Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát hoạt động và tính chất của protease trong quá trình tự phân của trùn quế (Perionyx Excavatus)

NHIEM VỤ VÀ NOI DUNG:- _ Tối ưu hóa điều kiện hoạt động protease trùn qué trong quá trình tự phân- _ Tối ưu hóa điều kiện thu nhận protease - Khao sát một số tinh chat protease thu nhận

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

a

TRUONG THI THUY LIEN

KHAO SAT HOAT DONG VA TINH CHAT CUA PROTEASE

TRONG QUA TRINH TU PHAN

CUA TRUN QUE (PERIONYX EXCAVATUS)

Chuyén nganh: Cong Nghé Sinh HocMã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HO CHI MINH, tháng 08 năm 2017

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOAĐHQG -HCM

Công trình được hoàn thành tại:- Phòng BioLab 108B2, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Dai học Bach Khoa,Thành phố Hồ Chí Minh

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS HUỲNH NGỌC OANH

Cán bộ cham nhận xét 1: TS Lương Thị Mỹ Ngân

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyênngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

PGS.TS.LÊ THỊ THỦY TIEN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨHọ tên học viên: Trương Thị Thùy Liên MSHV: 13310304Ngày, tháng, năm sinh: 11/09/1986 Nơi sinh: TP Hồ chí MinhChuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 604280

I TÊN DE TÀI:“ Khảo sát hoạt động và tính chất của protease trong quá trình tự phân của trùnqué (Perionyx excavatus)”

II NHIEM VỤ VÀ NOI DUNG:- _ Tối ưu hóa điều kiện hoạt động protease trùn qué trong quá trình tự phân- _ Tối ưu hóa điều kiện thu nhận protease

- Khao sát một số tinh chat protease thu nhận từ trùn qué- Bước đầu ứng dung dich trùn tự phân làm phân bón cho cây tràIll NGAY GIAO NHIỆM VU: 16/01/2017

IV NGAY HOÀN THÀNH NHIEM VU: 18/06/2017V CÁN BỘ HUONG DAN: TS Huynh Ngọc Oanh

Tp HCM,ngày tháng 0S năm 2017CÁN BỘ HƯỚNG DAN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TS HUỲNH NGỌC OANH PGS.TS.NGUYEN THUY HƯƠNG

TRƯỞNG KHOA KY THUAT HOA HOC

LOI CAM ON

Đầu tiên, con xin gửi những lời cảm ơn chân thành nhất đến Ba Me, người đãnuôi dưỡng chăm sóc và dạy dỗ con nên người Cảm ơn Ba Mẹ và những ngườithan yêu đã luôn động viên, tạo mọi điều kiện cho con học tập và luôn bên cạnh controng suốt thời gian qua

Bên cạnh đó, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Huỳnh Ngọc Oanh đãhết lòng hướng dẫn, tận tình giúp đỡ em về chuyên môn cũng như tỉnh thân, ngườiluôn tạo cho em những cảm hứng, cũng như ý tưởng để làm việc và thực hiện đề tàimột cách hiệu quả nhất

Hon thé nữa, sự thành công của dé tài không thể thiếu sự giúp sức của cácThây Cô trong Bộ mon Công nghệ sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa hoc, Truong Daihọc Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về trang thiết bị và giờ làm việcphù hợp nhất cho chúng em Đặc biệt, em xin gửi lời cám ơn chân thành đến cô chủnhiệm PGS TS Nguyễn Thuý Hương Qua những kiến thức cô truyền đạt, nhữnglời góp ý chân tình cùng tâm huyết của một người thay đã giúp em nói riêng, tập thélớp Cao học khoá 2013 nói chung trưởng thành hơn và có được thành công nhưngày hồm nay.

Trân trọng.TP Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2017

TÓM TATĐề tài khảo sát một số tính chat và hoạt động của protease trong quá trình tựphân của trùn quế Perionyx excavafus, thu được kết quả sau:

Tối ưu hóa băng phần mềm Design Expert 8.0.5.2, xác định protease từ trùnqué trong hoạt động tự phân với tỷ lệ dich trùn là 13%, thời gian tự phân là 6ngày cho hoạt tính cao nhất

Một số tính chất của protease trùn quế:Dung môi acetone là tác nhân thích hợp nhất để thu protease với tỷ lệ mẫu :dung môi (v/v) là 1:2, thời gian tủa là 90 phút, hoạt tính riêng tăng 2.5 lầnNhiệt độ tối ưu hoạt động của protease từ trùn quế là 55°C, pH tối ưu hoạtđộng của protease từ trùn quế là 6

Phân tích hệ protease bằng sắc ký lọc gel và điện di SDS-Page: Thu được 3loại protein và trong đó xác định có 2 loại protease dự đoán kích thước tươngứng là 35 KDa, 40 KDa.

Bước đầu ứng dụng dịch trùn bón cây trà: Lá trà thu hoạch có chỉ số tăngtrưởng về chiều dài lá, số lượng đọt ở mẫu lá trà bón dịch trùn tăng 12%,hàm lượng acid amin tăng (11%) Tổng acid amin của lá có bón dịch trùn caohơn không bón 12%, acid glutamic tăng 17%, EGCG tăng 20% so với đốichứng GABA tăng 9 lần so với lá trà không bón

ABSTRACTActivity and characteristic about protease from Perionyx excavatus decomposition:

Optimized by Design Expert 8.0.5.2 software, during self- autolysis, thehighest protease activity was 6 days, the dilution ratio is 13%,0.549 U/ ml.Some properties of earthworm protease:

Solvent acetone is the most suitable agent for obtaining protease with sampleratio: solvent (v / v) is 1:2, the precipitation time was 90 minutes, the activitywas 2.5 times

The optimum temperature protease was 55 ° C and the optimum pH was 6.Analysis of the protease system by gel and electrophoresis chromatography:three protein, obtained two enzymes with a molecular weight of 35 KDa,40 KDa.

Using liquid Perionyx excavatus as fertilizer tea: harvested tea leaves hadgrowth index of leaf length, number of sprouts in tea leaf application wormincreased 12%, amino acid increased (11%), EGCG 20% increase comparedto the control GABA increase 9 times.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Trương Thị Thùy Liên, học viên cao học chuyên ngành Công NghệSinh Học, khóa 2013, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Truong Dai học Bách Khoa Tp HỗChí Minh Tôi xin cam đoan:

Công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn khoa

học của TS Huynh Ngọc Oanh.

Các số liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố ởcác nghiên cứu khác hay trên bat kỳ phương tiện truyền thông nào

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong luận án tốtnghiệp của mình.

Học viên

Trương Thị Thùy Liên

MỤC LỤC0909.9090 .¡900 ,ôÔ iiVN Ôddddiaọ lil909.9090900 ivMUC LUC SG G0 re VvDANH MỤC BẢNG G11 11191 111 511101510113 111010111 1g ng viiDANH MỤC HINH ccccccscscecscecesessecscecececesvecscececsesevscaceceesevavacaceceevavavaceceesevavacees viii0004050000077 XLOI (965.1001107 |Phần 1: Tổng quan

B5 31 HH 21.2 Tổng quan VỀ DFOf©aS€ ¿2-2-5252 SE 3E 121521212111 71 21112111 3 xe 71.3 Các nghiên cứu về protease của trùn QUẾ ¿5c +cs+x+cszscsee 8LA, Phân DON oo eee eeecccceessssneceeceeesssneceeeceesssnneeeecessssseeeeeeessesaaeeeeeeeseenneeeees II1.5 GABA (Gamma Aminobutyric ACI) << sc S34 131.6 EGCG (Epigallocatechin—3 — gallate) 2 n9 1 re 14Phan 2: Nguyên vat liệu va phương pháp nghiên cứu

2.[ Nguyên lIỆU -G G0 nọ 152.2 Hóa chất ccc te the 152.3 Thiết bị Q12 TT 11111 TT T11 Hàng: l624 Phương pháp nghiên CỨU G1990 1 ng re 162.5 Nội dung nghiÊn CỨU - << 555001011111 199990300 vn ngờ 17Phần 3: Kết quá

3.1 Khảo sát quá trình tự phân của trùn qUẾ - + 55s s+s+szcszxe2 223.1.1 Khao sát đơn yếu t6 hoạt động protease trong quá trình tự phan 223.1.2 Tối ưu hóa điều kiện hoạt động protease trong quá trình tự phân 273.2 Khảo sát protease tir tritn QUẾ ¿5+ + E+x+E++E+EeEEErkererkrrrrerrrree 303.2.1 Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết protease 303.2.2 Tối ưu hóa quá trình tách chiết protease - 343.3 Phân tích chế phẩm protease ¿5-2 252252 SE‡E#E£EtEeErkrrrrererree 37

3.3.1 Phân tích bằng sắc ký lọc gel ¿- ¿2+5 S+cxvxcrxcrerererrereree 373.3.2 Điện di SIDS-Pag@ HH re 383.4 Khảo sát các yếu tố nhiệt độ pH đến protease trùn quế 393.5 Khảo sát dịch trùn tự phân - - - << 5 11100 1n ngư 423.6 Bước đầu ứng dụng dịch trùn tự phân làm phân bón 44Phan 4: Kết luận, kiến nghị

4.1 Kết luận G1 11191 1 1 51111101111 111010111 1H11 ng ưu 514.2 Kiến nghị 5-5-5221 1E 11111 1511511 1111111 1111111151511 11 1101111111111 re 52Tài liệu tham khiảo 5-52 S221 3 E1 321 151151321 E111511 0111111101111 y6 53PHU LUC 0 - 57

DANH MỤC BÁNGBảng 1.1 Thành phan acid amin trong trun ¿5-5 2 s+x+S£s+x+zezezeerered 4Bảng 2.1 Tóm tắt nội dung nghiên cứu ¿5-5 2 s22 £s+x+zezszesrersd 17Bảng 2.2 Nong độ của các chất ức chế bO sung vào ¿55-52 csccscecs¿ 20Bang 2.3 Quy trình bón tra - - - - - G5 1090000 re 21Bang 2.4 Cách thức thu hoạch tra «G000 ng ke 21Bang 3.1 Đánh giá màu, mùi của các chất ức chế Vi sinh vật - 22Bảng 3.2 Ma trận và kết quả qui hoạch thực nghiệm quá trình tự phân 28Bảng 3.3 Kết quả hoạt tính protease theo thực nghiệm và phương trình hồi quy.30Bảng 3.4 Hiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng protease khi kết tủa băng ethanol

¬— 31Bảng 3.5 Hiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng protease khi kết tủa bang

9409110022075 31Bang 3.6 Hiéu suat thu enzyme va hoat tinh riéng protease khi két tha bang

ACCLONE oo eeeeeseseeeeecceeceeeeeeeesssssseeeeeeeeeeceeeeeesssssaeaeeeeeeeeceeeeeeeeesaaaaeeeeeeeeeas 32Bang 3.7 Hiéu suat thu enzyme va hoat tinh riéng protease khi két tha bang

acetone (1:3) ở thời gian khác nhau - 11 eeeeeeee 34Bảng 3.8 Ma trận và kết quả qui hoạch thực nghiệm quá trình tách chiết protease

Bảng 3.9 Kết quả hoạt tính protease theo thực nghiệm và phương trình hồi quy 37Bảng 3.10 Kết quả tinh sạch enzyme qua các công đoạn kết tủa và lọc gel 38Bảng 3.11 Ham lượng protein và acid amin khi b6 sung PMSF va không PMSF 43Bang 3.12 Thanh phan acid amin của dich trùn c.cccccccsescscssessssesessssessesssesseseeeees 44Bang 3.13 Chi số tăng trưởng của lá trà thu hoạch trong 3 thực nghiém 45Bang 3.14 So sánh hàm lượng acid amin (% chất khô) giữa các mau lá trà bón lô

1-5 trong thực nghiệm | và 2,Ố - Ăn ng ke 46Bảng 3.15 Hàm lượng acid amin mẫu lá trà bón dich trùn qué và bón dịch trùn qué

kết hợp lân và kali ở thực nghiệm 2 sau 3 lần thu hoạch 47Bảng 3.16 Hàm lượng EGCG trong lá trà bón dịch trùn quế ở thực nghiệm 2 48Bảng 3.17 Thành phan acid amin lá trà bón dich trùn qué ở thực nghiệm 2 49Bảng 3.18 Thành phần GABA trong lá trà bón dịch trùn quế ở thực nghiệm 2 50

DANH MỤC HÌNHHình 1.1.

Hình 1.2.Hình 1.3.Hình 14.Hình 1.5.Hình 1.6.Hình 2.1.Hình 2.2.Hình 2.3.Hình 3.1.Hình 3.2.Hình 3.3.Hình 34.Hình 3.5.Hình 3.6.Hình 3.7.Hình 3.8.

Hình 3.9.Hình 3.10.

Hình 3.11.Hình 3.12.

Đồi chè tại Bảo LUỘC SG S112 E111 9121 1E E111 1211 ng ree 12Trin qué từ trai chăn nuôi An Phú ở Củ Chi - 555552 15Trà xanh TB14 tại Lâm Đồng o.cececesecccsessesssesseseseesesessessseseseseeessseesesen 15Các loại phan bón trong thực nghiệm << «55s s2 15Các mẫu dich trùn có chất ức chế vi sinh vật 2s scss+x+ec«¿ 23Ảnh hưởng của chế độ lắc và hàm lượng trùn lên quá trình tự phan 24

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình tự phân - - 25

Ảnh hưởng thời gian tự phân lên hoạt tinh protease - 26

Ảnh hưởng thời gian tự phân lên hàm lượng protein - 26

Ảnh hưởng thời gian tự phân lên hàm lượng acid amin 27

Đường cong biéu thị mối tương quan giữa thời gian- hàm lượng trùn 28Mô hình đáp ứng bề mặt biểu diễn mối quan hệ thời gian-hàm lượngHiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng khi tác nhân tủa là ethanol 31

Hiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng khi tác nhân tủa là isopropanolHiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng khi tác nhân tủa là acetone 33

Hiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng khi tủa với acetone (1:3) ở thờigian khác nha - - << + E101 000 re 34Đường cong biểu thi mối tương quan giữa thời gian- ty lệ dịch trùn-6000150002727 35

Mô hình đáp ứng bề mặt biểu diễn mối quan hệ thời gian-ty lệ dịch 6000150002727 36Sắc ký dé lọc gel của chế phẩm protease -. 55-52 5+ cscs+2 37

trùn-Hình 3.16.Hình 3.17.Hình 3.18.Hình 3.19.Hình 3.20.Hình 3.21.Hình 3.22.

Hình 3.23.

Điện di đồ SDS-Page 5+5 tt 21 1111212121121 01 111111 1x1 tre 38Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính Di) 39Khảo sát nhiệt độ đến độ bền D9: 40Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease 2-5 5+ s55: 4]Khao sát pH đến độ bền protease c.ccccccscscssssessesssessesssessesssessessseesesen 42Khảo sát các chất ức chế đến hoạt tính protease 43So sánh hàm lượng acid amin (% chất khô) giữa các mẫu lá trà bón lô 1-5 trong thực nghiệm 1 ¿2 ,3 << G5 S000 ng ke 46So sánh hàm lượng acid amin (% chất khô) giữa các mau lá trà bón bóndịch trùn qué và bón dịch trùn qué kết hợp lân va kali trong thực nghiệm2 sau 3 lần thu hoạch ¿- - s1 EESEEESESEEEESESEEESESkEskrkseseree 48

TỪ VIET TAT

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acidPMSF: Phenylmethylsulfonyl fluorideSBTI: Soybean trypsine inhibitorTLCK: N-Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone hydrochlorideTPCK: N-Tosyl-L- phenylalanyl chloromethyl ketone hydrochloride

Trong nông nghiệp, trùn quế được xem là thức ăn giàu đạm cung cấp cho vậtnuôi Trùn làm tăng độ phì nhiêu của đất Phân trùn góp phân làm giảm mức sửdụng phân hoá học, giúp cây trồng phát triển tốt, tăng khả năng chống sâu bệnh,giảm bớt việc sử dụng thuốc trừ sâu, nhờ đó bảo vệ môi trường.

Các nguồn cung cấp trùn tươi và sản phẩm từ trùn là những cơ sở nhỏ, chỉphí đầu tư thấp nên sản phẩm của cơ sở này thường không 6n định Hiện nay, cácsản phẩm từ trùn qué được thủy phân bang tác nhân hóa học, không an toàn cho môitrường và cây trông.

Từ đó chúng tôi nghiên cứu khả năng tự phân đặc biệt của trùn quế, bằngcách đánh giá hoạt động của hệ protease tự phân và tiễn hành nghiên cứu “ Khảo sáthoạt động và tính chất của protease trong quá trình tự phân của trùn qué (Perionyxexcavatus) ”

Nội dung nghiên cứu gồm:- Khao sát hoạt động của protease trong quá trình tự phân trùn qué- Khao sát điều kiện thu nhận protease

- Khảo sát một số tinh chat của protease- Ung dụng dich trùn tự phân bón cây trà

Phân 1:

TÔNG QUAN

1.1 Trùn quếTrùn quế có hàm lượng đạm cao, sống và ân nau dưới các thảm thực vật dày,dưới viên gạch, hòn đá, các miếng gỗ hoặc ngay dưới lớp phân, rãnh nướccạnh chuông gia súc, gia cầm.

Phân loại:¢ Ngành: Annelides¢ Phân ngành: Clitellata¢ Lớp: Olygochaeta¢ Ho: Megascocidae¢ Chi: Pheretima¢ Loài: Perionyx excavatusTrin qué là một trong những giống trun đã được thuần hóa, nhập nội va đưa

vào nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ, dễ sinh sản, dễ thu hoạch

Ruột

Thực quản

Tuyến sinh Ruột

Tuyến sinh dục dục (cái)

(đực)

TimMạch máu

Miệng

Mạch máu

bụng

Chuỗi thầnkinh

Hình 1.1: Trin qué [32]1.1.1 Đặc tinh sinh hocTrin quế có kích thước tương đối nhỏ, thân hoi det, bề ngang của con trưởngthành có thé đạt 0,1 — 0/2 em, có màu từ đỏ đến mau mận chín (tùy theotuổi), màu nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn Cơ thể trùn có hình thonđài nỗi với nhau bởi nhiêu đốt, trên mỗi dot có một vành tơ [26].

Trin quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hap thu oxy và thải CO, trongmôi trường nước.

Kích thước trùn qué trưởng thành từ 10 — 15 cm [26]

1.1.2 Đặc tính sinh lý

Trin qué rất nhạy cảm, chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và biênđộ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn Nhiệt độ thích hợp nhất với trùnqué nam trong khoảng từ 20 — 30°C, chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh.Trin qué rất thích sống trong môi trường 4m ướt và có độ pH ồn định, thíchhợp nhất vào khoảng 7.0 — 7.5

Trin qué có phố thức ăn khá rộng, chúng ăn bat kỳ chất thải hữu cơ nào cóthé phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm )

[26].1.1.3 Sw sinh san va phát triểnTrùn qué sinh san rat nhanh trong diéu kiện khí hậu nhiệt đới tương đối ôn

định và có độ âm cao như điều kiện của khu vực phía Nam Từ một cặp banđầu trong điều kiện sống thích hợp có thể tạo ra từ 1.000 —1.500 cá thể trongmột năm.

Trin qué là sinh vật lưỡng tính, chúng có dai và các 16 sinh duc năm ở phíađầu của cơ thé, có thé giao phối chéo với nhau dé hình thành kén ở mỗi con,

kén được hình thành ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang từ | — 20 trứng, mỗi

kén có thể nở từ 2 — 10 con [26].Khi mới nở trùn con như đầu kim có màu trang, dài khoảng 2 — 3mm, sau 5 —

7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyên dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện mộtvan đỏ thẫm trên lưng Khoảng từ 15 —30 ngày sau, chúng trưởng thành vabắt đầu xuất hiện đai sinh dục và chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinhsản [26,27].

1.1.4 Thành phần dinh dưỡng của trùn quéChất khô trong trùn phơi khô chiếm 93,7%, protein thô chiếm 59%, chất béo7,3% ( Theo phân tích tại Trung tâm dịch vụ và Thí nghiệm của Sở Khoa HọcCông Nghệ TP Hồ Chí Minh.) [37].

Trùn tươi tỷ lệ nước chiếm chủ yếu là 80%, protein thô chiếm 12 % và chấtbéo chiếm 1,3%

Bảng 1.1: Thành phần acid amin trong trùn [37]STT Acid amin % (hàm lượng chất khô)

l Glycin 1.525

2 Histidin 3.153

3 Leucin 4.6234 Lysin 2.0865 Arginin 6.4856 Alanin 1.679

7 Methionin 1.133

8 [soleucin 4.8759 Phenylalanin 1.60110 Prolin 1.590

II Cystein 1.88012 Aspartic 3.900

13 Glutamic acid 7.57214 Serin 2.485

15 Valin 5.161

16 Threonin 1.545

‘Hinh 1.3 Chuông nuôi trùn qué [39]Trin qué tại trang trại An Phú tại Củ Chi có các sản phẩm dịch trùn qué ởdạng lỏng b6 sung các acid amin cho tôm, cá Ngoài ra công ty còn sản xuất dichtrùn cho gà có một mùi vi rất đặc trưng kích thích sự thèm ăn, giúp gà ăn nhiều,tăng trọng nhanh, tăng sức đề kháng

Tại Võng La, Đông Anh, trùn qué được nuôi theo hộ gia đình để làm thức ăntươi và thu hoạch phân trùn bón cây.

Tại Cần Thơ, trùn được nuôi theo mô hình kinh tế sinh thái, có khả năng đápứng 300 - 500kg trùn qué giống sinh khối, tận dụng nguồn nhân công dồi dào, xử lý

toàn bộ chất thải trong chăn nuôi, sản xuất phân bón vi sinh sạch và nhất là tận dụngđược nguyên liệu sẵn có là phân của động vật ăn cỏ ở địa phương [21]

Sự hợp tác công ty ANFA và nông dân, người nuôi sẽ được tư van thiết kếmô hình chuông trại, cung cấp con giống, chuyển giao công nghệ nuôi, hỗ trợ vốntheo quy mô từng dự án và đặc biệt là thỏa ước mua lại sản phẩm với giá sàn bảohộ Người nuôi phải hội đủ các điều kiện về vốn để mua trùn giống, làm chuôngtrại, nhân công, nguyên liệu nuôi và có nhân lực biết ứng dụng công nghệ chuyểngiao [21].

Phòng thí nghiệm sinh học của trường Đại học Tây Đô (Cần Thơ) nghiêncứu thử nghiệm sử dụng dịch trùn quế trong nuôi ấu trùng tôm càng xanh năm2010, góp phan phát triển bền vững nghé nuôi tôm ở vùng đồng bằng sông Cửu

Long Hiện nay các tỉnh phía Nam và đồng bằng sông Cửu Long tiến hành nuôitrên quy mô lớn để cung cấp sinh khối trùn cho chăn nuôi và dịch trùn để bón cây.Ngoài ra các tỉnh miền Tây sử dụng nguồn thức ăn trực tiếp từ trùn tươi cho tôm ởgiai đoạn ấu trùng, tăng sản lượng chăn nuôi.

Theo W.T.Mason (Dai hoc Phlorida — Mỹ): trùn tươi, là thức ăn lý tưởng dénuồi thủy sản, cho sản xuất con giống ba ba, rùa, lươn, tom, cá Chỉnh, đặc biệt lànuôi cá Tầm - một loại cá quý để ăn và sản xuất món trứng cá muối rất đắt tiền.Nếu cho chúng ăn trùn tươi hàng ngày bằng 10 % - 15 % trọng lượng cơ thể sẽ tốthơn bất cứ loại thức ăn nào khác, tốc độ sinh trưởng sẽ tăng 15 % đến 40 %, năngsuất trứng tăng trên 10 % [27]

Ở Úc, nghiên cứu sử dụng đạm từ trùn thay thế thịt cá để nuôi tôm hùm nhỏ,kết quả không làm giảm sự tăng trưởng của tôm Còn ở Nigeria đã nghiên cứu sửdụng 25% protein trùn thay thế vào thức ăn nuôi cá hồi nhỏ Ngày nay, nhiềunghiên cứu về thức ăn cho trùn như bố sung protein, acid béo nhằm thu được hiệusuất sinh khối và phân trùn có hàm lượng dinh dưỡng cao là một trong nhữngnghiên cứu trong dự án lớn của Chính phủ Úc [22]

Phân trùn dễ hòa tan trong nước, chứa hơn 50 % chất mùn; kích thích tăngtrưởng cây trồng, ma còn tăng khả năng cải tạo đất Phân trùn còn chứa các khoángchất được cây trồng hấp thụ một cách trực tiếp, không như những loại phân hữucơ khác phải được phân hủy trong đất trước khi cây hấp thụ

Hiện tại phân trùn quế thường được sử dụng cho mục đích như: kích thích sựnay mam và phát triển của cây trông, điều hòa dinh dưỡng và cải tao đất, làmcho đất luôn màu mỡ và tơi xốp; dùng làm phân bón lót cho cây và rau quả, tạo rasản phẩm có chất lượng và năng suất cao Vì vậy, phân trùn là loại phân sạch thiênnhiên quí giá để bón cho hoa, cây cảnh, rau quả trong nông nghiệp sạch, được thịtrường rất ưa chuộng [27]

1.2 Tổng quan về protease1.2.1 Giới thiệu chung

Enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân có khả năng cắt mối liên kếtpeptide (-CO~NH-) trong các phan tu polypeptide, protein thành các acid amin tựdo hoặc các peptide phân tử thấp Quá trình tự phân của trùn qué thực chat là quátrình thủy phân protein trùn qué dưới tác động của hệ enzyme protease nội sinh

Protease là nhóm enzyme ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhaunhư công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da,công nghiệp sản xuất xà phòng Nguồn thu nhận protease vô cùng phong phú nhưthực vật, động vat và vi sinh vật [8].

1.2.2 Phân loại protease

Có một số cách phân loại như sau:1.2.2.1 Protease được phân thành hai loại theo vị trí cắt:- Endopeptidase và exopeptidase

Theo vị tri tac động trên mach polypeptide, exopeptidase chia thành hai loại:- Aminopeptidase

- CarcboxypeptidaseTheo động hoc cua cơ chế xúc tác, endopeptidase chia thành bốn loại:(a) Serin protease: chữa nhóm —OH của sốc serin trung tâm hoạt động Là nhóm

peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật .(b) Cysteine protease: chứa nhóm —SH trung tâm hoạt động Nhóm này bao gồm

các protease từ thực vật; một vài enzyme từ động vật và ký sinh trùng Cácenzyme nảy thường hoạt động ở pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.(c) Metallo protease: được tim thay ở vi khuẩn, nắm mốc, thường hoạt động ở

pH trung tính và hoạt động giảm mạnh khi có sự hiện diện của EDTA, có ionkim loại ở tâm hoạt động.

(d) Aspartic protease: thuộc nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa nhưpepsin, chymotrypsin, renin [2].

1.2.2.2 Protease được phân loại theo pH hoạt động- Protease acid tính: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nam men, ít ở vi

khuẩn

- Protease trung tính: pH 7-8 có ở tế bào động vật và thực vật, vi khuẩn.- Protease kiềm tính: pH 9-11 [3].

1.2.2.3 Protease phân thành hai loại theo vị trí hiện diện: protease noibào, ngoại bào

- Protease nội bào là những enzyme nam trong tế bào, muốn thu nhận phải phávỡ tễ bào

- Protease ngoại bao được tổng hợp bên trong tế bào và được tiết ra ngoài, dễdàng thu nhận [3].

1.2.3 Các yếu tổ ánh hư ng én enzymeAnh hưởng của pH

Phan ứng xúc tác phụ thuộc vào điện tích phân b6 của enzyme lên cơ chất,có thể là trung tâm hoạt động của phân tử enzyme Mỗi enzyme chỉ hoạt động ởnhững môi trường có pH xác định, gọi là pH tối ưu pH tối ưu cho hoạt động củanhiều enzyme vào khoảng 7 pH quá cao hay quá thấp có thé làm enzyme bị biếntính [14].

Anh hưởng cua nhiệt độNhiệt độ tối ưu enzyme khoảng 40 - 50°C Nhiệt độ trên 70°C thì các phân tửenzyme bị mất hoạt tính Nhiệt độ tối ưu của mỗi enzyme không cố định mà thayđổi theo thời gian thủy phân, nồng độ enzyme, cơ chat phản ứng [14]

Anh hưởng của nông độ enzyme và cơ chấtTrong trường hợp cơ chất đầy đủ, nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độphản ứng Nếu tăng nồng độ enzyme cao quá sẽ không có hiệu quả kinh tế, ngượclại néu cơ chất quá nhiều sẽ ảnh hưởng đến tốc độ phan ứng enzyme Vì vậy cannghiên cứu nông độ enzyme phù hợp với lượng cơ chất nhất định Trong quá trìnhtự phân, sản phẩm sinh ra cũng có thể ức chế hoạt động của enzyme, làm cho phảnứng xảy ra chậm và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm [14]

1.3 Một số nghiên cứu về protease của trùn quếProtease của trùn qué đa số thuộc nhóm serine protease, là những protease cónhóm hydroxyl (—-OH) của serin trong trung tâm hoạt động Nhóm -OH cua serinetác động lên nhóm —CO của liên kết peptide tạo hop chất trung gian acyl-enzyme.Các enzyme thuộc nhóm này thông dụng nhất là trypsin và chymotrypsin

Trong các nhóm protease ứng dụng rộng rãi nhiều nhất là nhóm serineprotease do chúng có khả năng thích ứng khoảng pH khá rộng từ trung tính đếnkiềm đã làm tăng khả năng ứng dụng nhóm enzyme này so với các nhóm proteasekhác.

Phan Thị Bích Tram và cộng sự tiễn hành dé tài “ Tinh sạch và khảo sát cácđặc tính của serin protease từ Trùn Quế (2007)” và bước đầu tinh sạch sơ bộ băngtủa phan đoạn với ammonium sulfat nồng độ 30-80% [19]

Theo nghiên cứu tai đại hoc Hué (2012) vé tao dong va phân tích trình tự

serin protease của trun qué, đoạn cDNA có kích thước 726 bp được tao dong với

vector pCR®2.1 Trinh tự nucleotide của cDNA được so sánh với trình tự của genlumbrokinase của các loài giun đất Eisenia fetida, Lumbricus bimastus vaLumbricus rubellus có độ tương đồng lần lượt là 52,02%; 50,06% và 48,03% [4]

Qua nghiên cứu trên9loài trùn,Nguyễn Thi Ngọc Dao chú ý đếnloài Peryonix escavatus - tên khoa học của trùn qué, chứa protease hoạt độ cao hơncác loài khác Protease trong trùn quế có khả năng thủy phân mạnh mẽ, làm đứtcác sợi fibrin - một loại protein trong mau vốn có tác dung làm đông mau, giúp liềnvết thương, nhưng đông thời nó cũng là nguyên nhân gây nên xơ vữa thành mạchcủa bệnh nhân tim mạch hoặc mỡ mau, gây tắc mạch máu [4]

Hiện nay protease dùng trong điều trị bệnh tim mạch, rất đa dạng và cónguồn sốc khác nhau: từ động vật, thực vật và vi sinh vật, thường thuộc nhóm serineprotease có kha năng thủy phân fibrin, fibrinogen.

Lumbrokinase làm từ trùn đất sẽ giúp ngăn ngừa tai biến mạch máu não, xơvữa động mạch và mỡ máu ở người cao tuổi Thành phân protein trong chiết suất

của giun, có tác dụng giãn nở khí quan, trị bệnh hen xuyén ]17]

Trong các tác dụng chữa bệnh của giun thì tác dụng cấp cứu những trườnghợp đột quy do tai biến mạch máu não là được quan tâm nhiều nhất Từnăm 1911 cdc nhà khoa học Nhật Bản đã tìm thấy trong trùn đất có hoạt

chất Lumbritin có tác dụng phá huyết ứ, làm tan nhanh các cục máu đông gây nghẽn

mạch không có tác dụng phụ về xuất huyết, dễ sử dụng, giá rẻ [29.30]

Science: Ba

Nutrition(nee

Suppenst

Best

f Eenbrokinesa: 20mg /60 Capsules

xOkdraxsc Lins Pet SOV

Hình 1.4 Các loại thuốc Lumbrokinase trên thi trường

Nguyễn Thị Ngọc Dao cùng các cộng sự thuộc Viện Công nghệ Sinh học

(Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã bước đầu nghiên cứu và sản xuất thànhcông chế phẩm viên nang Lumbrokinase từ trùn đất, có tác dụng làm tan cục máuđông làm nghẽn động mạch, những vết thương bị tụ máu Việc điều trị cho các bệnhnhân bị tai biến mach mãu não do viêm tac và xơ vữa động mạch đã cho kết quatốt

Ứng dụng trong nông nghiệp

Protease trùn qué bố sung trực tiếp vào thứcăn cho vật nuôi nhăm tăng kha năng tiêu hóa, xửlý sơ bộ thức ăn trước khi sử dụng.

Hiện nay, các chế phẩm vi sinh chứa hỗnhợp protease trùn và các enzyme thủy phân khác,được sử dụng cho ngành nuôi trồng thủy sản làmtăng hệ sô tiêu hóa, làm giảm thiêu ô nhiêm môitrường nước nuôi.

Hình 1.5 Promin b6 sung trực tiếp vào thức ăn cho heo, gà [38]Nghiên cứu mới nhât về trùn quê vào đâu năm 2016, “ Nghiên cứu b6 sungprotease từ Bacillus subtilis vào quá trình tự phân của trùn qué dé nâng cao hiệu quathu nhận đạm hòa tan” của trường đại học Thủ Dầu Một giúp tăng cường lượngđạm, acid amin cung cấp cho chăn nuôi, thủy sản, tạo chế phẩm dịch trùn có chấtlượng cao, giảm thời gian tự phân, dịch trùn thu được không có mùi hôi [6].

Từ các ứng dụng của hệ protease trùn quế ở trên cho thấy việc nghiên cứuứng dụng hệ protease vào lĩnh vực nông nghiệp, tạo chế phẩm trùn một cách chủđộng làm tăng giá trị thương phẩm khi đưa vào sản xuất.

1.4 Phan bónĐịnh nghĩa: Phan bón là thức ăn của cây trồng, thiếu phân cây không thésinh trưởng và cho năng suất, phẩm chất cao Phân bón có vai trò rất quan trọngtrong việc thâm canh tăng năng suất, bảo vệ cây trồng và nâng cao độ phì nhiêu củađất [20]

Phân bón hóa hoc (phan võ co)Loại phân này chứa các yếu tô dinh dưỡng dưới dạng muối khoáng giúp câykhỏe và tăng năng suất Các loại phân bón hóa học phô biến là phân đạm, phân lân,phân kali, phân NPK, phân SA Phân bón hữu cơ cũng cung cấp cho cây cáckhoáng chất tương tự tuy nhiên phân bón hóa học có tính đậm đặc hơn nên có tácdụng rõ rệt và nhanh chóng hơn [20].

Phân bón hữu cơPhân xanh là nguồn dinh dưỡng tự nhiên nhất mà chúng ta có thể cung cấpcho cây Do được làm từ xác cây cỏ chết, rơm rạ phân xanh chứa những loại chấtcơ bản nhất cho cây với liều lượng vừa đủ

Phân bón hữu cơ truyền thống còn có phân chuông (phân, nước tiểu của vậtnuôi), chiết xuất từ rong biển, phế phẩm trong nông nghiệp Bên cạnh đó còn cócác loại phân hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh, phân hữu cơ khoáng đượcsản xuất thông qua quy trình công nghiệp

Trùn còn chứa các khoáng chất được cây trồng hấp thụ một cách trực tiếp,không như những loại phân hữu cơ khác phải được phân hủy trong đất trước khi câyhấp thụ, dễ hòa tan trong nước [20]

Hàm lượng N-P-K, Ca và các chất khoáng vi lượng trong trùn, cao hơn sovới các loại phân động vật khác đồng thời phân trùn không có mùi hôi thối như cácloại phân gia súc, gia cầm, lại có thể lưu giữ lâu ngày trong túi nilon mà không bị

mốc, rất thuận lợi cho việc bảo quản và vận chuyền

Dịch trùn có thé kích thích sự nảy mam, phát triển cây trồng, ngăn ngừa cácbệnh vê rê, giúp chông sự xói mòn và tăng khả năng giữ nước trong dat Cây trong

II

khi bón phân giun sẽ khống chế được các kim loại nặng xâm nhập cây gây đột biếnlàm phát sinh tế bào lạ có hại, gây hoại tử rễ Chất mùn trong dịch trùn loại trừđược những độc tô, nam và vi khuẩn có hại trong đất, có thể ngăn ngừa các bệnh vềrễ và đây lùi nhiều bệnh của cây trồng [20].

e Giống chè thực hiện — Trà xanh TB14

PTNT đã nhóm họp tại Đà Lạt để đánh giá và công nhận đặc cách giống chè TB14do Phạm S - Phó Chủ tịch UBND tỉnh, nguyên Phó Giám đốc Sở NN-PTNT chủ trìcùng với cộng sự là tập thé cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao kỹ thuậtcây công nghiệp - cây ăn quả Lâm Đồng (Sở NN-PTNT) nghiên cứu, chọn tao vàkhảo nghiệm trong thời gian 20 năm qua tại các địa bàn trọng điểm canh tác chè củatỉnh Lâm Đồng và khu vực Tây Nguyên [36]

TB14 là một trong ít giống chè có thé dùng làm nguyên liệu sản xuất chèđen, chè xanh và chè hương thương phẩm - trong đó chè đen là một loại nông sảnhiện có thị trường tiêu thụ lớn trên thế giới Tiến sỹ Phạm S cho biết, sau thời gianchọn tạo và nhân rộng, trên địa bàn tỉnh trong diện tích 23.529 ha chè đang canh tácchủ yếu tại Bảo Lộc, Bao Lâm, Di Linh va Lâm Hà (ngành chè của Lâm Đồng hiệnchiếm khoảng 17% về diện tích và 22% về sản lượng chè búp tươi - đứng đầu cảnước) [10,36].

Giống chè TB 14 đã cho năng suất bình quân khoảng 18- 20 tan/ha/naim, có

hàm lượng chất đạm và chất hòa tan cao, hàm lượng cafein thấp, hàm lượng tamin ở

mức trung bình, khả năng nhân giống bằng biện pháp giâm cành có tỷ lệ sống96,2%, khả năng chống chịu sâu bệnh khá, có thể thu hoạch búp dễ dàng bằng máy,doanh thu hàng năm đạt trên 140 triệu đồng/ha

Giống chè nay đã được Hội đồng KH-CN cấp quốc gia của Bộ NN-PTNTcông nhận đặc cách và đặt tên là giống chè TB14 dé đưa vào “Danh mục giống câytrồng được phép sản xuất kinh doanh tại Việt Nam” Lê Văn Đức, Ủy viên Hộiđồng còn cho biết thêm là hiện đang có nhiều doanh nghiệp chế biến chè trên thếgiới tới Việt Nam đặt hàng mua chè búp tươi giống TB14 với khối lượng “khônghạn chế” để chế biến chè đen cao cấp, và đây là thông tin vui đối với vùng chènguyên liệu tỉnh Lâm Dong [36]

1.5 GABA (Gamma Aminobutyric Acid)Được san sinh ra từ các acid amin — acid glutamic trong não bộ GABA cónhiêu trong ca chua chin, thịt lon, gạo luc, lúa mi, ngũ côc còn nguyên hat, trứnggà tươi ( lòng đỏ), cá ngừ, cá hồi, tôm hùm, mực [33]

Vai tro cua GABA:

- GABA có tac dụng không thé thiếu đối với co thé dé đảm bao duy tri sựhoạt động bình thường của não bộ đặc biệt là các neuron thần kinh

- Duy trì hoạt động của não có vai trò chính trong việc ức chê sự lan truyéncủa các tê bao dân truyền, giảm hoạt động của các tê bao thân kinh căng thăng đềntrung khu thần kinh

Cân băng huyết áp, giảm cholesterol

Giảm stress, căng thăng

Tăng cường chức năng than, an thân, giảm stress và chứng mat ngủ.

Đau mãn tính [33]

13

1.6 EGCG (Epigallocatechin—3 — gallate)

Là một trong bốn loại polyphenol được tim thấy nhiều trong trà xanh, baogồm epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epicatechin —3 — gallate (ECG) vàepigallocatechin—3 — gallate (EGCG).

EGCG là este của epigallocatechin va axit gallic, là hoạt chat chống ôxy hóacó nhiều trong trà xanh nhưng không có trong trà đen vì khi lên men EGCG chuyểnthành thearubigin [40].

Chire nang:— Chất chống oxi hóa, khử các gốc tự do, kháng viêm kháng khuẩn, chống

di ứng và chống lão hóa cho con người— Ngăn ngừa bệnh ung thư

— Ngăn ngừa nguy cơ bệnh tiểu đường— Giúp xương chắc khỏe, giảm các chứng viêm khớp— Giảm thiểu tăng huyết áp

— Giúp cải thiện trí nhớ và bệnh Alzheimer [40].

Phân 2:

NGUYEN VAT LIEU

PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.1.Neu én liệu

2.2.

Hình 2.2 Trà xanh TB14 tại Lam Đồng

Dat Mỹrên Air cRoes if KALI PHO Mỹ

Hình 2.3 Cac loại phan bón trong thực nghiệm

- Na;HPOx.L2HO, KH2PO,- Casein, TCA, citrat acid- NaOH, HCl

- Acetone, ethanol, isopropanol- Gel Biorad, acrylamide SDS, APS.2.3 Thiết bi

- May đo quang phố UV — Vis (CT — 2200)- May khuấy tir (Stuart SB 162 — 3)

- May ly tam (Rotofix 32A)- May do pH (Hanna HI 8424)- _ Hệ thống sắc ký cột hãng Biorad- May HPLC:

Dau dd DADCột pha dao ZORBAX Eclipse XDB-C18 (150 x 4,6 mm; 5 wm)2.4 Phương pháp nghiền cứu

a) Xác inh 6am [5]b) Xác inh ham lượng protein bang phương pháp Biuret [5]

(phụ lục 2.a)c) Xác inh hoạt tính protease bằng phương pháp Anson [25]

(phụ lục 3.a)

Hoạt tính protease (chế phẩm)

*100%

Hiệu suất thu enzyme (%) = i

Hoat tinh protease (ban dau)

Hoat tinh protease (U/ml)

Hoat tinh riéng (U/mg protein)= Ham lượng protein (mg/ml)

d) Xác inh hàm lượng acid amin bằng phương pháp Ninh drin [5](phu luc 4.a)

e) Xác inh thành phan acid amin bằng phương pháp CASE.SKNơi thực hiện: Trung tâm dich vu phân tích thi nghiệm TP.HCM

16

f Xác inh hàm lượng EGCG bang phương pháp HPLC(phụ lục 4.a)

Nơi thực hiện: Phòng thí nghiệm Trọng điểm Khoa Kỹ thuật Hoá học

ø) Phương pháp lọc gelCột lọc gel đường kính 2cm, chiều cao 25cm (Bio Rad, Mỹ)

Gel sử dụng: Bio Gel P-30

h) Phương pháp lên diThực hiện băng hệ thống điện di OSP-300

i) Thực hiện tối ưu hóa bang phần mềm Design Expert 8.0.5.2j) Xử lý số liệu bang phần mềm Excel, SPSS 16.0 ( xem phụ lục B)

2.5 Nội dung nghiên cứu

Bảng 2.1 Tóm tắt nội dung nghiên cứuSTT Nội dung nghiên cứu Các yếu tố khảo sátTNI | Khảo sát các điêu kiện ảnh hưởng |- Chat ức chế vi sinh vật gây thôi

đến hoạt động của protease trong Đơn yếu tốquá trình tự phân Tối ưu hóaTN2 | Khảo sát các điêu kiện tách chiết |- Đơn yêu tô

protease Tối ưu hóa

TN3 | Phân tích protease trùn qué Loc gel

Điện di SDS-PageTN4 Khao sát tính chat protease trùn

qué

Nhiệt độ tôi ưuĐộ bên nhiệtpH tối ưuĐộ bên pHChat ức chế hoạt động proteaseTNS Ung dung dich trùn làm phân bón

trà

Thời gian bảo quản dịch trùn tự phânMức độ tăng trưởng của lá trà

Acid aminEGCGGABA

Thí nghiệm 1: Khao sát các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt động của protease trongquá trình tự phân:

Đánh giá kết quả: Hoạt tính protease (U/ml) (phụ lục 3.a), (tất cả các mẫuthí nghiệm đều đưa về thể tích đồng nhất dé so sánh)

+ Khảo sát các chất ức chế vi sinh vật gây thối:

Đề thực hiện quá trình tự phân kéo dài không bị ảnh hưởng đến hệ vi sinhvật trong trùn; chúng tôi khảo sát các chất ức chế vi sinh vật tránh hiện tượng thốirữa như:

- NaN; (0,02%), HCI IN(2%), acid lactic (2%), Kali sorbate (2%).+ Khảo sát don yếu tô anh hưởng đến hoạt động cua protease

- Trùn quế được xay min, xác định hàm lượng chất khô.Dịch trùn tự phân băng nước cất (hàm lượng trùn từ 7% - 15%), 24 giờ

Khao sát nhiệt độ tự phân (từ 30°C — 55°C)

Khao sát thời gian tự phan (từ ngày I- 12).+ Khảo sát toi wu hóa các yếu tô ảnh hưởng đến hoạt động của protease( xem phụ lục 2b)

Hai yếu tố: ham lượng trùn và thời gian tự phân được chọn để thực hiện quihoạch thực nghiệm.

Ta chọn các thông số làm điểm tâm, áp dụng phần mém tối ưu hoá DesignExpert 8.0.5.2.

Hai yếu tổ không thay đổi trong quá trình khảo sát là:

+ Nhiệt độ tự phân theo khảo sát đơn yếu tố.+ Tốc độ lắc 60 vòng/phút

Thí nghiệm 2: Khảo sát các điều kiện tách chiết proteaseThông số đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml) và hoạt tính riêng (U/mg).+ Khảo sát đơn yếu tổ ảnh hưởng đến quá trình tách chiết của protease

- Khao sat dung mồi: acetone, ethanol, isopropanol.- Khao sát ty lệ giữa dịch trùn và dung môi (1:1 — 1:5)- Khao sát thời gian thu tủa (từ 30-150 phút)

+ Khảo sát toi wu hóa các yếu tô ảnh hưởng đến quá trình tách chiết cua protease( xem phụ lục 3b)

18

- Hai yếu tố ty lệ dich trun và aceton, thời gian được chon để thực hiện quihoạch thực nghiệm.

- Áp dụng phần mềm tối ưu hoá Design Expert 8.0.5.2- Hai yếu tố không thay đổi trong quá trình khảo sát là:

+ Điện di SDS-PageThí nghiệm 4: Khao sát tính chat protease tran quéThông số đánh giá là hoạt tính tương đối (%): hoạt tính protease so với hoạt tínhprotease cao nhất trong dãy thông số khảo sát

+ ác định nhiệt độ toi wuKhao sát ở các nhiệt độ 37, 45, 50, 60, 80°C trong 10 phút.

+ ác định độ bên nhiệtEnzyme được ủ ở các nhiệt độ như 37, 45, 50, 60, 80°C trong 3 giờ, sau đó ôn địnhở nhiệt độ phòng trong 30 phút.

+ ác định pH toi ưuKhảo sát ở pH từ 2 đến 12 với các dung dịch đệm glycine —HCI (2-4), phosphate(6-8), Tris-HCI (9-10), glycine-NaOH(10-1 1), KCI-NaOH(12-13) trong 30 phút ởnhiệt độ tối ưu đã chọn ở thí nghiệm 4

+ ác định độ bên pHEnzyme được ủ ở pH từ 2 đến 12 trên trong 16 giờ ở 4°C, sau đó đưa về pH tối ưu

ác định chất ức chế proteaseKhảo sát các chất ức chế là PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride), EDTA,TLCK (N-Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone hydrochloride), TPCK (N—Tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone hydrochloride), SBTI (Soybean trypsine

inhibitor) Xác định chat ức chế bằng cách ủ chất ức chế với protease, ở 25°C trong15 phút, sau đó xác định hoạt tính protease còn lại.

Bảng 2.2 Nông độ của các chât ức chê bô sung vào

Chất ức chế Nong 6PMSF 0.1 mMEDTA 1 mMTLCK 0.1 mMTPCK 0.1 mMSBTI 10 mg/mlThí nghiệm 5: Ung dung dich tran lam phân bón trà

— Khảo sát thời gian bảo quản dịch trùn tự phân.— Sau khi khảo sát hoạt động protease tối ưu và các chất ức chế vi sinh vật cho

quá trình tự phân trùn, chúng tôi thu nhận dịch trùn tự phân và bước đầudùng bón cho cây trà.

Địa diém: vườn trà của ông Tran Văn Tuân, sô 59 Chau Văn Liêm, Bảo Lâm Đồng

Lộc-Trà trong nghiên cứu này là trà đã được 7 năm tuổi, trước khi thu hoạch látrà cần b6 sung dinh dưỡng cho cây dé thúc cây ra lá

Nước tưới trên mỗi cây, 10 lít nước/1 cây/ 2 ngày.Hình thức bón: (phụ lục 8b)

Tắt cả các loại bón đều được hòa vào nước và bón trực tiếp xung quanh gốctrà vào 6h sáng hoặc 5h chiều để tránh bị mất chất Đây là 2 khoảng thời gian thíchhop dé bón

Lô 1: Bon dich trùn quéL6 2: Bon phan damLô 3: Bon trùn qué + Phân Lan + Phan KaliLô 4: BónN PK

Lô 5: Không bón

20

Bảng 2.3 Quy trình bón trà

Hình thức Thực nghiệm 1 Thực nghiệm2 | Thực nghiệm 3

STT bón (bón 1 lần trong (bón 2 lần (bón 3 lần

15 ngày) trong 15 ngày) | trong 15 ngày)

| Bon dịch Bon 51/1 lần Bon 2,5 llần | Bon 1,67 lần

trun que

2 Bon phan Bon 73 g/1 lần Bon 36,5 g/lan | Bon 24 g/lan

Bon tron 5 | trun quê + 42 2,5 | trun quê + 1,671 trùn qué

qué + g K,0 + 225 g 21g3 A TA À +14¢K,0+

phân lân + P;Oz/[l lân K,0+112,5 g 75 ø P.O./lần

phân kali PzOs/lần 5.215

16.0 Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

PHAN 3:

KET QUA

3.1 Khảo sát quá trình tự phân của trùn quế3.1.1 Khảo sát on ếu tố hoạt ng protease trong quá trình tự phân

3.1.1.1 Khảo sát các chất ức chế vi sinh vật gây thốiChúng tôi thực hiện thực nghiệm trên các chất ức chế vi sinh vật của dịchtrùn như NaN3, HCl, acid lactic, Kali sorbate Kết quả đánh gia cảm quan thu đượcdịch trùn tự phân suốt thời gian đến 12 ngày, nhận thấy khi sử dung NaN; dịch trùnkhông mùi thối NaN; là một chat ức chế vi khuẩn và còn được dùng trong nôngnghiệp để trừ dịch hại

Bảng 3.1 Đánh giá mau, mùi của các chất ức chế vi sinh vậtChất ức chế

NaN3 HCl Acid lactid Kali sorbateQuan sat

Ngày 1-4 Nau sam Nau Nau nhat Nau

Tanh nhe, Tanh nhe, Tanh nhe, Tanh nhe,khong thoi |khôngthối |khôngthối | không thối

Ngày 5-7 Nâu sậm Nâu Nâu nhạt Nâu

Tanh nhẹ, Thối, sui bọt | Thối, sui bọt | Thikhông thối

Ngày 8-12 Nâu sậm Nâu Nâu nhạt Nâu

Tanh nhẹ, Thối, sủi bọt | Thối, sủi bọt | Thối, sủi bọtkhông thối

Dich trun thủy phân chứa NaN; Dịch trùn thủy phân chứa HCI

23

O.OG2€ R #

0.0557P Không lắc

0.060.05

0.040790.04 —

Hoat tinh protease (U/ml)

0.02 —0.01 -~

Ham lrong trun (%)

Các giá trị có chữ cái khác nhau cho thay sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% (Duncan)Hình 3.2 Anh hưởng của chế độ lắc và hàm lượng trùn trong quá trình tự phân

Nhận xét: việc lac trong quá trình tự phân làm protease hoạt động cao hontrong quá trình tự phân tĩnh Kết quả thu được phù hợp với khảo sát của Trần NgọcHùng ở Đại học Thủ Dầu Một (2016) [6] Tuy nhiên protease hoạt động chế độ ủcó lắc ở quy mô phòng thí nghiệm chênh lệch 10% so với chế độ ủ không lac, theoyêu cầu của nhà sản xuất tiết kiệm năng lượng và thiết bị, nên chúng tdi thực hiệncác nghiệm thức trong quá trình tự phân ở chế độ ủ không lắc

Hoạt tính protease gia tăng khi hàm lượng trùn tăng đến 13%, đạt mức giá

trị cao nhất của hệ protease hoạt động, sau đó hoạt tính giảm ở 15% Kết quá đạt

được ở giá trị 13% phù hợp với kết quả nghiên cứu và khảo sát trùn quế của PhanThị Bích Trâm (2006) [19] Phân tích thống kê cho thay sự khác biệt rõ rang giữacác nghiệm thức hàm lượng trùn, do đó chúng tôi sẽ sử dụng hàm lượng trùn là13% để thực hiện nghiên cứu tiếp theo của quá trình tự phân trùn quế (Xem kếtquả phụ lục 5.b)