Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát khả năng nuôi cấy tế bào Celatrus Hindsii Benth có khả năng sinh tổng hợp Terpenoid

Cám ơn các anh chị làm việc tại khoa Hoá Sinh- Sinh Học Phân Tử của trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch đã tạo điều kiện thuận lợi, cho tôi một môi trường làm việc thoải mái, cơ sở vật

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu

Lá non từ cây Celastrus hindsii (có nguồn gốc từ tỉnh Hoà Bình) được trồng tại quận 12, thành phố Hồ Chí Minh.

Phương pháp nghiên cứu

Hình 3.1: Lá non được sử dụng để cảm ứng mô sẹo

Thu nhận và sấy khô ở 50 o C

Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu chung

Cao chiết n-hexan Định tính hợp chất terpenoid từ mô sẹo và lá

Khảo sát khả năng gây độc với tế bào ung thư vú

SK-BR-3 Ghiền và ly trích với n-hexan Cảm ứng tạo mô sẹo

Sấy khô ở 50 o C Lá cây Xạ Đen

Kinetin(0,2; 0,3; 0,4 mg/l) BAP (0,2; 0,3; 0,4 mg/l) 2,4-D(0,3;0,5;0,7;1 mg/l) NAA(0,3;0,5;0,7;1mg/l)

Thành phần khoáng (MS; MS1/2; B5)

Tăng sinh khối mô sẹo Hàm lượng Saccharose

Lá Xạ Đen được khử trùng theo các bước sau:

 Mẫu lá được đặt dưới vòi nước chảy trong 15 phút để loại bỏ bụi bẩn

 Ngâm lắc mẫu lá trong xà bông bột pha loãng trong 15 phút

 Rửa lại bằng nước máy từ 4 - 5 lần và đưa vào tủ cấy

 Chuyển mẫu vào một erlen khác đã hấp khử trùng

 Ngâm lắc mẫu trong cồn 70 o trong 5 phút

 Ngâm lắc mẫu bằng nước cất vô trùng 1 - 2 lần trước khi chuyển sang dung dịch HgCl2 0,1% cùng với 2 - 3 giọt tween trong 15 phút

 Mẫu cấy được rửa bằng nước cất vô trùng 3 - 4 lần trước khi cấy vào môi trường dinh dưỡng

Mẫu lá sau khi khử trùng được cắt bỏ rìa lá bị đen do tác động của chất khử trùng Sau đó cắt thành từng mảnh 1x1 cm và đặt trên môi trường dinh dưỡng

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên sự tạo mô sẹo

Môi trường nuôi cấy MS được bổ sung saccharose (30 g/l) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm: 2,4-D hoặc NAA (nồng độ 0,3; 0,5; 0,7 và 1 mg/l) kết hợp với BA hoặc Kinetin (nồng độ 0,2; 0,3 và 0,4 mg/l) để nuôi cấy mẫu cấy.

Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 4 chai, mỗi chai 3 mẫu và lặp lại 3 lần Điều kiện nuôi cấy:

- Nhiệt độ: 25 ± 2 o C - Độ ẩm: 70 ± 2 o C - Ánh sáng: 0 lux

Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mô sẹo tạo thành, hình thái mô sẹo sau 12 ngày nuôi cấy

3.2.4 Khảo sát sự tăng sinh của mô sẹo:

3.2.4.1 Ảnh hưởng của thành phần khoáng lên sự tăng sinh của mô sẹo:

Mô sẹo hình thành trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l BA và 0,3 mg/L Kinetine kết hợp với 0,3; 0,5; 0,7; 1 mg/L 2,4-D Sau 12 tuần nuôi cấy được chuyền sang môi trường có thành phần khoáng thay đổi là MS, MS 1/2 và B5 với trọng lượng mô sẹo khởi đầu là 300 mg trọng lượng tươi/ 250ml, mỗi lần khảo sát 3 bình, lặp lại 2 lần Điều kiện nuôi cấy:

- Nhiệt độ: 25 ± 2 o C - Độ ẩm: 70 ± 2 o C - Ánh sáng: 0 lux

Chỉ tiêu theo dõi: sự tăng sinh của mô sẹo được tính theo chỉ số tăng trưởng sau 30 ngày nuôi cấy

3.2.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên sự tăng sinh của mô sẹo:

Mô sẹo được hình thành trên môi trường MS 1/2 bổ sung 0,2 mg/L BA kết hợp với 0,3 mg/L 2,4-D và môi trường B5 bổ sung 0,3 mg/L Kinetin kết hợp với 0,7 mg/L 2,4-D Sau 30 ngày nuôi cấy được chuyền sang môi trường có nồng độ saccharose thay đổi 10; 20; 30 và 40 g/l, với

Trang 26 trọng lượng mô sẹo khởi đầu là 300 mg trọng lượng tươi/ 250 ml, mỗi lần khảo sát 3 bình, lặp lại 2 lần Điều kiện nuôi cấy:

- Nhiệt độ: 25 ± 2 o C - Độ ẩm: 70 ± 2 o C - Ánh sáng: 0 lux

Chỉ tiêu theo dõi: sự tăng sinh của mô sẹo được tính theo chỉ số tăng trưởng sau 30 ngày nuôi cấy

3.2.4.3 Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng sinh khối mô sẹo:

Mô sẹo tăng sinh trong môi trường MS 1/2 bổ sung 0,2 mg/L BA; 0,3 mg/L 2,4-D; 10 g/L saccharose và môi trường B5 bổ sung 0,3 mg/L Kinetin; 0,7 mg/L 2,4-D; 10 g/L saccharose được khảo sát sự tác động của ánh sáng lên sự tăng sinh của mô sẹo, với trọng lượng mô sẹo khởi đầu là 300 mg trọng lượng tươi/ 250 ml, mỗi lần khảo sát 3 bình, lặp lại 2 lần Điều kiện nuôi cấy:

- Nhiệt độ: 25 ± 2 o C - Độ ẩm: 70 ± 2 o C - Điều kiện chiếu sáng:

+ Ngoài sáng với cường độ chiếu sáng 2800 lux và thời gian chiếu sáng 24/24

Chỉ tiêu theo dõi: sự tăng sinh của mô sẹo được tính theo chỉ số tăng trưởng sau 30 ngày nuôi cấy

3.2.5 Trích ly và xác định sự hiện diện của terpenoid trong cao chiết n- hexan của lá và mô sẹo được cảm ứng từ lá Định tính terpenoid bằng phương pháp hóa học và sắc ký bản mỏng

Lá cây tươi Mô sẹo

Sấy ở 50 o C đến khối lượng không đổi

Ngâm dầm trong n-hexan trong 8 – 12 h

Cao n-hexan Đánh giá khả năng gây độc với tế bào ung thư vú SK-BR-3

Hình 3.3: Sơ đồ ly trích thu nhận cao chiết n-hexan

Lá cây tươi và mô sẹo trên môi trường MS 1/2 bổ sung 0,2 mg/L BA;

0,3 mg/L 2,4-D; 10 g/L saccharose và môi trường B5 bổ sung 0,3 mg/L Kinetin; 0,7 mg/L 2,4-D; 10 g/L saccharose được sấy khô ở 50 o C đến khi đạt được khối lượng không đổi Sản phẩm khô thu được của thân cây và mô sẹo được xay thành bột mịn 200 g được ngâm trong dung môi n- hexan (300 ml) từ 8h – 12h sau đó tiến hành ly tâm 3000 vòng/ 5 phút

Thu nhận phần dịch ở trên, phần cặn tiếp tục được ngâm trong dung môi n-hexan lần 2 Sau đó, lại ly tâm để thu nhận phần dịch Phần dịch chiết n-hexan cho bốc hơi, thu được cao n-hexan

3.2.5.2 Định tính terpenoid trong cao n-hexan:

 Phản ứng Liebermann – Burchard: ống nghiệm có chứa 1 ml dịch chiết mẫu Cho thêm anhidric acetic (1ml), chloroform (1ml), làm lạnh ống nghiệm rồi thêm một giọt H2SO4 đậm đặc Phản ứng dương tính: dịch chiết mẫu đổi thành màu cam đỏ ở mặt phân cách, màu bền không đổi.[28]

 Phản ứng Salkowski: ống nghiệm có chứa 1 ml dịch chiết mẫu,1 ml chloroform và 1 ml H2SO4 đậm đặc Phản ứng dương tính: xuất hiện màu nâu đỏ ở mặt phân cách [29]

Phương pháp sắc ký bản mỏng:

Bản mỏng sắc ký được sử dụng là bản silicagel tráng nhôm (Merck 60 F 254 )

Sử dụng hai hệ dung môi:

 Hệ dung môi CHCl3: MeOH: H2O = 65:35:10 Hệ dung môi này giúp tách các thành phần saponin, terpenoid dạng glycoside và alkaloid [27]

Bản sắc ký sau khi giải ly được nhúng qua thuốc thử là H2SO4

10%/ethanol và sau đó đem sấy ở 110 o C từ 5 – 10 phút

Hệ dung môi n-Butanol: acid acetic: H2O = 4:1:5 được sử dụng để phân tách các thành phần đường của saponin triterpenoid, thành phần acid amin và các thành phần khác Sau khi giải ly, bản sắc ký được nhúng qua thuốc thử H2SO4 10%/ethanol và sấy khô ở nhiệt độ 110 độ C trong thời gian 5-10 phút.

Nếu hệ hai dung môi đều xuất hiện các vết chính có màu tím trong khoảng 1/3 – 2/3 chiều dài bản sắc ký, điều này chỉ ra sự hiện diện của terpenoid trong mẫu.

3.2.6 Khảo sát khả năng gây độc tế bào đối với tế bào ung thư vú SK- BR-3 của cao chiết n-hexan từ lá và mô sẹo cảm ứng từ lá:

3.2.6.1 Dòng tế bào ung thư vú và môi trường nuôi cấy:

Dòng tế bào ung thư vú SK-BR-3 được mua từ Memorial Sloan- Kettering Cancer Center Đây là dòng tế bào ung thư vú của người có biểu hiện quá mức các sản phẩm của gen HER2 (Neu/ErbB-2)

Môi trường nuôi cấy là môi trường McCoy’s 5A (American Type Culture Collection)

Tế bào được nuôi cấy trong môi trường McCoy’s 5A bổ sung thêm 10% huyết thanh bò, penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml) ở 37 o C và 50μg/ml CO 2

- Methylthiazolyl diphenyl – tetrezolium bromide (MTT) - Dimethyl sulfoxide (DMSO)

3.2.6.3 Phương pháp gây độc tế bào:

Cải biên từ phương pháp MTT được thực hiện bởi Mossman (1983)

Enzym dehydrogenase trong ty thể ở các tế bào còn sống sẽ phân cắt vòng tetrazolium tạo thành các tinh thể màu tím, không tan trong nước

Các tinh thể này sẽ tan trong isopropanol acid hóa và tạo thành dung dịch màu tím Số lượng tế bào tăng hay giảm dẫn đến sự thay đổi số lượng formazan được hình thành Nồng độ ức chế tế bào của mẫu thử (IC50) là nồng độ mà ở đó tế bào bị chết 50%

3.2.6.4 Quy trình thực hiện (theo protocol của hãng Life Technologies)

Quan sát tế bào, khi tế bào đạt mật độ 80%, tiến hành trypsin (0.25%, 0.53mM EDTA) để thu hoạch

KẾT QUẢ – THẢO LUẬN

Kết quả

4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên sự tạo mô sẹo

Lá Xạ Đen sau khi khử trùng được cắt thành từng mảnh có kích thước 1,0 cm x 1,0 cm và cấy vào môi trường MS bổ sung auxin và cytokinin ở các nồng độ khác nhau để cảm ứng tạo mô sẹo Sự tạo mô sẹo được ghi nhận sau 12 ngày nuôi cấy (bảng 4.1 và 4.2)

Kết quả ở bảng 4.1 và 4.2 cho thấy sự khác nhau về loại cũng như nồng độ của auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy dẫn đến sự khác nhau về thời gian tạo sẹo và tỷ lệ mẫu cấy tạo sẹo a Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA hay Kinetin với NAA trên sự hình thành mô sẹo (hình 4.1) Ở nghiệm thức BA 0,2 mg/L kết hợp với NAA (0,7; 1 mg/L), sau 4 ngày nuôi cấy đã xuất hiện mô sẹo với tỷ lệ lần lượt là 16,67 % và 25% Sau 12 ngày nuôi cấy, các nghiệm thức có sự kết hợp giữa BA (0,2; 0,3 mg/L) và NAA (0,3; 0,5; 0,7; 1 mg/L) đều có tỷ lệ tạo sẹo cao (> 75%), riêng nghiệm thức gồm BA 0,2 mg/L và NAA 0,3 mg/L không có sự xuất hiện của mô sẹo

Ban đầu rìa lá dày lên, sau đó xuất hiện các cụm mô sẹo lớn, màu trắng đục ở rìa mẫu lá, rồi lan dần ra và chuyển sang màu vàng Sẹo rắn, chắc Ở vùng gân chính của mẫu lá, xuất hiện các mô sẹo mới màu trắng tuyết, nhưng sau hơn 16 ngày nuôi cấy, từ những mô sẹo mới có sự biệt hoá tạo rễ bất định

Rễ bất định có kích thước dài hơn trên các môi trường có nồng độ NAA thấp (0,3 và 0,5 mg/L), trên các môi trường có NAA nồng độ cao hơn (0,7 và 1 mg/L) rễ bất định ngắn Ở nghiệm thức có BA 0,4 mg/L kết hợp với NAA nồng độ thay đổi, sự tạo sẹo rất yếu ở các nồng độ NAA 0,3 và 0,5 mg/L, không tạo sẹo ở NAA 0,7 và 1 mg/L

Trong các nghiệm thức có sự kết hợp giữa Kinetin và NAA Ở nồng độ Kinetin 0,3 mg/L và 0,4 mg/L, sau 12 ngày nuôi cấy, tỷ lệ mẫu cấy tạo sẹo

Trang 36 cao (> 70 %) Mô sẹo xuất hiện sớm nhất (sau 4 ngày nuôi cấy) ở nghiệm thức gồm 0,3 mg/L Kinetin kết hợp với NAA ở nồng độ 0,7 hay 1 mg/L Mô sẹo có hình dạng và màu sắc giống như mô sẹo trên môi trường có BA kết hợp với NAA và cũng có sự biệt hoá rễ bất định sau hơn 16 ngày nuôi cấy

Với nghiệm thức có sự kết hợp giữa Kinetin 0,2 mg/L với nồng độ NAA thay đổi, ban đầu rìa lá cũng phồng lên nhưng ít hơn trên môi trường bổ sung BA và NAA, sau đó xuất hiện các cụm sẹo ở xung quanh rìa lá Tuy nhiên, các cụm tế bào này không tăng sinh mà dần dần bị hoá nâu đen (hình 4.1.d)

Riêng ở nghiệm thức gồm Kinetin 0,2 mg/L và NAA 0,3 mg/L, không có sự xuất hiện của mô sẹo

Hình 4.1: Mô sẹo từ lá Xạ Đen sau 16 ngày nuôi cấy trên môi trường có NAA kết hợp với BA hay Kinetin a BA 0,2 mg/L và NAA 1 mg/L; b BA 0.3 mg/L và NAA 0,5 mg/L c Kinetine 0,3 mg/L và NAA 0,5 mg/L; d Kinetine 0,2 mg/L và NAA 1 mg/L

Bảng 4.1: Sự hình thành mô sẹo từ lá Xạ Đen trên môi trường MS bổ sung

NAA kết hợp với BA hay Kinetin

Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)

Sẹo màu trắng đục ở rìa mẫu lá, rồi lan dần ra và chuyển sang màu vàng Sẹo rắn, chắc Sau hơn 16 ngày nuôi cấy, có sự biệt hoá tạo rễ bất định

0,3 - 8,33 8,33 Sẹo là những cụm sẹo màu trắng trong ở rìa mẫu lá Sau đó hoá nâu

Sẹo là những cụm sẹo màu trắng trong ở rìa mẫu lá Sau đó hoá nâu

Sẹo màu trắng đục ở rìa mẫu lá, rồi lan dần ra và chuyển sang màu vàng Sẹo rắn, chắc Sau hơn 16 ngày nuôi cấy, có sự biệt hoá tạo rễ bất định

Trang 38 b Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BA hay Kinetin với 2,4-D trên sự hình thành mô sẹo (hình 4.2) Ở nghiệm thức BA 0,2 mg/L kết hợp với 2,4 –D (0,3; 0,5mg/L), sau 4 ngày nuôi cấy đã xuất hiện mô sẹo với tỉ lệ lần lượt là 58.33% và 41.67%

Sau 12 ngày nuôi cấy, các nghiệm thức có sự kết hợp giữa BA 0,2 mg/L và 2,4-D (0,3; 0,5; 0,7; 1 mg/L) đều có tỷ lệ tạo sẹo cao 100% Mô sẹo ban đầu có màu trắng trong, gồm những cụm nhỏ li ti phân bố ở vùng gân chính, sau đó là ở gân hai bên rồi hình thành ở xung quanh rìa lá, ngay vết cắt Mô sẹo lan dần khắp bề mặt mẫu cấy và chuyển dần sang màu trắng, hơi nâu, chắc

Với nồng độ BA (0,3 và 0,4 mg/L), ở ngày thứ 8, mô sẹo mới xuất hiện Ban đầu rìa lá cũng phồng mạnh to, sau đó xuất hiện cụm mô sẹo li ti ở rìa lá

Tuy nhiên, các cụm tế bào này không lan rộng ra mà bị hoá nâu

Trên các môi trường có sự hiện diện của 2,4-D và Kinetin, tỷ lệ mẫu cấy tạo sẹo rất khác nhau giữa các nghiệm thức Trên môi trường có Kinetin 0,3 mg/L, mô sẹo xuất hiện sớm nhất (ngày thứ 4 của quá trình nuôi cấy) Sau 12 ngày mẫu cấy trên tất cả các môi trường có sự kết hợp giữa 2,4-D và Kinetin đều tạo sẹo với tỷ lệ 100% Khác với BA, mẫu lá ban đầu trong môi trường chỉ hơi phồng to Mô sẹo ban đầu xuất hiện ở vùng gân chính, sau đó là ở gân hai bên rồi hình thành ở xung quanh rìa lá, ngay vết cắt Sẹo là những cụm lớn, màu trắng xanh nhạt sau đó chuyển dần sang màu trắng đục, hơi mềm

Bảng 4.2: Sự hình thành mô sẹo từ lá Xạ Đen trên môi trường MS bổ sung

2,4-D kết hợp với BA hay Kinetin

Tỷ lệ tạo mô sẹo % 4 ngày 8 ngày 12 ngày Hình thái mô sẹo

0,2 0,3 58,33 91,67 100 Mô sẹo phân bố ở vùng gân chính, lan ra gân hai bên rồi hình thành ở xung quanh rìa lá, ngay vết cắt Sẹo có màu trắng vàng, hơi nâu, cứng

Ban đầu rìa lá phồng lên, xuất hiện hạt nhỏ li ti ở rìa lá, màu trắng xám nhẹ Sau đó hoá nâu

Mô sẹo ban đầu phân bố ở vùng gân chính, sau đó là ở gân hai bên rồi hình thành ở xung quanh rìa lá, ngay vết cắt Sẹo có trắng đục, hơi xốp, phía trên là mô sẹo mới, màu trắng tuyết

Thảo luận

4.2.1 Vai trò của auxin và cytokinin trên sự hình thành và tăng sinh của mô sẹo:

Trong nuôi cấy mô/tế bào thực vật, auxin và cytokinin là hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng đóng vai trò thiết yếu trong sự phát sinh hình thái Auxin như NAA và 2,4-D kích thích tạo rễ ở nồng độ thấp và mô sẹo ở nồng độ cao Ngược lại, cytokinin như BA và Kinetin thúc đẩy sự hình thành chồi Điểm mấu chốt là sự kết hợp đồng thời của auxin và cytokinin có tác dụng kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp DNA, dẫn đến quá trình phân bào nguyên phân,从而 tạo ra các mô và cơ quan mới.

Hình 4.15: Kết quả điện di cDNA tại các thời điểm 24h, 48h và 72h C Mẫu tế bào không ủ với cao chiết từ mô sẹo trên môi trường B5 D Mẫu tế bào được ủ với cao chiết từ mô sẹo trên môi trường B5 ở nồng độ 150 àg/mL

Trang 54 tăng sinh của mô sẹo Nghiên cứu của Abd Elaleem và cộng sự (2009) ghi nhận sự cảm ứng mô sẹo từ củ Solanum tuberosum trên môi trường chỉ bổ sung BA kém hiệu quả hơn khi kết hợp BA với 2,4-D [30] hay nghiên cứu của Arivalagan và cộng sự (2012) cho thấy mô sẹo không thể hình thành trên môi trường chỉ bổ sung Kinetin [31] Tỷ lệ auxin/ cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích sự hình thành rễ Ngược lại, nếu tỷ lệ này nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy sự tạo chồi Tỷ lệ tương đương 1, mô sẹo được hình thành Các mô khác nhau có phản ứng không giống nhau Vì vậy, với từng loại mô và từng giai đoạn sinh trưởng khác nhau việc tìm tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp có ý nghĩa quan trọng Ở mẫu cấy từ lá non cây Xạ Đen, khi có sự kết hợp của BA 0,2 mg/L với 2,4-D 0,3 mg/L hay 0,5mg/L, sau 4 ngày nuôi cấy đã xuất hiện mô sẹo với tỉ lệ lần lượt là 58,33% và 41,67% Sau 12 ngày nuôi cấy, tỷ lệ tạo sẹo đạt 100% ở cả 4 nồng độ 2,4-D khảo sát (bảng 4.2) Tương tự, trên môi trường có sự hiện diện của Kinetin và 2,4-D ở cả 4 nồng độ 0,3; 0,5; 0,7; 1 mg/L, mô sẹo xuất hiện sớm nhất sau 4 ngày nuôi cấy với tỉ lệ tạo sẹo lần lượt là 58.33%; 50%; 58,33%; 66,67% và sau 12 ngày nuôi cấy đều đạt 100% Tiếp tục cấy chuyền và nuôi cấy mô sẹo trên môi trường MS, sau 30 ngày, mô sẹo tăng trưởng mạnh nhất trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/L BA kết hợp với 0,3 mg/L 2,4-D (chỉ số tăng trưởng là 2.83) và môi trường MS bổ sung 0,3 mg/L Kinetin kết hợp với 0,7 mg/L 2,4-D (chỉ số tăng trưởng là 2,85)

Mặc dù đều là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng BA có hoạt tính mạnh hơn Kinetin [19], nên ở nồng độ 0,2 mg/L, BA có lẽ đã có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành mô sẹo Vì vậy, nồng độ BA càng tăng, tỷ lệ tạo sẹo giảm dần Với Kinetin, nồng độ 0,2 – 0,4 mg/L đều có tác động đến sự hình thành mô sẹo Tuy nhiên, mô sẹo xuất hiện sớm nhất và tỷ lệ tạo sẹo cao nhất ở nồng độ 0,3 mg/L Ở nồng độ 0,2 mg/L, tỷ lệ tạo sẹo thấp nhưng ở 0,4 mg/L, khả năng tạo sẹo bắt đầu giảm

Khi kết hợp với BA nồng độ 0,2 mg/L, 2,4-D có tác động tích cực đến sự hình thành mô sẹo với nồng độ thấp (0,3 và 0,5 mg/L) Ngược lại, NAA nồng độ 0,3 mg/L không kích thích sự tạo sẹo; ở nồng độ 0,5 mg/L, mô sẹo bắt đầu hình thành, nhưng nồng độ tốt nhất cho sự hình thành mô sẹo là 0,7 và 1 mg/L (mô sẹo hình thành sau 4 ngày với tỷ lệ tạo sẹo lần lượt là 16,67% và 25%) Tuy nhiên, sau hơn 16 ngày nuôi cấy, tất cả mô sẹo hình thành trên môi trường có bổ sung NAA đều biệt hoá tạo rễ bất định Điều này chứng tỏ 2,4-D thích hợp cho sự cảm ứng, sự hình thành và tăng sinh mô sẹo ở cây Xạ Đen hơn so với NAA Trong nuôi cấy mô thực vật, 2,4-D được xem là auxin tốt nhất cho sự cảm ứng tạo sẹo ở cây một lá mầm cũng như hai lá mầm [32][33][34], còn NAA thường được sử dụng để kích thích ra rễ ở cành giâm [35]

4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ khoáng lên sự tăng sinh của mô sẹo:

Trong nuôi cấy in vitro, thành phần khoáng có vai trò quan trọng trong việc cảm ứng, tăng sinh và phát sinh hình thái mô sẹo Bên cạnh chất điều hoà sinh trưởng thực vật, môi trường trong nuôi cấy in vitro đều được bổ sung nitrogen dưới dạng nitrate và ammonium với hàm lượng khác nhau

Nghiên cứu của Mohamed (1996) đã cho thấy nguồn nitrogen đa dạng trong môi trường dinh dưỡng có tác động đáng kể đến sự hình thành mô sẹo [36]

Ngoài ra, tỉ lệ ion NH4 + và NO3 - tối ưu cũng có tác dụng thúc đẩy sự tăng trưởng tế bào Chúng giúp tế bào hấp thu NO3 - tốt hơn và ngăn độc tính của NH4 +

[37] Ion K + cũng có tác dụng không nhỏ, chúng giúp duy trì khả năng thẩm thấu của tế bào, ảnh hưởng đến sự co giãn của tế bào, độ dày và sức bền của thành tế bào [38] K + còn có vai trò trong sự hoạt hoá enzyme, tổng hợp protein và quá trình quang hợp [39] Trong thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của nồng độ khoáng khác nhau từ các môi trường MS, MS1/2 và B5 lên khả năng sinh trưởng của mô sẹo với bổ sung 0,2 mg/L BA; 0,3 mg/L 2,4-D hay 0,3 mg/L Kinetin; 0,7 mg/L 2,4-D

Trang 56 Ở cả hai sự kết hợp auxin và cytokinin chỉ số tăng trưởng của mô sẹo trên môi trường MS đều thấp, lần lượt là 2,83 và 2,85 Kết quả này có thể do hàm lượng nitrogen tổng trong môi trường MS cao hơn so với nhu cầu thực sự cho sự tăng trưởng của mô sẹo Ở bảng kết quả 4.6, hàm lượng nitrogen tổng trong môi trường MS cao gấp 2 lần so với trong môi trường MS1/2 và B5

Sự dư thừa nitrogen dẫn đến sự tích hàm lượng NH4 + và nitrate trong môi trường ở nồng độ cao Đây cũng là tác nhân ức chế sự tăng trưởng của mô sẹo vì chúng làm giảm hoạt tính của enzyme nitrate reductase và glutamate synthese trong quá trình sản xuất amino acid [40]

Bảng 4.6: Thành phần ion trong môi trường sử dụng [41]

K + 20 10 24,7 Ở nghiệm thức có sự kết hợp 0,2 mg/L BA với 0,3 mg/L 2,4-D, môi trường MS1/2 là môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của mô sẹo (chỉ số tăng trưởng là 3,44) Nhưng B5 lại là môi trường tối ưu cho sự cảm ứng mô sẹo với sự hiện diện của 0,3 mg/L Kinetin và 0,7 mg/L 2,4-D (chỉ số tăng trưởng là 3,21) Từ bảng 4.6, chúng tôi nhận thấy hàm lượng nitrogen tổng của hai môi trường MS 1/2 và B5 tương đương nhau nhưng nồng độ của các ion và tỉ lệ NH4 +

/NO3 - lại có sự khác biệt đáng kể Ở môi trường B5, nồng độ ion NH 4 + thấp hơn trong môi trường MS1/2 (lần lượt là 2,0 và 10,3), nhưng bù lại hàm lượng NO3 - lại cao hơn (lần lượt là 24,7 và 19,7) nên nguồn

Trang 57 nitrogen tổng cung cấp cho sự tăng trưởng của mô sẹo không bị thiếu hụt

Mặt khác, tỉ lệ NH4 +

/NO3 - trong môi trường B5 thấp hơn trong môi trường MS 6,5 lần nhưng hàm lượng K + trong môi trường B5 cao gấp 2,5 lần so với môi trường MS1/2 Sự mất cân bằng do sự chênh lệch nồng độ ion NH 4 + và NO3 - trong môi trường B5 có lẽ được đưa về cân bằng nhờ có hàm lượng K + cao vì tổng hàm lượng ion âm (NO3 -

= 24,7 mM) tương đương với tổng hàm lượng ion dương (NH4 +

= 2 mM, K + = 24,7 mM) Vì vậy, sự tăng trưởng của mô sẹo không bị ức chế

Mặt khác, tổng nồng độ ion âm (NO3 -

) trong cả ba môi trường MS, MS1/2 và B5 luôn xấp xỉ với tổng nồng độ ion dương (NH4 + và K + ) Do đó, sự khác biệt về tỉ lệ NH4 +

/NO3 - hầu như không ảnh hưởng nhiều đến sự tăng trưởng của mô sẹo Sự tăng trưởng của mô sẹo bị kìm hãm có thể là do tác động của ion NH 4 + dư thừa khi môi trường có nồng độ nitrogen cao hơn nhu cầu của mô sẹo Ngoài ra, do sự kết hợp khác biệt về nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng thực vật nên khi kết hợp giữa BA và 2,4-D, mô sẹo tăng trưởng tốt nhất trên môi trường MS 1/2 nhưng khi kết hợp giữa Kinetin và 2,4-D, mô sẹo lại tăng trưởng tốt nhất trên môi trường B5

4.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên sự tăng sinh của mô sẹo:

Nguồn carbon được sử dụng trong nuôi cấy in vitro là đường, thông dụng là saccharose, glucose, fructose Đường là nguồn cung cấp năng lượng, sườn carbon cho các phản ứng tổng hợp trong tế bào giúp cho sự tăng trưởng và phân chia của tế bào Bên cạnh đó, đường còn là yếu tố tín hiệu cho nhiều con đường chuyển hóa trong tế bào [42]