thị Ngọc Dao., 2004 Tách chiết enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin từ loài giụn quế (Perionyx excavatus) Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc Nghiên cứu Cơ Khoa học Sự sống định hướng Y Dược học, Hà Nội 173-176 31 Martin M., Kouhei M., 2002 Natto and its active ingredient nattokinase Altenative and complementary therapies, 157-164 32 Meruvu H., Vangalapati M., 2011 Nattokinase: A Review on Fibrinolytic Enzyme, International Journal of Chemical, Environmental and Pharmaceutical Research 2(1), 61-66 33 Nguyễn Lân Dũng., Đoàn Xuân Mượu., Nguyễn Phùng Tiến., Đặng Đức Trạch., Phạm Văn Ty., 1976 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 34 Nguyễn Văn Cách 2004 Công nghệ lên men chất kháng sinh Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội 35 Quyền Đình Thi., 2010 Nghiên cứu xây dụng quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩn enzyme tái tổ hợp Streptokinase yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng điều trị Viện công nghệ sinh học.) 36 Peng Y., Huang Q., Zhang R H., Zhang Y Z., 2003 Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens DC-4 screened from douchi, a traditional Chinese soybean food Comp Biochem Physiol Biochem MolBiol., 134, 45-52 K18-CNSH 39 37 Peng Y., Yang X., Zhang Y., 2005 Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo Appl Microbiol Biotechnol, 69: 126-132 38 Prafulla MM., Sagar VG., Smita SL., 2010 Production of nattokinase using Bacillus natto NRRL 3666: Mediaoptimization, scale up, and kinetic modeling FoodSci.Biotechnol 19(6), 1593-1603 39 Rasagnyal P S., Vangalapati M., 2013 Studies on optimization of process parameters for nattokinase production by bacillus subtilis NCIM 2724 and purification by liquid-liquid extraction Eng technol, ISSN :4516-4521 40 Ruei Lin Hsu., Rym A., Anissa H., Mohamed H., Fakher F., Laila M., Kemel J., Moncef N., 2009 Fibrinolytic enzymes from a newly isolated marine bacterium Bacillus subtilis A26: characterization and statistical media optimization Can J Microbiol 55, 1049- 1061 41 Rym A., Anissa H., Mohamed H., Fakher F., Laila M., Kemel J., Moncef N., 2009 Fibrinolytic enzymes from a newly isolated marine bacterium Bacillus subtilis A26: characterization and statistical media optimization Can J Microbiol 55,1049- 1061 42 SahelianR.,BorkenS.,1998.Dehydroepiandrosterone and cardiac arrhythmia Annals o f internal medicin, 129(7):588] 43 Sambrook J., Russel DW., 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory, NY 44 Sumi H., Hamada H., Nakanishi K., Hiratani H., 1990 Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase Acta Haematol 84(3), 139-43 45 Sumi H., Hamada H., Tsushima H., Mihara H., Muraki H., 1987 A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet Experientia 43(10), 1110-1111 46 Trần Văn Lài., 1996 Phát triển đậu đỗ làm thực phẩm cải tạo đất Vioeetj Nam 47 Unrean P., Nguyen H A N., Wonnop V., Panit K., 2012 Improvement of nattokinase production by Bacillus subtilis using an optimal feed strategy in fed-batch fermentation, KKU Res J., 17(5) 48 Vũ Hồng Diệp., Nguyễn Thị Ngọc Dao., Quyền Đình Thi., 2008 Nhân dịng phân tích trình tự gene mã hóa SK từ chủng Streptococcus pyogenes DT7 Tạp chí Cơng nghệ sinh học 6(4A), 757-763 K18-CNSH 40 49 Wang C., Ji B., Li B., Ji H., 2006a Enzymatic properties and identification of a fibrinolytic serine protease purified from Bacillus.subtilis DC33 World J Microbiol Biotechnol 50 Wang J K., Chiu H H., Hsieh C S., 2009 Optimization of the Medium Components by Statistical Experimental Methods to Enhance Nattokinase Activity, Fooyin J Health Sci 1(1), 21 27 51 Wang S H., Zhang C., Yang Y L., Diao M., Bai M F., 2008 Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and characterization of the fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis LD-8547, World J Microbiol Biotechnol 24, 475- 482 52 Wei W., Li M., Wang J., Nie F., Li L., 2012 The E3 ubiquitin ligase ITCH negatively regulates canonical Wnt signaling by targeting dishevelled protein Mol Cell Biol 32(19):3903-12 53 Wei X., Luo M., Xie Y., Yang L., Li H., Xu L and Liu H., 2005 Strain screening, fermentation, separation, and encapsulation for production of nattokinase functional food Appl biochem biotechnol 54 Wu F C., Chang C W., Shih I L., 2013 Optimization of the production and characterization of milk clotting enzymes by Bacillus subtilis natto Springer plus, (33): 1-10 55 Yatagai CA., Maruyama M., Kawahara T., Sumi H.,2009 Nattokinase-promoted tissue plasminogen activator release from human cells Pathophysiol Haemost Thromb, 36 (5): 227 232 K18-CNSH 41