Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo rễ tóc cây đậu nành (Glycine max L.) bằng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:Nhiệm vụ: Tạo được rễ tóc cây đậu nành cảm ứng bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes phục vu cho các nghiên cứu chức năng gen va sinh học vùng rễ đậu nành.. Ching vi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỎ CHÍ MINHTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-000 -NGO THI TU TRINH

NGHIÊN CỨU TẠO RE TÓC CAY DAU NANH (Glycine max L.)

BANG VI KHUAN Agrobacterium rhizogenes

Chuyén nganh: Cong nghé Sinh hoc

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHO HO CHI MINH, tháng 7 năm 2018

Cán bộ cham nhận xét 2: PGS TS Lê Thị Thủy Tiên

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ky)

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Dai hoc Bách Khoa, DHQGTP.HCM ngày 21 tháng 7 năm 2018

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:1 PGS TS Nguyễn Tién Thang

2 PGS TS Bui Van Lệ3 PGS TS Lé Thi Thuy Tién4 TS Võ Dinh Lệ Tam

5 TS Hoang Anh Hoang

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI DONG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

PGS TS NGUYÊN TIỀN THẮNG GS TS PHAN THANH SƠN NAM

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHU NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập — Tự do — Hanh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VAN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Ngô Thị Tú Trinh MSHV: 1570260

Ngày tháng năm sinh: 04/02/1988 Nơi sinh: Lâm ĐồngChuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201I TÊN DE TÀI: Nghiên cứu tạo rễ tóc cây đậu nành (Glycine max L.) bangvi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:Nhiệm vụ: Tạo được rễ tóc cây đậu nành cảm ứng bởi vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes phục vu cho các nghiên cứu chức năng gen va sinh học vùng rễ đậu nành

Nội dung

¬ Xác định một số điều kiện thích hợp cho quá trình lây nhiễm A rhizogenes

lên mau đậu nành in vitro

- Xác định mẫu rễ tóc đậu nành chuyển genH NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 26/2/2018II NGÀY HOÀN THÀNH NHIEM VU: 18/6/2018IV HƯỚNG DÂN KHOA HỌC: TS NGUYÊN VŨ PHONG

Tp Hô Chi Minh, ngày thang năm 2018CÁN BỘ HƯỚNG DAN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TS NGUYÊN VŨ PHONG PGS TS NGUYÊN THÚY HƯƠNG

TRƯỞNG KHOA

GS TS PHAN THANH SƠN NAM

LỜI CÁM ƠNChân thành cảm ơn Cô PGS TS Nguyễn Thúy Hương - Chủ nhiệm bộ mônCông nghệ Sinh học, các thầy cô giảng viên bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Kỹ

thuật Hóa học, trường Đại học Bách khoa — ĐHQG TP.HCM trong thời gian qua đã

truyền đạt những kiến thức bồ ích cho em

Chân thành cảm ơn thay Nguyễn Vũ Phong đã hướng dan em trong quá trìnhthực hiện dé tài tốt nghiệp

Chân thành cảm ơn cô Tôn Bảo Linh đã hỗ trợ em trong việc hoàn thành dé

tài nghiên cứu nay.

Cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ trẻ đãtạo điều kiện về thời gian cho tôi hoàn thành văn bang thac si

TÓM TATChuyển gen ở cây đậu nành (Glycine max L.) thường được thực hiện bằngphương pháp bắn gen và sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tuy nhiênhiệu quả của việc chuyển gen bằng hai phương pháp trên phụ thuộc phần lớn vàokhả năng tái sinh và thời gian tạo được cây chuyển gen Chuyển gen tạo rễ tóc băngviệc sử dung Agrobacterium rhizogenes khắc phục những hạn chế trên và hỗ trợ đặclực cho các nghiên cứu chức năng gen vùng rễ Nghiên cứu này xác định một số điềukiện thích hợp cho việc chuyển gen tạo rễ tóc sử dụng vi khuẩn A rhizogenes trêncây đậu nành (Glycine max L.) giỗng HLĐN29 và DT84.

Ở cả hai giống đậu nanh sau lây nhiễm với vi khuẩn, mẫu lá mầm cảm ứngtạo rễ tốt hon so với mẫu trụ hạ diệp Ching vi khuẩn ATCC11325 và ATCC15834cho hiệu quả tạo rễ cao trên giống đậu nành HLĐN29, tỉ lệ mẫu tạo rễ đạt từ 96% —100%, với khoảng 8 rễ/mẫu, hình thái rễ tương tự đặc điểm rễ tóc chuyển gen.Tương tự, chủng ATCC15834 cho hiệu quả tạo rễ tốt nhất ở giỗng đậu nành DT84.Mẫu sau giai đoạn đồng nuôi cây được loại bỏ khuẩn hiệu quả với cefotaxime 500mg/L cùng carbenicillin 400 mg/L và duy trì trên môi trường bố sung cefotaxime500 mg/L Lá mầm đậu nành 6-8 ngày sau gieo cảm ứng tạo rễ tốt nhất Hai cách lâynhiễm trực tiếp và đồng nuôi cấy vi khuẩn cho số mẫu tạo rễ và số rễ trung bìnhtương đương nhau trên cả hai giống đậu nành thí nghiệm Tỉ lệ mẫu tạo rễ của giốngDT84 không khác biệt dang kế khi sử dụng dịch khuẩn ODeoonm từ 0,5 đến 1,3.Trong đó, số rễ trung bình cao nhất (~ 7 rễ/mẫu) khi sử dụng dịch khuẩn có giá trịODeoonm từ 0,5 đến 1,0 Ba mẫu rễ chuyển gen được xác định thông qua phân tíchPCR và hình thái rễ khi duy trì mẫu trên môi trường nuôi không bố sung chất điều

hòa tăng trưởng.

ABSTRACT

Soybean (Glycine max L.) gene transformation has been performed via

particle bombardment and the Agrobacterium tumefaciens system However, the

success and efficiency of these methods relies mainly on the ability and time to

regenerate transgenic plants In advantage of those traditional transformation

methods, transformation using Agrobacterium rhizogenes is an useful tool for

functional research on plant root systems This study determines some conditions for

soybean (G max L.) transformation via A rhizogenes for hairy root induction on

soybean cultivars HLDN29 and DT84.

Cotyledonary explants were more efficient in hairy root production in both

cultivars HLDN29 and DT84 The highest root induction rate and average root

number was observed in HLDN29 explants infected with strain ATCC11325 and

ATCC15834 (96% — 100% and 8 roots/explant) and in DT84 explants infected with

ATCC15834 Morphology of these roots were similar with description for transgenic

roots Bacterial removal after co-culture stage were effective with rinsing the

samples in culture media supplemented with 500 mg/L cefotaxime and 400 mg/L

carbenicillin before placing them on plates with 500 mg/L cefotaxime Cotyledonary

leaves after sowing 6-8 days were optimal for hairy root induction Infection

methods (direct inoculation and immersion) showed no significant difference in root

induction rate and average root number in both HLDN29 and DT84 There was no

difference in root formation rates of soybean DT84 infected with bacterial

suspension from ODøoonm = 0.5 to 1.3, while the highest average root number (~7

roots/explant) was obtained with the suspension ODe0onmm = 0.5 to ODeoonm = 1.3.

Three transgenic root lines were identified based on morphology when sub-culturing

on hormone — free media and PCR analysis.

LOI CAM DOAN

Tôi xin cam đoan day là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện dưới sự

hướng dẫn khoa hoc của TS Nguyễn Vũ Phong và sự hỗ trợ của ThS Tôn Bảo Linh

Các sô liệu, bảng biêu, hình ảnh là kêt quả nghiên cứu của nhóm thực hiện đề

tài.

Tác giả

Ngô Thị Tú Trinh

MUC LUC

NHIẸM VU LUAN VAN THAC SÌ 5< 31x 911 1 1 1g ng nh, ill

LỜI CẢM 1 ©) \ ee ivTOM TAT veesesesssscsccssssssssnssssssesececeesesssnsnnnnssssseeseeeessesssnnunnsssseeeeceesesssnnnnmsteseeeeeeeeensnnnnnmntteeeeeees V

IE 9) (08400/58i2015i060) 01177 2

1.5 Ý nghĩa của để tải 22 ©22<©+E£+EELEEEE1122715117111271511711111711.71111.11 11 11 E1 21.5.1 Ý nghĩa khoa học ¿- 2£ ©++£©EE+££EE+EEEEEEE9EE15212711171511771111711117711.11 212.0 21.5.2 Ý nghĩa thực tiễn - 2© ©2£©+<£+EEEEEELEEEE11227151121111171517111117110711E 211 2Chương 2: TONG QUAN oveessesssssesssssessssssssssessssssssssessssesssssessssesssssesssecsssesessssesssesessssessssessseseen 3

2.1 Cay dau nanh (Glycine MAX L,) 00n 3

2.2 Vi khuẩn Agrobacterium rhizOgeneS veescccscssscssssssssssssessssssessssssssessssssssseesssesessesssseeessseeeen 42.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn A PhizOgeneS veccccssecscsscssssssssessssseessssesssssssssssssseessseeesssessseeessseeeen 4

2.2.2 Plasmid Ri của A MhIZOQENES So <5 <1 KH TT HH gen, 5

2.2.3 CAC GEN 0n 7

2.2.4 Co chế chuyển T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực Vat 92.2.6 Cơ sở phân tử và sinh ly của sự hình thành rễ tóc -2- 2 22522 102.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen -2- ¿2 ©52222e2ccvseerveed 112.3.1 Sự phù hợp giữa kiểu gen thực vật va chủng vi khuẩn Agrobacteriumn II

"NI 07177 lãi

2.3.3 Mật độ vi khuẩn A rhizogenes khi lây nhiễm 2-22 ©©5£2E+e2cEvseerveed 122.4 Lay nhiễm A rhizogenes lên mẫu thực vật ceecceesseessesssseesseessesssseesseessesssseesseesseesseeeseees 122.5 Chuyén gen bang vi khuẩn A rhizogenes trên cây đậu nành -2- +5 13Chương 3: VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -2-5 173.1 Địa điểm — Thời gian nghiên CU sceseccccecsssssssessssssessssesssseessssesssssessssesssesesseeessesessseeessees 17

3.2 Vat liu nghi€n CUU 007 17

3.2.1 Đối tượng nghiên COU ceecccesecssessssssessssesssssessssesssssessssesssssessssessssscssssesssssessssesssesessseessees 173.2.2 Hóa chất và môi trường -¿- 22 ©+++©E++EEEEE2EE1121721127132177112711217112 1X tk 17

SN 00:50) 1198604019000) 2 19

3.3.1 Tao nguồn mẫu đậu nành in vitro và chuẩn bị A FÍHZOĐCHS ĂSĂSsieirerke 193.3.1.1 Tao nguon mẫu đậu NAN ecesessessesssccecsscsssssessscssccecsucssecssssscsucsucssccussussuseasensssseeees 193.3.1.2 Chuẩn bi vi khuẩn A rhizogenes eeecccsccscssssssssssssesssssssssssssseesssssessssssssssessseessseessseeessees 203.3.2 Xác định một số điều kiện phù hợp lây nhiễm A rhizogenes lên mẫu đậu nành in

taO TE TOC O MAU GaU NAN ec eeesssessesscscesscsscescesscescessessceseeecescessesscsseessesscessessesssesceneenes 25

3.3.2.5 Xác định mật độ vi khuẩn phù hợp cho quá trình cảm ứng tạo rễ tóc 253.3.3 Duy trì các dòng rễ giả định chuyển gen 2¿-©225222EEecEEEerrrkerrrreerrreed 263.3.4 Khang định mẫu chuyền gen bang phương pháp PCR - ¿c2 263.3.5 Đánh giá hình thái, sự tăng trưởng của các rễ cảm ứng bởi A rhizogenes 273.3.6 Phương pháp xử lý thong kê ¿- 2£ ©+££EE+E£+EEEESEEEEEEEAEEE13E2212.E1xerrkred 28Chương 4: KET QUA - THẢO LUẬN 2-2¿+©+e+2EkESEEEEEEEEEEEEEEEkeEELkerrkerrrk 294.1 Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm -¿- 2£ ©V+£+EE++£EEEEESEEEEEEEEEEEEEEETEEkkrrrkrrrrreed 294.1.1 Chuẩn bi mẫu đậu nành int vitro veecceescsssssssesccessccssssssecssscsssecusececssecssecssscsacssecsusesseensven 294.1.2 Chuẩn bị vi khuẩn ccccccxveerrrrrrttrrttttttrrriiiririrrrrrrrrriiiiirrrrrriiie 294.2 Xác định chủng A rhizogenes va loại mẫu phù hop với cảm ứng tạo rễ tóc ở đậu

¡000007 3l

4.4 Khả năng cảm ứng tạo rễ tơ của mẫu ở độ tuổi khác nhau -2- +: 364.5 Hiệu quả cảm ứng tạo rễ của cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rJizogenes 38

4.6 Xác định mật độ A rhizogenes phù hợp cho quá trình cảm ứng tạo rễ tơ 39

4.7 Duy trì các dòng rễ giả định chuyển gen 2-22-©S<SYEeSEEEEEEEEEEEEEkerrrerrrk 404.8 Xác định mẫu chuyền gen bằng phương pháp PCR -2- ¿e2 ©seccssed 424.9 Đánh giá hình thái, sự tăng trưởng của các rễ cảm ứng bởi A rhizogenes 43Chương 5: KET LUẬN VÀ DE NGHỊ -2- 22+ ©+eSEEE+EEEEEEEEEEEEEEEkerELkrrrkerrrk 445,1 IKẾT luậnn - 6° c1 951195119511 971 9E19E15119211921197119714071671071211211211 716 2xe 445.2 ĐỀ nghị oeeccesscccssssssssssesssssssssssesssscssssessssscsssscsssssesssscsssusesssecsssssesssscsssssessseessssessseesssesessseeeen 44TÀI LIEU THAM KHAO uuu cecccesssesssecssscsssccssccusecusececssecssucssscsssccssccuecaseseresecssecsuscsuvesaenucenees 46

OD:

PCR:

RB:Ri-plasmid:

T-DNA:

Ti-plasmid:

Vir:

XI

DANH MỤC CHỮ VIET TAT

American Type Culture Collection

Vitamin B5

base pair

co-cultivation mediumDeoxyribonucleic acid

Food and Agriculture Organization

International Collection of Phytopathogenic Bacteria

Root inducing plasmid

Transfer Deoxyribonucleic Acid

Tumor inducing plasmid

Virulence

DANH MỤC CÁC BANGBảng 3.1 Thành phần của các loại môi trường sử dụng trong cảm ứng tạo rễ tơ trên

mẫu đậu nành - G- E- s15 9195 195 195 193 E193 10 11 1T ng ng ng nọ 18

Bang 3.2 Các cặp primer sử dụng trong nghién CỨU 5Ặ 5S +2 19Bang 3.3 Các nghiệm thức cua thi nghiệm xác định chung A rhizogenes và loại

mẫu phù hợp cho cảm ứng ta0 rỄ ¿+ ¿525252 2 SE 9 9EEEEEE1121 2121212121 111 xred 23

Bang 3.4 Các nghiệm thức khảo sát hiệu quả diệt khuẩn của các loại kháng sinh 24Bang 3.5: Thành phan phản ứng PCR - ¿2-5-5252 S2 SE‡E+E2E£EE£E£E+EzEEErkrkrerree 27

Bang 3.6: Chương trình nhiệt phan ứng PCR - (<1 + eerse 27

Bảng 4.1 Tỉ lệ (%) mẫu tạo rễ của lá mầm và trụ hạ diệp (A) sau khi lây nhiễm các

chung A rhizogenes khác nhau () Go 32

Bảng 4.2 Số rễ được tạo thành khi nhiễm mẫu đậu nành (A) với các chủng A

rhizogenes khác nhau ()) TH kh 32

Bang 4.3 Mức độ tái nhiễm khuẩn của mẫu lá mầm DT84 in Vitro 35Bảng 4.4 Số rễ tạo thành và tỉ lệ tạo rễ của lá mầm đậu nành ở các ngày tuôi khác

¡0 -ö-ö-ö-ö-: 37

Bảng 4.5 Số rễ trung bình và số mẫu tạo rễ sau khi lây nhiễm A rhizogenes theo hai

CACH KhAc Nhau 0P 5Ó 39

Bang 4.6 Số rễ tạo thành và tỉ lệ mẫu tạo rễ ở đậu nành DT84 sau khi lây nhiễm A

rhizogenes ở các mật độ khác nhau - c c S1 1111313333111 9 9 1 11111 1 re, 40

DANH MUC CAC HINH VE, DO THI

Hình 2.1 Cấu trúc Ri plasmid của A rhizo genes ccccccccscsssssscscsssssssssssesesssesssseseessessees 7So đồ 3.1 Qui trình thực hiện lây nhiễm A rhizogenes trên đậu nành 21Hình 4.1 Hạt đậu nành nảy MAIN I11 VỈfFO G5 SE 3232 SESESESEEEEEEEseserereseree 29Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lac của các chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

30

Hình 4.3 Trụ hạ diệp và lá mâm đậu nành HLĐN29 sau khi lây nhiễm A rhizogenessau 16 ngày trên môi trường MXB bồ sung cefotaxime 500 mg/L - -: 33Hình 4.4 Rễ trên mẫu lá mầm đậu nành HLĐN29 sau khi lây nhiễm với các chủng

A rhizogenes Khác nhau - G9900 34

Hình 4.5 Mẫu lá mam đậu nành 4 ngày sau khi rửa với carbenicillin và cefotaxime

trên môi trường BŠ cọ 36

Hình 4.6 Hạt đậu nành DT84 được gieo trên môi trường B5 ở các ngày tuổi khác

¡0 -ö-ö-ö-ö-: 38

Hình 4.7 Ré đậu nành HLĐN29 trên môi trường MXB sau 6 tuần nuôi ở 25C trongGHGU toi0: 00 41Hình 4.8 Kết quả phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của gen Golgin 84 42Hình 4.9 Các mẫu rễ chuyển gen sau 7 tháng duy trì trên môi trường MXB 43

Chương 1: MỞ ĐẦU1.1 Lý do chọn đề tài

Trong thời gian dài, các nghiên cứu cải thiện di truyền trên đậu nành tậptrung vào khả năng kháng sâu bệnh (Somers và cs, 2005; Trần Thị Cúc Hòa, 2010).Vùng rễ của cây họ Đậu nói chung và cây đậu nành nói riêng được đặc biệt quantâm do khả năng cố định đạm và cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium Những nămgân đây, chức năng kháng tác nhân gây bệnh trong đất của các gen vùng rễ đậunành đã được biết đến Bên cạnh đó khả năng thích nghỉ với điều kiện hạn và đấtmặn của cây đậu nành cũng được chú trọng Điều đó cho thay vùng rễ có chức năngcực kỳ quan trọng trong sự phát triển và thích ứng với sự biến đổi khí hậu của cây

đậu nành.

Khai thác khả năng tự vệ và nguồn gen kháng tác nhân gây bệnh của câytrồng là cơ sở để cải thiện giống cây trồng và là hướng đi được các nhóm nghiêncứu về bộ gen chức năng xác định (Md Setamam và cs, 2014) Hiện nay chưa cócông bố nao về tạo rễ tóc trên cây đậu nành trong nước, và có ít nghiên cứu về sinhhọc vùng rễ và tương tác giữa các gen ở rễ và tác nhân gây bệnh vùng rễ Trên thếgiới, số lượng nghiên cứu tạo rễ tóc từ mẫu đậu nành in vitro cũng rat hạn chế Dođó, nghiên cứu sẽ giúp thiết lập qui trình tạo rễ tóc trên đối tượng đậu nành in vitro,làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về chức năng của các gen cũng như sinh

học vùng rê cây đậu nành.

Kết quả nghiên cứu sẽ làm nền tảng cho các nghiên cứu về chức năng bộ genđậu nành nhằm khai thác một cách hiệu quả nguồn gen hiện có trong nước Đồngthời kết quả nay cũng hỗ trợ tích cực cho các nghiên cứu về sự tương tác của tácnhân gây bệnh vùng rễ và các gen ở vùng rễ thực vật Các hướng nghiên cứu này,về lâu dai, sẽ góp phan đáng kế vào sự phát triển bền vững năng suất và chất lượngcây trồng

1.2 Mục tiêu đề tài1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Tạo được ré tóc cây đậu nành cảm ứng bởi vi khuân Agrobacterium

rhizogenes phục vụ cho các nghiên cứu chức nang gen và sinh học vùng rê đậu nành.

ICPB TR7, ATCC 11325, ATCC 15834

1.4 Nội dung nghiên cứu

- Xác định một số điều kiện thích hợp (loại mau, chủng vi khuẩn, tuổi mau,cách thức lây nhiễm, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm) cho quá trình lây nhiễmA rhizogenes lên mẫu đậu nành in vitro

- Xác định mẫu rễ tóc đậu nành chuyền gen.1.5 Y nghĩa của đề tài

1.5.1 Ý nghĩa khoa họcKết quả của đề tài giúp tìm hiểu thêm mối tương tác giữa vi khuẩn A.rhizogenes và mô hình thực vật đậu nành, tạo tiền đề xây dựng các nghiên cứu mớiliên quan tạo cây đậu nành chuyên gen và góp phan phát triển các nghiên cứu tạo va

nhân sinh khôi rê tóc giúp nghiên cứu về gen và chức năng gen vùng rê.

Chương 2: TONG QUAN

2.1 Cay dau nanh (Glycine max L.)

Đậu nành hay đậu tương (Glycine max L.) là một trong những cây trông quantrọng trong số các loại cây họ đậu (Fabaceae) Đậu nành có hàm lượng protein caodo đó được dùng trong chế biến thực phẩm cho người va gia súc Đậu nành là loạicây trồng thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, than, cành, lá, hoa, quả và hạt Ré đậunành là loại rễ cọc gồm rễ cái và các rễ bên, trên có nhiều nốt san chứa vi khuẩnRhizobium japonicum có khả năng cô định đạm của không khí Thân tròn, mang 8 -14 đốt, các cành và lá mọc ra từ các đốt trên thân Đậu nành là cây tự thụ phần,hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn có mau trắng hay tím Thời ky cây ra hoa sớm haymuộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào từng giống và thời vụ gieo trồng bởi nóchịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ Quả đậu nành là loại quả ráp,ngoài vỏ quả thường có lông bao phủ, màu sắc vỏ quả khi chín có mau vàng hayxám đen Hạt đậu nành có hình dạng tròn bầu dục, tròn dài, tròn đẹt; vỏ hạt thườngnhẫn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, den Cây đậu nành là cây trồng ngắnngày, có thé trồng trên nhiều loại đất, nhiều vụ trong năm; có thể xen canh, gối vụ rất thuận lợi cho phát triển sản xuất nông nghiệp để khai thác lợi thế của vùng khíhậu nhiệt đới Trong suốt thời gian sinh trưởng nhu cầu nước của cây không đồngđều qua các giai đoạn Yêu cầu về độ âm đồng ruộng trung bình là 50 - 60%, giaiđoạn ra hoa, hình thành quả phải đạt 70 - 80% nên đậu nành được xếp vào nhóm

cây trông có nhu cau về nước cao.

Đối với ngành trông trọt, đậu nành có khả năng tích luỹ đạm của không khíđể tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ vi khuẩn cộng sinh trên nốt san ở bộ rễ vasinh khối thân, cành lá Các chất hữu cơ nay góp phan làm thay đổi tính chất lý hoáhọc và tăng độ phì nhiêu cho đất Trong hệ thống thâm canh, trồng đậu nành có tácdụng làm cho cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh,

chong nan ô nhiêm do lạm dụng phân bón hoá học và thuôc trừ sâu.

Các sản phẩm thực phẩm từ đậu nành cũng rất đa dạng, có thể dùng trực tiếpở dạng hạt thô hay qua chế biến Ngoài ra, trồng cây đậu nành có tác dụng cai taođất do hoạt động của nhóm vi khuẩn Rhizobium cộng sinh trên rễ cây họ đậu Nhiềunghiên cứu về bộ gen cây đậu nành đã được tiến hành vi đây là cây trồng quan trọngvề mặt kinh tế trên thế giới (Stacey và cs, 2006) Những hướng nghiên cứu về câyđậu nành chủ yếu nhăm nâng cao chất lượng dinh dưỡng, khả năng kháng côn trùnggây hại và các mục tiêu khác Một trong những quy trình hiệu quả để đạt các mụctiêu trên là biến đối di truyền cây đậu nành (Arruda và cs, 2013).

2.2 Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes2.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn A rhizogenes

Agrobacterium rhizogenes (trước day được gọi là Phytomonas rhizogenes)

đã được nhận biết từ hon 70 năm trước như là một tác nhân gây bệnh trên tang lônghút của rễ cây song tử diệp (hội chứng rễ tóc — hairy root) Agrobacteriumrhizogenes là vi khuẩn Gram âm sống trong đất, hình que, có tính di động, khôngsinh bao tử, thuộc chi Agrobacterium A rhizogenes có quan hệ rat gần vớiAgrobacterium tumefaciens, tắc nhân gây khối u trên cây

Đến nay, những hiểu biết cơ bản về cơ chế phân tử của sự biến nạp gen thựcvật bởi những thành viên của chi Agrobacterium đều là dựa trên những nghiên cứutong quát về A tumefaciens Toàn bộ quá trình lây nhiễm được xem như là tương tựnhau trong cả 2 loài A rhizogenes gây nhiễm vào tế bào thực vật ở vị trí vếtthương, do A rhizogenes bị hap dẫn bởi hợp chat phenol được phóng ra từ những tếbào bị ton thương Ri plasmid của A rhizogenes sẽ xâm nhập vào tế bào thực vật vamột đoạn nhỏ của Ri plasmid là T-DNA sẽ được chuyển và gan vào bộ gen của tếbào thực vật Theo cách này T-DNA được duy trì ôn định trong bộ gen mà nóchuyển vào Từ vùng bị nhiễm sẽ tạo ra những rễ nhánh bất thường gọi là rễ tóc(hairy root) Những rễ này có đặc điểm là phát triển ăn nghiêng, phân nhánh nhiều,tăng trưởng nhanh và đặc biệt là chúng có khả năng phát triển in vitro trong điềukiện không có các yếu tố kích thích tăng trưởng (Rao và Ravishankar, 2002 trích

dẫn bởi Taylor, 2007) Những đặc tính này làm cho rễ tóc trở thành một công cụ

được sử dụng rộng rãi cho việc sản xuất các hợp chất thứ cấp, khảo sát chức nănggen, và nghiên cứu sinh học của rễ nói chung.

Các dong A rhizogenes có thé được phan loai vao nhiều nhóm phụ khácnhau dựa trên kiểu opine ma chúng sản xuất ra Các dòng A rhizogenes phố biếnnhất được xác định đến nay gồm dòng sản xuất agropine (đại diện là Ri plasmid pRiA4, pRi 1855, pRi HRI, pRi 15834, và pRi LBA9402), dòng sản xuất mannopine (đạidiện là Ri plasmid pRi 8/96), dòng sản xuất cucumopine (dai diện là Ri plasmid pRi2659) va dòng sản xuất mikimopine (đại diện là Ri plasmid pRi 1724) Mikimopinevà cucumopine là những chat đồng phân lập thể, nhưng không có tính tương đồnggiữa các gen tong hop opine ở mức độ nucleotide Trong số các dòng A rhizogeneskhác nhau được biết, K47, K599 va HRI là các dòng gây độc cao có khả năng lâynhiễm cho nhiều loài thực vật khác nhau (Taylor, 2007)

2.2.2 Plasmid Ri của A rhizogenes

Ri plasmid cua A rhizogenes va Ti plasmid cua A tumefaciens tuong tu

nhau về cau trúc Những nghiên cứu so sánh trình tự của Ri va Ti plasmid cho thaycác cơ câu của sự hoạt hóa và sự vận chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thựcvật được bảo tồn giữa 2 loại plasmid Trong cả Ri và Ti plasmid, gần vùng biên giớicủa T-DNA có 1 chuỗi mã có tính chất lặp lại gồm 24 bp, được gọi là trình tự lẻ

(border sequences) T-DNA nguyên thủy mang một nhóm gen gây ung thu và di

hóa opine, biểu hiện ở những tế bào thực vật chuyển gen là sự phát triển của các môung thư và sự sản xuất opine, các dan xuất amino acid hầu như chỉ được vi khuẩn sửdụng như là nguồn carbon va nitrogen Ca Ri va Ti plasmid đều chứa gen điềukhiến quá trình gan va chuyén T-DNA vao té bao thuc vat va cho hién tượng di hóacác opine trong mô thực vật đã chuyền gen Tính tương đồng đáng chú ý giữa Ri vàTi plasmid là vùng vir và cơ cấu quá trình vận chuyển và xâm nhập của T-DNA

(Taylor, 2007).

Mặc dù Ri plasmid (của A rhizogenes) và Ti plasmid (của A tumefaciens) có

nhiều điểm tương đồng nhau, đó là chúng đều có mang các vùng T-DNA, vùng vir,gen chuyên hóa opine và vùng ori khởi đầu sao chép trong tế bao vật chủ nhưng vẫntồn tại những sự khác nhau là vùng T-DNA của Ti plasmid chứa các gen tong hợp

auxin, cytokinin và opine trong khi Ri plasmid chỉ mang các gen tong hợp auxin vàopine Day là điểm khác nhau gây ra hiệu qua tác động khác nhau lên thực vat Riplasmid của A rhizogenes không chứa trình tự overdrive được tìm thay trong Ti

plasmid cua A tumefaciens Trình tu overdrive có kích thước 24 bp với 1 trình tự

trung tâm 8 bp được bao vệ nằm gan lề phải trên Ti plasmid có tác dụng là làm giatăng hiệu quả hình thành khối u băng cách làm tăng mạnh quá trình vận chuyển T-

DNA Ri plasmid của A rhizogenes sở hữu trình tự lặp lại 8 bp — gọi là trình tự kích

thích vận chuyển T-DNA (TSS), nó làm gia tăng hiệu quả biến nạp T-DNA vào hệgen thực vật TSS gồm 12 trình tự lặp lại 5-TGCCTTCG-3 trong dòng sản xuấtmikimopine, 6 trình tự lặp lại 5-ATTAGTTC-3 trong dòng sản xuất mannopine, 5trình tự lặp lại 5-TTGTTCAA-3 trong dòng san xuất agropine, va 16 trình tự lặp lại5-GTTCGTCA -3 trong dòng sản xuất cucumopine của A.rhizogenes

Một sự khác nhau đáng chú ý nữa giữa A.tumefaciens va A rhizogenes là

trong Ri plasmid cua A rhizogenes không có gen virE] và virE2 VirE2 là 1 sợi don

DNA -găn kết protein và virE/ là chất ức chế kèm theo của nó Chức năng củavirE2 là bảo vệ sợi đơn T-DNA khỏi sự tan công của nuclease và kích thích nhâncủa nó nhập vào tế bào thực vật Gen virE rất quan trọng cho sự sự phát sinh bệnhcủa A tumefaciens nhưng không phải là thiết yếu cho sự cảm ứng rễ tóc A.rhizogenes có chứa gen GALLS trên Ri plasmid, có thé thay thé chức năng của genvirE2 trong A tumefaciens Tuy nhiên, cơ chế ma GALLS protein có thé thay théchức năng virE2 trong A rhizogenes van chưa được hiểu rõ (Taylor, 2007)

Tất cả các dòng A rhizogenes đều chứa một vùng T-DNA trên Ri plasmidmang những gen liên quan đến sự khởi đầu và phát triển rễ (roi-gene), những genliên quan đến sự tổng hợp opine, và những gen chưa rõ chức năng Một T-DNA thứ2 có thé xuất hiện chứa những gen liên quan đến sự tong hợp auxin (zux/ hoặc

iaaM và aux2 hoặc iaaH) cùng với các gen chưa rõ chức năng khác Ri plasmid có

hai T-DNA, TL và Tr, được gọi là “split" T-DNA Ri plasmid của dòng sản xuấtcucumopine và mannopine chỉ có một vùng T-DNA, dong sản xuất agropine có một

split T-DNA chứa hai vùng T-DNA, TL và Tr, mỗi vùng có kích thước khoảng

15-20 kb Cả TL-DNA và TR-DNA đều được biến nạp và hợp nhất một cỏch độc lậptrong hệ gen cõy chủ, sự vận chuyờn TL-DNA chủ yếu là dộ cảm ứng rễ túc.

Opinecatabolism

N

Virulence

region

Conjugative Ri plasmidtransfer

Right — Lefta 1đằ Border

Border <j ẪN⁄ : ,

Hỡnh 2.1 Cau trỳc Ri plasmid của A rhizogenes (Veena va Taylor, 2007)

2.2.3 Cac gen rol

Một vai vị trớ trờn TL-DNA của Ri plasmid cú chứa cỏc gen thiết yếu cho sucảm ứng rễ túc (được gọi là gen rol) TL-DNA của agropine Ri plasmid cú ớt nhất 4

vi trớ chứa cỏc gen rolA, rolB, rolC, rolD tương ứng với cỏc khung đọc mở (Open

reading frame — ORF) 10, 11, 12, 15 Từ những năm 90, sự kết hợp của rolA, rolBvà rolC đó được chứng minh là du để tạo ra kiểu hỡnh rễ túc, phụ thuộc loài thực vậtvà kiểu mụ

Tr-DNA chỉ được tim thấy trong Ri plasmid của A rhizogenes dũng sản xuấtagropine gồm cú cỏc gen aux1, aux2, RolB TR, masl, mas2 và ags điều khiến quỏtrỡnh tong hop opine và auxin Cỏc gen aux được coi là đúng vai trũ phụ trong cảmứng rễ túc và khụng thiết yếu cho sự sản xuất rễ túc Cỏc dũng A rhizogenes sảnxuất opine như mannopine, cucumopine, hay mikimopine chuyển một đoạn T-DNAđơn tương đồng với agropine TL-DNA nhưng khụng cú gen rolD T-DNA của dũng

sản xuất cucumopine va mannopine không có các gen aux mà chỉ có gen rol là đủcho việc tạo ra kiểu hình rễ tóc.

Gen rolA đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành rễ tóc vi sự biểu hiệncủa rolA trong cây chuyên gen 6n định tạo ra kiểu hình biến dạng cao: lá xoăn, xanhđậm, đốt dai, có hiện tượng lùn hoặc bán lùn, hóa già chậm Gen rolA có liên quanđến sự thay đổi sinh lý hormone gồm cả sự can thiệp vào gibberellin Trình tự genrolA của nhiều dòng A rhizogenes khác nhau dài khoảng 279 — 423bp RolA cũngcó thể liên quan đến sự mat cân bang mức độ hormone thực vat

Phụ thuộc vào dòng vi khuẩn, gen rolB sẽ có kích thước từ 762 — 837bp vamã hóa một protein có 259 — 279 amino acid Gen ro/B sử dụng một cầu trúcpromoter trong cây chuyển gen ức chế sự cảm ứng và hoại tử rễ bất định, cả trongmô seo và lá cây con Sự biểu hiện của roiB cần thiết cho hoạt động tăng trưởng củarễ tóc vì mức độ biểu hiện cao hay thấp sẽ làm yếu sự tăng trưởng của những cơ

quan này.

Gen rolC từ nhiễu T-DNA Ri plasmid khác nhau thì tương tự nhau về kíchthước vào khoảng 540 bp và mã hóa protein có 179 - 181 amino acid Cây chuyểngen có biéu hiện rolC thì thấp và giảm tính trội ngọn, lá mũi mác, hoa tự sớm Sựbất hoạt của các gen rol đưa dén su thay đổi hình thái hoc của rễ hoặc loại bỏ sựhình thành rễ tóc Sự biểu hiện của rolC ảnh hưởng đến sự cân bang của cáccytokinin dạng tự do và kết hợp, cũng như auxin và gibberellin trong tế bao thựcvật Sự biểu hiện rolC cũng làm giảm đáng ké mức độ acid abscisic (ABA),

polyamine, và ethylene.

Gen rolD chỉ được tìm thay trong Ri T-DNA của dòng sản xuất agropine Nó

có kích thước 1.032bp và mã hóa một protein có 344 amino acid, đó là một

ornithine cyclodeaminase enzyme xúc tác sự chuyền hóa ornithine thành proline Sựbiểu hiện của rolD trong cây chuyển gen sẽ kích thích ra hoa sớm, làm tăng sốlượng hoa và có thể có liên quan đến sức sản xuất của cây Thêm vào đó, sự tích lũyproline có thể là một phản ứng bảo vệ liên quan đến stress (Taylor, 2007)

2.2.4 Cơ chế chuyển T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vậtQuá trình cắt đoạn T-DNA ra khỏi plasmid và vận chuyển nó vào tế bào thựcvật trước hết phụ thuộc vào sản phẩm của các gen vir V1 khuẩn xâm nhiễm tại batkỳ vị trí tốn thương nào trên thân cây Cây có vết thương do sự hỏng ngẫu nhiên củamang tế bao thực vật hoặc do vi khuẩn tiết ra hỗn hợp những chất được mã hóa bởicác gen vir Hoạt động của các gen này được hoạt hóa bởi hợp chất phenolic củacây (ví dụ như acetosyringone, catechol, các dẫn xuất của chalcone ) Ngoài ra, các

monosaccharide như glucose, arabinose có mặt trong môi trường cũng làm tăng khả

năng gây cảm ứng nhóm gen vir.

Protein virA đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định loại cây chủ bịnhiễm bởi Agrobacterium Trong thực tế, Agrobacterium không có khả năng xâmnhập vào cây một lá mam, có thé protein vird không nhận biết các tín hiệu do câymột lá mam tiết ra Nói chung, Agrobacterium chỉ gây hai ở cây hai lá mam, vì vậycác nhà nghiên cứu cho rang Agrobacterium chỉ có thé đưa T-DNA vào hệ gen cáccây hai lá mầm Tuy nhiên gần đây nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vikhuẩn, các cây một lá mam cũng có thé sản xuất opine va vì thế có thé khai thác khảnăng bién nạp gen của Agrobacterium vào cây một lá mầm Hiện nay, người ta cũngđã thành công trong việc chuyển gen vào một số cây một lá mầm như lúa, mía qua

trung gian A tumefaciens.

Khi cây nhiễm A rhizogenes, do T-DNA hợp nhất vào trong bộ gen của câychủ bắt đầu hoạt động và sản xuất ra auxin, opine, toàn bộ sinh trưởng cua cây bi rỗiloạn, các tế bào phân chia vô tô chức và tạo ra rất nhiều rễ tóc Opine được sử dụngnhư một loại thức ăn nhờ gen chuyền hóa opine trên Ri plasmid

Đề gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A rhizogenes phải tiếpxúc với thành tế bao thực vật bị tổn thương Qua trình này được thực hiện nhờ cácgen chvA và chvB Gen chvB mã hóa một protein liên quan đến hình thành B-1,2glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyền, định vịở màng trong của tế bào vi khuẩn Protein vận chuyển giúp vận chuyển B-1.2-glucan vào khoảng giữa thành tế bào và mảng sinh chất B-1,2-glucan giữ vai tròquan trong dé vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật Nếu

không có sự tiếp xúc nay, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA Cac san phẩm proteincủa vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi khuẩn vào tế bào thựcvật Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cat T- DNA khỏi plasmid, cảmứng thay đối màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phan T-DNA qua mang vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vat, vận chuyển tới nhân rồicuối cùng xâm nhập vảo bộ gen của cây chủ

Thực chat, chỉ riêng T-DNA của plasmid được chuyển vao bộ gen tế baothực vật, mà không còn phan nào khác Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm củacác gen vir và gen chy quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-

DNA Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm

ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vung vir, đặc biệt là protein từ gen virEmang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật Chúng hoạt động như các tín hiệu nhậnbiết và khởi động quá trình dẫn truyền Trước hết gen virA trong tô hop gen vùngvir được phosphoryl hóa nhờ tác động của các hợp chất phenol như acetosyringonegiải phóng ra từ các tế bao thực vật ton thương Sản phẩm của quá trình nay lại tiếptục phosphoryl hóa gen virG Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toản bộcác gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE Trướcđó, khi gen virD được hoạt hóa, san phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB củaT-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của plasmid thành các sợi đơn Đồngthời, quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thâm suất màng tế bảo thựcvật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng Các sợi đơn T-DNA được gan vao proteindo gen virE tổng hop va dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn Ngay sau đó,sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật Cầu nối chính là sự tiếp hợpgiữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành Khi T-DNA đã đượcchuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp nhất vào bộ gen tế bảothực vật được 6n định va di truyền như các gen bình thường khác (Nguyễn Hoàng

Lộc, 2008).

2.2.6 Cơ sở phân tử và sinh lý của sự hình thành rễ tócSau khi A rhizogenes tiếp xúc tế bào thực vật, một đoạn nhỏ của plasmid Rilà T-DNA sẽ được chuyển va gan vào bộ gen của tế bào thực vật Theo cách này T-

DNA được duy trì ôn định trong bộ gen ma nó chuyền vào Doan T-DNA có nguồngốc hoang dại mã hóa các gen gây độc (aux, rol) và các gen chuyển hóa opine danđến sự phát triển mô bat thường và tạo opine Từ vùng bị nhiễm khuẩn, mẫu thựcvật hình thành rễ nhánh bất thường gọi là rễ tơ Những rễ này có đặc điểm là pháttriển ăn nghiêng, phân nhánh nhiều, tăng trưởng nhanh trong môi trường không bổ

sung hormon thực vật (Rao va Ravishankar 2002 trích dẫn bởi Veena và Taylor

2007) Những đặc tính này làm cho rễ tơ trở thành một công cụ được sử dụng rộng rãicho việc sản xuất các hợp chất thứ cấp, khảo sát chức năng gen, và nghiên cứu sinh

ứng.

Trong nghiên cứu tương tự của Savka và cs (1989), tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo rễcủa 10 kiểu gen đậu nành sử dung A rhizogenes K599 (chủng cucumopine) là 37%.Ở chủng mannopine 8196, tỉ lệ này là 3% trên 4 kiểu gen đậu nành và chủngagropin 1855 và A4 có tỉ lệ mẫu tạo rễ thấp nhất (1%) Mẫu trụ hạ diệp tuy xuấthiện rễ sau khi lây nhiễm với tất cả các chủng A rhizogenes trong khảo sát, nhưngkhông phải là rễ tơ có khả năng tổng hợp opin

2.3.2 Môi trường

Có thé sử dụng nhiều môi trường khác nhau dé duy tri Agrobacterium như

LB (Cho và cs, 2000, Kurma và cs, 2006, AL-Yozbaki, Rasheed va Salih 2015),

yeast — manitol, nutrient yeast, YDPK, YEB, YMB (Wise, Liu va Binns 2006) hay

Y EP (Olhoft va cs, 2013).

Trong quá trình chuẩn bị mẫu đậu nanh in vitro và quá trình cảm ứng tạo rễtơ sử dung A rhizogenes, nhiều công thức môi trường khác nhau đã được sử dụng.Môi trường gieo hạt đậu nành in vitro có thể gồm đường va agar (Cho và cs, 2000,Weber và Bodanese — Zanettini 2011); B5 (Zia va cs, 2010), môi trường BS có điều

chính (Olhoft và cs, 2013).

Ở giai đoạn đồng nuôi cay A rhizogenes và mẫu đậu nành, môi trường B5 (Ziavà cs, 2010), BS có điều chỉnh (Olhoft va cs, 2013), hay môi trường MS được sửdụng Cho va cs (2000) đã đặt mẫu sau lây nhiễm lên giấy lọc được làm âm bangnước cất đã khử trùng, bề mặt mẫu mang vết thương hướng lên trên

Dé loại A rhizogenes sau giai đoạn đồng nuôi cay, các tác giả đã rửa mau 2 -3lần với dung dịch rửa mẫu như nước cất hap khử trùng, môi trường MS có bố sungcefotaxime 250 mg/L và carbenicillin 250 mg/L hay môi trường BŠ bổ sungcefotaxime 1 g/L (Zia và cs, 2010) Trong khi đó, Cho và cs (2000) chỉ chuyển mẫusang môi trường MXB (khoáng MS kết hop vitamin B5) có b6 sung carbenicillin;Nguyễn Như Nhứt và Bùi Văn Lệ (2016) chuyển mẫu dừa cạn (Catharanthus roseus)sang môi trường 1/2MS bồ sung cefotaxime 500 mg/L và ủ trong tối 7 ngày ở 25 °C.Ở giai đoạn cảm ứng tạo rễ, môi trường cảm ứng thường là môi trường B5 hay MS cóbồ sung thành phần kháng sinh giống giai đoạn loại vi khuẩn (Olhoft và cs, 2007)

2.3.3 Mật độ vi khuẩn A rhizogenes khi lay nhiễmMật độ Agrobacterium là một yêu tô quan trọng liên quan đến hiệu qua lây

nhiễm Mật độ Agrobacterium phan ánh tình trạng tăng trưởng và Agrobacterium ở

pha tăng trưởng được cho là có khả năng lây nhiễm cao hơn Mật độ Agrobacteriumtối ưu đối với từng đối tượng thực vật thay đổi với giá trị ODøoo từ 0,6 đến 1,8 (Li và

cs, 2017) AL-Y ozbaki, Rasheed và Salih (2015) đã ngâm mẫu đậu nành trong dịch A

rhizogenes ODsoonm ~ 0.5 và lây nhiễm mau trực tiếp với dịch khuẩn OD«oonm ~ 1,0

2.4 Lay nhiễm A rhizogenes lên mẫu thực vật

Mẫu thực vật thường được lây nhiễm Agrobacterium bang cách tạo vết thương.Mẫu được tạo vết thương bang lưỡi dao hoặc bang kim, sau đó được ngâm trong dịch

khuẩn từ 15 — 30 phút Acetosyringone thường được thêm ở giai đoạn nay dé tăng

hiệu quả lây nhiễm (Zia và cs, 2010) AL-Yozbaki, Rasheed và Salih (2015) đã lây

nhiễm A rhizogenes lên mẫu đậu nành theo hai cách: lây nhiễm trực tiếp, dùng daukim tiêm của xi-lanh 1 mL tạo vết thương lên mẫu sau khi nhúng kim vào dịch khuẩn:ở cách thứ hai, dùng kim tiêm tạo vết thương lên mau, sau đó ngâm mẫu vào dịchkhuẩn trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Đối với các qui trình tạo rễ tơ ex vitro, khuẩnlạc A rhizogenes được tiêm trực tiếp vào trụ hạ diệp mầm đậu nành 5 ngày sau khi

gieo (Kereszt va cs, 2007).

Ngoài ra, một số biện pháp kết hop đã được sử dung ở giai đoạn này nhằmtăng hiệu quả lây nhiễm Agrobacterium như sóng siêu âm, sử dụng CaCh, enzymephân giải vách tế bào (cellulase, pectinase) đã được Kurma và cs, (2006) áp dụng trênmẫu lá cây thuốc lá (Nicotiana tabacum var Anand 115)

2.5 Chuyến gen bang vi khuẩn A rhizogenes trên cây đậu nành

Hàng trăm bản phiên mã của các gen khác nhau đã được xác định qua phan

tích microarray ở các giai đoạn tương tác cộng sinh giữa cây đậu M truncatula và

Sinorhizobium meliloti Kết qua này cho thay khả năng các chất điều hòa ở thực vậtlà một phần của chương trình cộng sinh, ngoài các gen liên quan đến quá trình lâynhiễm vi khuẩn, sự hình thành nốt sân, phản ứng tự vệ và các protein truyền tín hiệu

(Estrada-Navarette và cs, 2006) Sự tương tác giữa các gen vùng rễ đậu nành và các

vi sinh vật đất, tuyến trùng bào nang ở đậu nành — nguyên nhân chính gây ảnhhưởng năng suất đậu nành trên toan thé giới, cũng được tập trung nghiên cứu (Bent,1996) Việc chuyển gen trên cây đậu nành giúp đây nhanh quá trình khai thác thông

tin và chức năng bộ gen.

Nghiên cứu chuyển gen trên cây đậu nành sử dung Agrobacteriumtumefaciens không ngừng phát triển từ năm 1988 (Olhoft va cs, 2007) Tuy nhiênviệc sử dụng vi khuẩn này không thuận tiện cho việc nghiên cứu sinh học và chức

năng gen vùng rễ do thời gian tái sinh mẫu kéo dài Bên cạnh đó, cây họ đậu thường

có tỉ lệ đáp ứng với vi khuẩn lây nhiễm thấp và việc sử dung Agrobacterium

rhizogenes với kha năng cảm ứng tạo rê tóc tại vi trí lây nhiễm sẽ giúp khăc phục

hạn chế này (Somers và cs, 2003) Sử dụng vi khuẩn A rhizogenes tạo cây đậu nànhbiến đổi gen là lựa chọn phù hợp cho những nghiên cứu về bộ gen chức năng tậptrung vào sinh học vùng rễ và tương tác giữa rễ và vi sinh vật (Estrada — Navarrete

và cs, 2006; Kereszt và cs, 2007; Dolatabadian và cs, 2013).

Đến nay, những hiểu biết cơ bản về cơ chế phân tử của sự biến nạp gen thựcvật bởi những thành viên của chi Agrobacterium đều là dựa trên những nghiên cứumở rộng sử dung A tumefaciens Cả 2 loài A tumefaciens va A rhizogenes đều lâynhiễm vào tế bào thực vật ở vị trí vết thương do tín hiệu là hợp chất phenol đượctiết ra từ những tế bảo bị tốn thương (Veena va Taylor, 2007)

Tất cả các chủng A rhizogenes đều có một plasmid kích thước lớn có tác dụngcảm ứng tạo rễ tơ ở thực vật (plasmid Ri) Plasmid Ri chứa một ving DNA có tínhbảo tôn cao cần thiết cho quá trình hình thành rễ tóc ở thực vật thông qua biến đổi ditruyền Quá trình cảm ứng tạo rễ tóc ở thực vật do A rhizogenes cũng tương tự nhưquá trình tạo khối u do A tumefaciens (Gelvin 2003, Veena và Taylor 2007)

Các chủng A rhizogenes được phân thành nhiều dòng khác nhau dựa trênkiểu opine mà chúng tạo ra Hai nhóm A rhizogenes pho biến gồm dòng agropine(chủng A4, 15834, HRI, LBA9402, 1855) cảm ứng tạo rễ để tổng hợp agropine,

mannopine va các acid có liên quan, va dòng mannopine (các chủng 8196, TR7,

TRI101) cảm ứng rễ dé sản xuất mannopine va các acid tương ứng (Sevón và cs,

2002) Ngoài ra còn có dòng cucumopine (đại diện là chung 2659) và mikimopine

(đại diện là chủng 1724) Trong số các chủng A rhizogenes đã được biết, A

rhizogenes K47, K599 và HRI là các chủng gây độc cao có khả năng lây nhiễm cho

nhiều loài thực vật khác nhau (Ozyigit, Dogan và Tarhan, 2013)

Savka và cộng sự (2006) đã xây dựng quy trình tạo rễ tóc trên 10 giống đậunành được sử dụng ở Mỹ để nuôi tuyến trùng Rễ tóc từ trụ hạ diệp và lá mầm đậunành lây nhiễm với A rhizogenes được sử dụng dé nhân nuôi tuyến trùng bào nangđậu nành So với mẫu rễ tự nhiên có thời gian sống xác định trong môi trường dinh

dưỡng ré tóc có thời gian sông không xác định trong môi trường nuôi cay mô, là

Dolatabadian và cs (2013) đã thực hiện chuyển gen trên đậu nành (Glycine

max L (Merr.) cv L17) sử dung A rhizogenes K599 mang gen GmNFR5qa dưới sự

kiểm soát của promoter CaMV35S Nghiên cứu nay đã tạo ra cây đậu nành“composite” mang rễ tơ và rễ tự nhiên bị loại bỏ Kết quả khảo sát sự tăng trưởngcủa cây đậu nành cho thấy cây “composite” tăng trưởng tốt hơn, có nhiều rễ, nhiềunốt san và hoạt tính nitrogenase cao hơn so với bộ rễ tự nhiên Ở điều kiện stressmặn, cây đậu nành với bộ rễ chuyền gen cho thay sự giảm một số hoạt động như

peroxide lipid, tích lũy proline, hoạt tính của catalase/proxidase.

Weber và Bodanese — Zanettini (2011) đã chọn lọc được 4 giống đậu nànhBrazil có khả năng tạo rễ tóc cảm ứng bởi A rhizogenes ở điều kiện in vitro và exvitro Mẫu đậu nành 4 ngày với kích thước đồng nhất được lây nhiễm A rhizogenesmang plamsid p35S-GFP Mẫu đậu nành biểu hiện protein huỳnh quang GFP ở ítnhất một rễ tóc được sử dụng dé xác định tần số chuyển gen Mẫu lá mam cắt từmau đậu 4 ngày tuổi được lây nhiễm A rhizogenes mang plasmid pCAMBIA 1301,chứa gen gusA Tân số chuyển gen va số ngày rễ tóc xuất hiện sau khi nhiễm khuẩnđược đánh giá Tan số chuyển gen và thời gian rễ tóc xuất hiện thay đổi tùy vàokiểu gen Các kiểu gen nhạy cảm với A rhizogenes được đề nghị sử dụng cho cácthí nghiệm chuyền gen

Cho va cs (2000) đã tiến hành lây nhiễm 10 giống đậu nanh với chủng A.rhizogenes K599 có/không mang vector nhị cấp pBI121 hoặc pBINm-gfp5-ER Kếtquả có 54 - 95 % mẫu lá mầm tạo rễ tóc từ vết thương trên môi trường chọn lọcMXB chứa 200 ug/L kanamycine và 500 ug/L carbenicillin Nghiên cứu cho thấytuyến trùng dạng nang có thé hoan tat chu trình sống trong rễ tóc đậu nành chuyểngen biểu hiện GFP Đây là hệ thống lý tưởng cho các thử nghiệm gen có khả năngkháng tuyến trùng dạng nang

Dựa theo các nghiên cứu trên, chúng tôi đã tiễn hành lây nhiễm vi khuẩn A.rhizogenes trên mẫu đậu nành bang phương pháp đồng nuôi cay và xác định loạimẫu đậu nành và chủng vi khuẩn A rhizogenes cho hiệu quả cao trong tạo rễ tóc.Từ các mẫu đậu nành phát triển được sau khi lây nhiễm, chúng tôi tiến hành xác

định mâu rê tóc đậu nành chuyên gen.

Chuong 3: VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

3.1 Địa điểm — Thời gian nghiên cứuĐề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học tích hợp thực vật, Bộmôn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, từ tháng

11 năm 2017 đến tháng 5 năm 2018

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứuGiống đậu nành HLDN 29 được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu Thựcnghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc thuộc Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền

Nam.

Giống đậu nành DT84 của Công ty cỗ phan giống cây trồng miền Nam.Vi khuẩn A rhizogenes không mang plasmid tái tổ hợp gồm các chủng ICPB

TR7, ATCC 11325, ATCC 15834 do Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học

Nông Lâm Tp Hỗ Chí Minh cung cấp

3.2.2 Hóa chất và môi trường

- Tăng sinh A rhizogenes: môi trường YEP (pepton 10 g/L, yeast extract 10

g/L, NaCl 5 g/L, pH 7,0).

- Môi trường nuôi cấy đậu nành B5, CCM, LCCM, MXB, LMXB (Bang 2.1)

- Khang sinh cefotaxime, carbenicillin (Biobasic, Canada).

- Acetosyringone (Himedia, An Độ)

- GeneJET plant genomic DNA purification kit, Thermo Fisher Scientific.

- Ly trích plasmid: ISOLATE IH Plasmid Mini Kit (Bioline, Anh).

- Hóa chat PCR: MyTaq Mix (Bioline), primer (Bang 2.2).- Hóa chất điện di: HyperLadder 100 bp plus và 1kb plus (Bioline), agarose(Bioline), TBE 10X buffer (Bioline), chất nhuộm DNA GelRed (TBR, Việt Nam)

Bang 3.1 Thành phan các loại môi trường sử dụng trong cảm ứng tạo rễ to

trên mâu đậu nành

-Sucrose 3% 3% 3% 3% 3%(%, w/v)

pH 5,7-5,8 54 54 5,7-5,8 5,7-5,8

(AL-Y ozbaki, Rasheed va Salih, 2015)

Bang 3.2 Primer su dung trong nghiên cứu

Gen Trinh tự primer Kích thước Tài liệu

sản phẩm tham khảo(bp)

Golgin 84 F 5-ETG GAC AAG GAG AGA 121 Marcolino-Gomes

CTC CAC -3’ vacs, 2015R 3’-TGC GAG GCT ACG AAA

ACT TC -3’

Rol C F 53°-TAA CAT GGC TGA AGA 534 Fattahi va cs, 2013

CGA CC-3’R 3¥’-AAA CIT GCA CTC GCCATG CC-3’

Vir D F Š5- ATG TGG CAA GGC AGT 438 Fattahi va cs, 2013

AAG CCCA-3’R S’- GGA GTC TIT CAG CAGGAG CAA-3’

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Tạo nguồn mau đậu nành in vitro và chuan bị A rhizogenes

3.3.1.1 Tạo nguén mẫu đậu nànhChọn các hạt đậu nành có kích thước lớn và đồng đều Sau đó khử trùng bềmặt bằng khí chlorine Chuan bị một bình hút 4m kin đặt vào đó một cốc nhỏ cóchứa 50 mL dung dịch javel 5% Lay hạt đậu nanh cho vào đĩa petri, đặt đĩa petrichứa đậu nành vào bình hút âm Tiếp theo cho vào bình hút âm 2 mL dung dịch HCI12N và nhanh chóng đậy kín bình kín lại Sau 14 - 18 giờ mở nắp bình hút âm vàngay lập tức đậy nap đĩa petri Lúc này hạt đậu nành đã được khử trùng bề mặt và

săn sàng sử dụng.

Gieo hạt đậu nành đã khử trùng vào chai thủy tinh 500 mL chứa 100 mL môi

trường B5 b6 sung sucrose (3%), agar (0,8% ), pH 5,8 Mỗi chai cay 10 hạt đậunành, đặt dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày ở 25 + 1°C trong 5 - 8 ngày Mẫu lámam và trụ hạ diệp đậu nành từ | - 5 ngày tuổi được sử dụng cho các thí nghiệm

(Cao và cs, 2009).

3.3.1.2 Chuẩn bị vi khuẩn A rhizogenesCác dòng A rhizogenes khác nhau có khả năng lây nhiễm khác nhau trên cácloài và giống thực vật khác nhau (Taylor, 2007) Dé xây dựng qui trình tạo rễ tóccho đậu nành cần xác định chủng vi khuẩn phù hợp đối với các giống đậu nành

đang nghiên cứu, sử dung 3 chung A rhizogenes 15834, 11325, TR7 đang được bao

quản ở Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minhđể lây nhiễm trên mẫu lá mắm va trụ hạ diệp của cây đậu nành in vitro Theo dõi sựcảm ứng tạo rễ tóc trên các loại mẫu, từ đó xác định chủng A rhizogenes phù hợp

cho quá trình lây nhiễm

Các chủng vi khuẩn sử dụng cho thí nghiệm được bảo quản trong dung dịchglycerol 15% theo phương pháp của Olhoft và cs (2003) Vi khuẩn A rhizogenesđược cấy ria trên môi trường YEP Sau 48 giờ chon một khuẩn lạc đơn dé tăng sinhtrong chai 500 mL có chứa 100 mL môi trường YEP lỏng, ở điều kiện lắc 150vòng/phút, nhiệt độ phòng trong 12 - 15 giờ Do độ hap thu ánh sáng của dịch khuânở bước sóng 600 nm (ODeoo) Khi giá trị ODøo đạt 0,5 - 1,0 thì tiến hành ly tâm thusinh khối vi khuẩn tốc độ 3500 rpm trong 20 phút ở 49C (1 ODeoo tương đươngkhoảng 3 x 10° cfu/mL) Sinh khối vi khuân được hòa tan trong môi trường LCCMcó bố sung acetosyringone 200 uM dé ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi dùng

Lay nhiêm A rhizogenes trên mau dau nành

Đồng nuôi cay 3 ngay trong môi trường CCM có bồ sung 200 uMacetosyringone và dé các mẫu ở 25 °C trong điều kiện tối

|

Rửa 2 lần với môi trường LMXB sau đó ngâm trong môi trường LMXB có bổsung 500 mg/L cefotaxime và 400 mg/L carbenicillin lắc 100 rpm trong 30 phút

|Cay mẫu trên môi trường MXB có bổ sung 500 mg/L cefotaxime

Mau được đặt trong điều kiện chiếu sáng 16 gid/ngay ở 28 °C

|

Tiên hành ghi nhận sô rê tạo thành và tỉ lệ mâu ra rê sau 14 ngày

đậu nành (HLDN29 và DT84) và sử dụng 3 chung A rhizogenes ICPB TR7, ATCC

11325, ATCC 15834 nham xác định loại mẫu va chủng vi khuẩn phù hop cho việc

cảm ứng tao rê toc ở đậu nành.

Tạo vết thương trên mẫu lá mam và trụ ha diệp cua đậu nành in vitro bănglưỡi dao số 11, khoảng 3 vết cắt/mẫu Tiếp theo mẫu đậu nanh được ngâm trongdịch khuẩn, lắc với tốc độ 100 rpm/phút trong thời gian 30 phút ở điều kiện tối(Kurma va cs, 2006) Sau đó, mẫu được thấm bớt vi khuẩn băng giấy thấm đã khửtrùng và đặt trong dia petri chứa môi trường CCM Quá trình đồng nuôi cay diễn raở điều kiện tối ở 25°C trong vòng 3 ngày Sau thời gian đồng nuôi cấy, vi khuẩnđược loại khỏi mẫu bang cách rửa 2 lần với môi trường LMXB sau đó rửa trongmôi trường LMXB có bố sung kháng sinh cefotaxime 500 mg/L và carbenicillin400 mg/L trong 30 phút ở điều kiện lắc với tốc độ 150 rpm Cuối cùng mẫu đượcchuyển sang môi trường MXB răn có chứa thành phần kháng sinh tương tự trên

Duy trì mẫu ở nhiệt độ 28°C

Thí nghiệm được thực hiện trên hai giống đậu nành gồm HLDN29 và DT84.Mỗi thí nghiệm được bố tri theo kiểu hoan toan ngẫu nhiên 2 yếu tố (3 chủng vikhuẩn A rhizogenes và 2 loại mẫu in vitro), gồm 8 nghiệm thức với 3 lần lặp lại(Bảng 3.1) Mỗi nghiệm thức gồm 10 hạt (20 lá mam và 10 trụ hạ diệp) Các mẫuđược cấy trên đĩa petri (đường kính 10 em và sâu 2 em), 10 mẫu mỗi đĩa Sau 2 tuầnghi nhận tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ tóc và số rễ trung bình/mẫu

Số mau tạo rễ

* 100Tỷ lệ mâu cảm ứng tạo rê tóc (3%) = ———————

Tổng số rễ

So rê trung bình trên một mẫu (rễ) =———————— =

SỐ mau cam ứng tạo re

Bang 3.3 Các nghiệm thức của thí nghiệm xác định chung A rhizogenes và loại

mâu phù hợp cho cảm ứng tạo rê

STT Nghiệm Thức các chung ụ Các loại mẫu số Mong mẫu

khuân (Mâu/nghiệm thức)

1 NTI ATCC 15834 Lá mâm 602 NT2 ATCC 11325 Lá mầm 603 NT3 ICPB TR7 Lá mầm 60

4 NT4 ATCC 15834 Trụ hạ diệp 30

5 NT5 ATCC 11325 Trụ hạ diệp 30

6 NT6 ICPB TR7 Tru ha diệp 30

7 NT7(Đối chứng) Lá mầm 608 NT8 (Đối chứng) Trụ hạ diệp 30

3.3.2.2 Xác định hiệu quả diệt khuẩn A rhizogenes của các loại kháng sinhLoại bỏ vi khuẩn khỏi các dòng rễ tóc là một giai đoạn quan trọng loại đi tácnhân cạnh tranh dinh dưỡng với mẫu cấy Carbenicillin va cefotaxime là các loạikháng sinh phố biến được sử dụng để loại A rhizogenes khỏi mẫu sau thời gianđồng nuôi cay Hiệu quả diệt khuẩn của các loại kháng sinh này sẽ được khảo sát

đôi với chung vi khuân được su dụng lây nhiễm.

Giống đậu nành DT84 được sử dụng ở thí nghiệm này Sau 3 ngày đồng nuôicay với vi khuẩn, mẫu được rửa bằng môi trường LMXB có bồ sung carbenicillinvà cefotaxime ở dạng kết hợp hoặc riêng lẻ trong 30 phút, lắc 150 vòng/phút (Oonovà cs, 1993: Kurma và cs, 2006; Lee va cs, 2010; Zia va cs, 2010); mẫu đối chứngđược rửa bang môi trường LMXB (Bảng 3.1) Các mẫu này được chuyển sang đĩamôi trường MXB agar và theo dõi trong vòng 2 tuần

Bang 3.4 Các nghiệm thức khảo sát hiệu quả diệt khuẩn của các loại kháng sinh

Nghiệm thức Nông độ kháng sinh (mg/L)

Carbenicillin Cefotaxime

Đôi chứng, M 0 0

C 250 0

C5 500 0C10 1000 0

Cf 0 250Cf5 0 500Cf10 0 1000

CCf 500 500

Thi nghiệm gồm 8 nghiệm thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên.Mỗi nghiệm thức gồm 20 đĩa, mỗi đĩa được cây 10 mẫu và được lặp lại 3 lần Chỉtiêu theo dõi gém tỉ lệ mẫu sống (%), tỉ lệ mẫu không tái nhiễm A rhizogenes (%),thời gian cảm ứng tạo rễ tóc và hình thái rễ Các chỉ tiêu trên được ghi nhận sau 21

ngày nuôi cây.

Nghiệm thức cho hiệu quả diệt khuẩn tốt nhất và không ảnh hưởng đến sự

phát triên của ré sẽ được chon sử dụng ở nội dung ti€p theo.

3.3.2.3 Anh hướng tuổi của mẫu đậu nành đến sự cảm ứng tạo rễ tócThời gian đồng nuôi cấy trong các qui trình chuyển gen trên cây họ đậu sửdụng A rhizogenes được công bố cũng rất khác nhau, dao động từ 2 — 5 ngày

(Jaiwal và cs, 2001; Suraninpong, 2004; Paz và cs, 2006; Zia và cs, 2010; Yadav va

cs, 2012).

Thí nghiệm này được tiến hành trên hai giống đậu nành HLĐN29 và DT84nhằm xác định giai đoạn mẫu đậu nành đáp ứng tạo rễ tóc tốt nhất Loại mẫu, chủngvi khuẩn, loại và nồng độ kháng sinh dùng để loại vi khuẩn phù hợp được xác địnhở các thí nghiệm trước được áp dụng cho quá trình cảm ứng tạo rễ tóc Mầm đậunành từ 0-5 ngày tudi được dùng làm nguyên liệu để xác định ảnh hưởng của độtudi mẫu Quá trình lây nhiễm vi khuẩn và điều kiện đồng nuôi cay được thực hiện

tương tự thí nghiệm 3.3.2.2.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tổ gồm 5nghiệm thức; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 20 mẫu Các mẫu được cây trênđĩa petri (10 mẫu/đĩa) Ghi nhận kết quả sau khi loại vi khuẩn khỏi mẫu 14 ngày.Chỉ tiêu theo dõi gồm tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ tóc, số rễ tóc trung bình trên một

mẫu sau khi lây nhiễm A rhizogenes

3.3.2.4 Ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến qua

trình cam ứng tạo rê tóc ở mau đậu nành

Thí nghiệm được tiễn hành nhăm xác định cách thức lây nhiễm A rhizogenescho cảm ứng tạo rễ tóc trên đậu nành in vitro Loại mẫu, chủng vi khuẩn, loại vànông độ kháng sinh dùng để loại vi khuẩn đã xác định ở các thí nghiệm trước được

áp dụng cho thí nghiệm này.

Mẫu đậu nành được tạo vết thương băng 2 cách Cách thứ nhất, lây nhiễmtrực tiếp băng cách dùng dao nhúng vào dịch khuẩn sau đó cắt nhẹ lên mẫu Nghiệmthức đối chứng 1 (ĐCI) được thực hiện bằng cách nhúng dao vào môi trườngLCCM sau đó tạo vết thương Ở cách thứ hai, ngâm mẫu trong dịch khuẩn, mẫuđược tạo vết thương băng đao, sau đó được ngâm trong dịch khuẩn 30 phút, ở điềukiện lắc với tốc độ 100 rpm Đối với nghiệm thức đối chứng 2 (DC), mẫu được taovết thương, sau đó được ngâm trong môi trường LCCM trong 30 phút lac với tốc độ100 rpm Tiếp theo mẫu được chuyển sang môi trường CCM đồng nuôi cay 3 ngày,sau đó rửa khuẩn như các thí nghiệm trước và chuyển sang môi trường MXB có bố

sung kháng sinh cefotaxime 500 mg/L.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố Có 4nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 20 mẫu Các mẫu 4 đượccay trên đĩa petri 20 mẫu mỗi đĩa Đông nuôi cấy trong tối, nuôi cay cho sự tăngtrưởng của mẫu trong điều kiện chiếu sáng 16 gid/ngay ở 25°C Sau 2 tuân ghi nhậnkết quả Chỉ tiêu theo dõi gồm tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ tóc (%), số rễ tóc trung

1,3) Điều kiện mẫu đậu nành, chủng vi khuẩn, kháng sinh và cách thức lây nhiễm

xác định ở các thí nghiệm trước được áp dụng cho thí nghiệm này.

3.3.3 Duy trì các dòng rễ giả định chuyển genRễ tóc xuất hiện ở các mẫu được lây nhiễm A rhizogenes được chon tăng sinhtrên môi trường B5 không chứa hormon tăng trưởng thực vat Đoạn rễ 2 cm từ mỗidòng rễ giả định chuyển gen được nuôi trên môi trường BS (Olhoft và cs, 2007)

Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 3 tuần nuôi cây gôm: tỉ lệ mâu sông

(%), hình thái của mâu giả định được chuyên gen va mau đôi chứng (đoạn rê đậu

nành in vitro không được lây nhiễm khuẩn)

3.3.4 Khăng định mẫu chuyển gen bằng phương pháp PCRLy trích DNA Tiễn hành ly trích DNA tổng số từ 100 mg trọng lượng tươimẫu rễ giả định chuyển gen và mẫu rễ đậu nành in vitro không lây nhiễm A.rhizogenes sử dung kit ly trích và DNA thực vật Ly trích DNA plasmid vi khuẩn A.rhizogenes băng ISOLATE II Plasmid Mini Kit

Gen rol là các gen mã hóa các yếu tố điều khiến sự hình thành rễ tóc nam ở

vùng T-DNA cua plasmid Ri ở A rhizogenes (Taylor, 2007) Sự hiện diện của gen

này ở mẫu giả định chuyển gen được xác nhận bằng cặp môi chuyên biệt cho gen

rolC qua phương pháp PCR Gen virD chỉ có 6 Ri plasmid của A rhizogenes va

không tôn tại trong mẫu rễ chuyển gen nên sự hiện diện của gen này ở các mẫuDNA ly trích cũng được kiểm tra để đảm bảo các mẫu rễ chuyển gen thực sự đãđược chuyển gen và không nhiễm A rhizogenes Golgin 84 là một gen thường trực

ở đậu nành.

Phản ứng PCR được tiến hành với tong thé tích 25 wL, thành phan phản ứngtheo bảng 3.5 và điều kiện phản ứng PCR như bảng 3.6 Nhiệt độ bắt cặp đối vớicác cặp môi phát hiện gen rolC, virD và Golgin 84 đều là 57°C