NHIEM VU VA NOI DUNG: + Khao sát hoạt tinh kháng vi sinh vật vi khuan và nam mốc của dịch chiếthạt bưởi trích li băng phương pháp CO, siêu tới han và chiết Soxhlet với dung môiethyl acet
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Quả bưởi Thanh Trà được thu mua từ những vườn bưởi tại Thừa Thiên Hué.
Quả sau khi thu mua được tách lay hạt, hat bưởi đem đi say ở nhiệt độ 50°C trong 72 giờ và được đem đi nghiền mịn thành bột hạt và bảo quản ở 0°C Bột hat được đem trích li bang ethyl acetate va CO, siêu tới han dé thu dịch chiết hạt bưởi.
Dịch chiết hạt bưởi được sử dụng cho các thử nghiệm khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng oxy hóa.
Sử dụng bốn chủng vi khuẩn và hai chủng nam mốc để khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật cua dich chiết hạt bưởi Các chủng vi khuẩn được sử dụng gồm hai chủng vi khuẩn Gram dương là Staphylococcus aureus va Bacillus cereus (VTCC — B — 1005); hai chủng vi khuẩn Gram âm là Salmonella typhi và Pseudomonas aeruginosa Hai chủng nam mốc được sử dụng là Fusarium solani
(VTCC—-F—827)và Aspergillus flavus (VLỤCC — F— 824).
Các chủng Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa được cung cấp bởi Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Thanh phố Hỗ Chí Minh.
Các chung Bacillus cereus (VTCC — B — 1005), Fusarium solani (VTCC — F —
827), Aspergillus flavus (VTCC — F — 824) được cung cấp bởi Bảo tang Giống chuẩn Vi sinh vật Việt Nam.
2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường thứ nghiệm 2.1.3.1 Thiết bị và dụng cụ
Thiết bi CO, siêu tới hạn, thiết bi Soxhlet, thiết bi HPLC, bể siêu âm, máy cô quay chân không, máy ly tâm, máy sàng, tủ cấy, tủ 4m, tủ sấy, nôi hấp tiệt trùng,máy vortex, máy khuấy từ, bếp điện, cân phân tích, máy quang phô.
Micropipette, bình tam giác, cốc thủy tinh, bình định mức, lọ bị, ống nhỏ giọt, dao, đèn côn, đĩa petri, ống nghiệm, giá đỡ ống nghiệm, que trang, bình tam giác, kẹp.
Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng STT Tên hóa chat
Ethanol (EtOH) Methanol (MeOH) 2 ,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) l CO; tỉnh khiết
2 Ethyl acetate 3 Limonin 4 Acetonitrile (ACN) 5 Acid formic (HCOOH) 6 Nước khử ion (HO) 7
Môi trường hoạt hóa vi sinh vật: Tryptone Soya Broth (TSB), Potato Dextrose Broth (PDB).
Môi trường thử nghiệm khả năng kháng khuẩn: Mueller — Hinton Agar
(MHA), Potato Dextrose Agar (PDA).
Các môi trường TSB, PDB, MHA, PDA được san xuất bởi Himedia (An Độ) ở dạng bột khô, khi sử dụng cần hòa tan vào nước cất theo hướng dẫn của nhà sản xuất và được tiệt trùng ở 121°C, 1 atm trong 15 phút trước khi sử dụng.
Bảng 2.2 Thành phần môi trường Tryptone Soya Broth (TSB) Thành phân Hàm lượng (g/L)
Pancreatic digest of casein 17 Papaic digest of soyabean meal 3 Sodium chloride 5 Dextrose(Glucose) 2,5 Dipotassium hydrogen phosphate 2,5 pH ( at 25°C) 7.3+0.2
Bảng 2.3 Thành phần môi trường Potato Dextrose Broth (PDB) Thành phân Hàm lượng (g/L)
Bang 2.4 Thành phan môi trường Mueller — Hinton Agar (MHA) Thanh phan Hàm lượng (g/L)
Beef 300 Casein acid hydrolysate 175 Starch 15 Agar 17 pH (at 25°C) 7.3+0.1
Bang 2.5 Thanh phan môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) Thanh phan Hàm lượng (g/L)
Potatoes 200Dextrose 20Agar 15 pH ( at 25°C) 5.6+0.2
2.2.1 Khảo sát quy trình tách chiết bằng phương pháp CO, siêu tới hạn
Nghiên cứu nảy tập trung trích li dịch chiết trong điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm Khảo sát các yếu tố của điều kiện trích li bao gồm nhiệt độ, đồng dung môi, áp suất và thời gian trích li đến hàm lượng limonin trong dịch chiết.
2.2.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Cho 10 g bột hạt vào bộ phận chứa mẫu và tiễn hành quá trình trích li với các thông số cố định như sau:
Thời gian: 60 phút Đồng dung môi: EtOH 20% Áp suất: 20 MPa Lưu lượng dòng tổng: Q = 10 g/phút.
Khảo sát nhiệt độ chiết từ 40 °C, 50 °C, 60 °C.
Hàm mục tiêu: Hàm lượng limonin thu được.
2.2.1.2 Anh hưởng của đông dung môi ethanol
Cho 10 g bột hạt vào bộ phận chứa mẫu và tiễn hành quá trình trích li với các thông số cố định như sau:
Thời gian: 60 phút Áp suất: 20 MPa Lưu lượng dòng tổng: Q = 10 g/phút.
Nhiệt độ: giá trị đạt hiệu quả ở mục 2.2.1.1
Khảo sát lượng đồng dung môi EtOH chiết từ 0%, 30%, 40%.
Hàm mục tiêu: Hàm lượng limonin thu được.
2.2.1.3 Anh hưởng của áp suất
Cho 10 g bột hạt vào bộ phận chứa mẫu và tiễn hành quá trình trích li với các thông số cố định như sau:
Thời gian: 60 phút Đồng dung môi: giá trị đạt hiệu quả ở mục 2.2.1.2 Lưu lượng dòng tổng: Q = 10 g/phút.
Nhiệt độ: giá trị đạt hiệu quả ở mục 2.2.1.1
Khảo sát áp suất chiết từ 15 MPa, 20 MPa, 25 MPa.
Hàm mục tiêu: Hàm lượng limonin thu được.
2.2.1.4 Anh hưởng của thời gian trích li
Cho 10 g bột hạt vào bộ phận chứa mẫu và tiễn hành quá trình trích li với các thông số cố định như sau:
Nhiệt độ: giá trị đạt hiệu quả ở mục 2.2.1.1 Đồng dung môi: giá trị đạt hiệu quả ở mục 2.2.1.2 Áp suat: giá trị đạt hiệu quả ở mục 2.2.1.3
Lưu lượng dòng tổng: Q = 10 g/phút.
Khảo sát thời gian chiết từ 40, 60 và 80 phút.
Hàm mục tiêu: Hàm lượng limonin thu được.
2.2.2 Khảo sát quy trình chiết Soxhlet sử dung dung môi ethyl acetate Bột hạt bưởi sau khi tách dầu béo bang dung môi n-hexan trong 7 giờ, 80 °C với ty lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10, được đem chiết tiếp với ethyl axetate.
2.2.2.1 Anh hưởng của thời gian trích li
Khao sát ảnh hưởng của thời gian trích li trong 5, 6, 7 và 8 giờ với lượng bột hat là 10 g, trích li bang dung môi ethyl acetate, ở 90 °C với tý lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 (khối luong/thé tích, g/ml).
Hàm mục tiêu: Hàm lượng limonin thu được.
2.2.2.2 Anh hưởng của tỷ lệ nguyên liéu/dung môi
Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi (1/05, 1/10, 1/20, 1/30)
(khối lượng/thể tích, g/ml) với các thông số cố định: lượng bột hạt là 10 g, trích li băng dung môi ethyl acetate, ở 90 °C với thời gian trích li là giá trị được chọn ở mục 2.2.2.1.
Hàm mục tiêu: Hàm lượng limonin thu được.
2.2.3 Phân tích hàm lượng limonin bằng HPLC
Mẫu được tiêm vào hệ thống HPLC, sử dụng cột C18 với các thông số phân tích như sau:
Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút
Bước sóng phát hiện: 210 nm Nhiệt độ cột: 25 °C
Thể tích tiêm mẫu: 5 „L Thanh phan pha động: ACN:H,O (40:60) và 0,1 % HCOOH.
2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính khang vi sinh vật
2.2.4.1 Phương pháp do đường kinh vòng kháng khuẩn [96]
- Chuan bi dịch vi sinh vat:
Vi khuẩn được cây phân lập trên môi trường Tryptone Soybean Agar (TSA, Himedia, India), ủ trong 24 giờ ở 37°C Lay 2 — 3 khuẩn lạc đưa vào ống nghiệm chứa 5 mL môi trường TSB ủ trong 24 giờ ở 37“C.
Nam mốc được cấy phân lập trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA, Himedia, India), ủ trong 48 giờ ở 28°C Lấy 2 — 3 khuẩn lạc đưa vào ông nghiệm chứa 5 mL môi trường PDB ủ trong 48 giờ ở 28°C.
Dùng micropipet trải 100 pL dịch vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bao 10°
CFU/mL) lên mặt thạch MHA, sau đó trang đều dịch vi khuẩn, chờ khô bề mặt thạch Đặt đĩa giấy 6mm vô trùng được thấm 20 uL dịch chiết lên mặt thạch Sau đó đem ủ ở 37 °C, do và ghi nhận đường kính vòng kháng khuẩn sau 24 giờ.
Dung dịch đối chứng gồm EtOH 30%. Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d) được xác định bằng đường kính vòng kháng ngoài trừ đi đường kính đĩa giấy Đường kính vòng kháng khuẩn được tính băng milimet (mm).
Dùng micropipet trai 100 wL dịch vi nấm mỗi loại (mật độ tế bào 10°
CFU/mL) lên mặt thạch PDA, sau đó trang đều dịch vi nắm, chờ khô bề mặt thạch. Đặt đĩa giấy 6mm vô trùng được thấm 20 uL dịch chiết lên mặt thạch Sau đó đem ủ ở 28 °C, do và ghi nhận đường kính vòng kháng khuẩn sau 48 giờ.
Dung dịch đối chứng là EtOH 30%. Đường kính vòng kháng khuẩn (D — d) được xác định bang đường kính vòng kháng ngoài trừ đi đường kính đĩa giấy Đường kính vòng kháng khuẩn được tính bằng milimet (mm).
2.2.4.2 Phương pháp xác định nông độ ức chế toi thiểu (MIC) [97]
Dịch chiết được pha loãng băng EtOH 30% thành dãy nồng độ khác nhau.
Day nông độ dịch chiết cần thử: 80 mg/ml, 96 mg/ml, 112 mg/ml, 128 mg/ml, 144 mg/ml, 160 mg/ml, 176 mg/ml, 192 mg/ml.
KET QUA VA BAN LUAN
3.1 Quy trinh tach chiét dich chiét hat 3.1.1 Khảo sát quy trình tách chiết bằng phương pháp CO; siêu tới han 3.1.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích li bang CO, siêu tới han ở các giá trị là 40°C, 50°C và 60°C với lưu lượng dòng tong là 10 g/phút, áp suất 20 MPa, đồng dung môi EtOH 20% trong 60 phút.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích li được trình bay ở Bang 3.1 và Phụ lục 1.
Bang 3.1 Nong độ limonin theo nhiệt độ trích li Nhiệt độ CC) Nông độ limonin (ppm)
Kết qua Bảng 3.1 cho thay khi tăng nhiệt độ trích li từ 40, 50, 60°C nồng độ limonin thu được tương ứng là 190,66, 193,13, 194,27 ppm Theo R Hsu và cộng sự [98], nhiệt độ làm tăng kha năng truyền khối và khả năng khuếch tán của dung môi siêu tới hạn Mặt khác, khi nhiệt độ tăng thì khả năng hòa tan của dung môi tăng, các chất dịch chuyển vào dung môi cảng nhiều, nhưng đến một nhiệt độ thì khả năng hòa tan giảm Do đó, dé giảm chi phí vận hành thiết bị và giữ chất lượng sản phẩm trích li chọn giá trị nhiệt độ là 50°C và giá trị này được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.2 Anh hưởng của dong dung môi ethanol
Khảo sát ảnh hưởng của đồng dung môi là EtOH ở các giá trị 0%, 30% va 40% với lưu lượng dòng tổng là 10 g/phút, 50°C, 20 MPa trong 60 phút.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của đồng dung môi đến quá trình trích li được trình bày ở Hình 3.2 và phụ lục 2.
Bang 3.2 Nong độ limonin theo lượng đồng dung môi Đồng dung môi EtOH (%) Nong độ limonin (ppm)
Sử dụng thêm đồng dung môi là EtOH giúp quá trình tách chiết được dễ dàng, nhanh chóng hơn, làm cho quá trình khếch tán từ ngoài vao trong tế bào tăng lên và ngược lại, dẫn đến hòa tan các cau tử cần trích li được nhiều hơn CO; siêu tới hạn có khả năng tách những chất không phân cực và ít phân cực.
Kết quả Bang 3.2 cho thay khi thay doi hàm lượng đồng dung môi thì nồng độ limonin thu được cũng thay đổi theo Khi thay đối lượng đồng dung môi là 0 , 30 đến 40% thì nồng độ limonin tương ứng là 70,23, 145,13, 120,56 ppm Nong độ limonin thu được cao nhất khi lượng đồng dung môi là 30% Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của J Yu [72] khi nghiên cứu trích li limonin từ hạt bưởi bằng CO; siêu tới hạn Do đó, chọn luog đồng dung môi là 30% và giá tri này được dùng cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.3 Anh hưởng của dp suất
Khảo sát ảnh hưởng của áp suất đến quá trình trích li limonin bằng CO siêu tới hạn ở ba giá trị là 15 MPa, 20 MPa và 25 MPa với lưu lượng dòng tổng là 10 g/phiit, 50°C, 25 MPa trong 60 phút và đồng dung môi là EtOH 30%.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của áp suất đến quá trình trích li limonin được trình bày ở Bảng 3.3 và phụ lục 3.
Bang 3.3 Nong độ limonin theo áp suất Áp suất (MPa) Nông độ limonin (ppm)
Kết qua Bảng 3.3 cho thay khi tăng áp suất từ 15 MPa lên 25 MPa thì nồng độ limonin tăng từ 162,88 ppm lên 185,83 ppm Như vậy, nồng độ limonin thu được cao nhất khi tiến hành ở 25 MPa Kha năng hòa tan của dung môi phụ thuộc vào khối lượng riêng của dung môi Khi tăng áp suất thì khối lượng riêng của dung môi tăng, làm tăng hệ số truyền khối và khả năng hòa tan của chất chiết của tăng theo, thúc đây quá trình trích li đạt hiệu quả cao hơn Theo R Hsu và cộng sự [98], áp suất ảnh hưởng đến tỷ trọng của lưu chất siêu tới hạn, lưu chất có tý trọng càng cao thì độ hòa tan của các chất cảng lớn Tỷ trọng lưu chất tăng khi áp lực tăng Áp suất cao còn tăng khả năng phá vỡ tế bào góp phan giải phóng các chat [99] Tuy nhiên, áp suất tăng trong một giới hạn nhất định thì hiệu suất trích li mới tăng [100] Theo J Yu [72] khi nghiên cứu trích li limonin từ hạt bưởi bang CO, siéu toi han, ham lượng limonin thu được cao nhất tiễn hành trích li ở 48,3 MPa; nhưng do thông số về áp suất làm việc của thiết bị tỗi đa tại 25 MPa nên không thé tiép tục khảo sát ở mức cao hơn Do đó, chọn áp suất trích li là 25 MPa và giá trị nay được dùng cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.1.4 Anh hưởng của thời gian trích li
Khảo sát thời gian trích li limonin bằng CO: siêu tới han ở ba giá trị là 40 phút, 60 phút, 80 phút với lưu lượng dòng tổng là 10 g/phút, 50°C, 25 MPa với đồng dung môi là EtOH 30%.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích li đến hàm lượng limonin được trình bày ở Bảng 3.4 và phụ lục 4.
Bảng 3.4 Nong độ limonin theo thời gian Thời gian (phút) Nông độ limonin (ppm)
Kết qua Bảng 3.4 cho thấy nồng độ limonin tăng dan từ 150,05 ppm lên 185.83 ppm trong 20 phút đầu, từ thời gian 40 phút đến thời gian 60 phút Trong 20 phút, từ thời gian 60 phút đến thời gian 80 phút, nồng độ limonin lại giảm xuống còn 170,63 ppm Nông độ limonin thu được cao nhất khi trích li trong thời gian là 60 phút Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của J Yu [72] khi nghiên cứu trích li limonin từ hạt bưởi bang CO, siêu tới hạn.
Thời gian trích li là một trong những nhân t6 ảnh hưởng đến quá trình trích li Với một khoảng thời gian thích hợp, dung môi khuếch tán vào nguyên liệu và chất trích được khuếch tán vào lưu chất Tuy nhiên, khi trích li càng lâu, hàm lượng limonin trong mẫu thí nghiệm càng ít, do đó tốc độ trích li càng giảm, đồng thời, nếu tiếp tục kéo dài thời gian trích li thì hiệu quả trích li không cao nữa và sẽ lam tăng chi phí cho dung môi, chi phí vận hành thiết bị.
Như vậy, dịch chiết hạt bưởi thu được từ phương pháp trích li bang CO, siéu tới hạn có lượng limonin thu được cao nhất khi trích li ở 50°C, trong 60 phút, ở 25 MPa với đồng dung môi EtOH 30%.
3.1.2 Khảo sát quy trình chiết Soxhlet sử dụng dung môi ethyl acetate 3.1.2.1 Anh hưởng của thời gian trích li
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích li được trình bay ở Bảng 3.5 và phụ lục 5.
Bảng 3.5 Nông độ limonin theo thời gian Thời gian (gid) Nông độ limonin (ppm)
Thoi gian trich li phu thudc vao cac yếu tố: nguyên liệu, dung môi, nhiệt độ
Thời gian tiếp xúc của nguyên liệu và dung môi càng dài thì hàm lượng limonin thu được càng tăng Tuy nhiên, khi kéo dài thời gian đến một giới hạn nhất định thì lượng limonin thu được không tăng nữa.
Kết quả Bảng 3.5 cho thấy lượng limonin thu được có xu hướng tăng theo thời gian trích li Trong 5 giờ dau, lượng limonin tăng lên nhiều nhất do chênh lệch nông độ limonin bên trong nguyên liệu và dung môi Khi tăng thời gian chiết từ 5 giờ đến 7 giờ thì hàm lượng limonin thu được tăng dan Cụ thé nông độ limonin từ các mẫu thí nghiệm trích li ở 5, 6, 7 giờ thu được tương ứng là 71,27, 119,71, 145,16 ppm Tuy nhiên, khi mẫu được chưng cất ở 7 giờ và 8 giờ thì lượng limonin thu được hầu như không đáng kể Lượng limonin thu được cao nhất khi thời gian chiết là 7 giờ Sau thời gian nay, lượng limonin thu được thay đối không đáng kẻ.
Mặt khác, thời gian trích li kéo dai làm tiêu tốn năng lượng cho quá trình cấp nhiệt.
Vi vay, thời gian thích hợp dé trích li limonin bang phương pháp Soxhlet sử dụng dung môi ethyl acetate là 7 giờ.
3.1.2.2 Anh hưởng của tỷ lệ nguyên liéu/dung môi
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi được trình bày ở
Bảng 3.6 Nồng độ limonin theo tỷ lệ nguyên liệu:dung môi Ty lệ nguyên liệu:dung môi (g:mL) Nông độ limonin (ppm)
Với cùng nhiệt độ va thời gian trích li, khi ty lệ nguyên liệu/dung môi càng nhỏ, quá trình bay hơi ngưng tụ của dung môi nhanh, tăng sự tiếp xúc giữa dung môi và nguyên liệu, limonin khuếch tán vào dung môi càng nhiều, mẫu càng được chiết kiệt, lượng limonin thu được càng cao Bên cạnh đó, việc sử dụng nhiều dung môi sẽ làm tiêu tốn năng lượng cấp nhiệt Hình 3.6 cho thấy tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (g:mL) 1 : 05 là thích hợp cho quá trình chiết dé thu lượng limonin cao nhất.
Như vậy, dịch chiết hạt bưởi thu được bằng phương pháp Soxhlet với dung môi là ethyl acetate có lượng limonin thu được nhiều nhất khi tiến hành ở 90°C, trong 7 giờ với ty lệ nguyên liệu : dung môi là 1 : 05.
3.1.3 Chuẩn bị mẫu dịch chiết thí nghiệm - Dịch chiết 1: Dịch chiết bang CO, siêu tới hạn (DC1) Hạt bưởi > Say (50°C, 72 giò) > Nghién > Bột hạt.
Cân chính xác khoảng 10 g bột hat > Trích li bang CO, siêu tới han (50°C, EtOH 30%, 25 MPa, 60 phút) > Ly tâm > Pha phân cực > Dịch chiết 1.
- Dịch chiết 2: Dịch chiết bang Soxhlet với dung môi ethyl acetate (DC2) Hạt bưởi > Say (50°C, 72 giò) > Nghién > Bột hat.
Cân chính xác khoảng 10 g bột hạt > Chiết Soxhlet (loại béo bang n — hexane, 80°C, 7 giờ, nguyên liệu/dung môi : 1/10) > Chiết Soxhlet (ethyl acetate, 90°C, 7 giờ, nguyên liệu/dung môi : 1/05) > Cô quay > Cao chiết > Thêm 30 mL EtOH
Hai mẫu DC1 và DC2 được bảo quan trong điều kiện lạnh để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
3.2 Xác định hoạt tính khang vi sinh vật
3.2.1 Kết quả đo đường kính vòng kháng vì sinh vật
Kết quả đo đường kính vòng kháng vi sinh vat được thé hiện ở Bảng 3.7.
Bảng 3.7 Kết quả đo đường kính vòng kháng khuẩn Đường kính vòng kháng khuân (mm)
Ghi chú: Giá tri biêu diễn là trung bình của ba lân lặp lại + độ lệch chuan.
Sô liệu có chữ ở mũ giông nhau thì không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa œ < 0,05.
-” : không hình thành vòng kháng xung quanh đĩa giây.
KET LUAN VA KIEN NGHI
4.1 Kết luận Đề tài đã khảo sát một số yếu tô của điều kiện tách chiết có ảnh hưởng đến dịch chiết trích li bang CO, siêu tới hạn và chiết Soxhlet với dung môi ethyl acetate từ hạt bưởi Thanh Trà (Thừa Thiên Huế) Điều kiện trích li dịch chiết với ham lượng limonin cao theo phương pháp CO; siêu tới han ở 50°C, 25 MPa trong 60 phút với đồng dung môi EtOH 30% và theo phương pháp chiết Soxhlet với dung môi ethyl acetate ở 90°C, 7 giờ với tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:05.
Dé tài đã xác định khả năng kháng vi sinh vật của dịch chiết hạt bưởi đối với 6 chủng vi sinh vật gây hư hỏng và ngộ độc thực phẩm bao gồm Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Fusarium solani, Aspergillus flavus Kết qua cho thay dich chiết hạt bưởi được trích li bang CO; siêu tới hạn có khả năng kháng các chủng vi khuẩn nghiên cứu Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với chủng S aureus là 96 mg/mL; Bacillus cereus là 144 mg/mL, và 160 mg/mL đối với hai chủng S typhi và P aeruginosa Dịch chiết hạt bưởi được trích li bang ethyl acetate có khả năng kháng các chủng S aureus (MIC
128 mg/mL), và B cereus, S typhi và P aeruginosa với MIC > 192 mg/mL.
Trong hai giống vi nam được sử dung trong thí nghiệm là Fusarium solani va Aspergillus flavus thi chi có dịch chiết hạt bưởi được trích li bang CO, siêu tới hạn có hoạt tính khang Fusarium solani với nông độ ức chế tối thiểu lớn hơn 192 mg/mL Dịch chiết hạt bưởi được trích li bang CO; siêu tới hạn va ethyl acetate đều khong có hoạt tính khang Aspergillus flavus.
Dịch chiết hạt bưởi được trích li bang CO, siêu tới hạn va Soxhlet đều có hoạt tính kháng oxy hóa Giá trị [C59 của dịch chiết hạt bưởi bằng CO, siêu tới han và Soxhlet lần lượt là 45,34 và 7,55 mg/mL.
Dé tai này góp phần cung cấp thông tin về hoạt tính kháng vi khuẩn, kháng vi nam và hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt bưởi, làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn vé ứng dụng của hạt bưởi trong các lĩnh vực như bảo quản thực
42 phẩm, ứng dụng trong công nghệ dược phẩm va mỹ phẩm, góp phan nâng cao giá trị cho cây bưởi ở Việt Nam.
Khao sát hoạt tính khang vi sinh vat cua dịch chiết hạt bưởi trên nhiều chủng vi sinh vật đồng thời thử hoạt tính kháng oxy hóa theo các phương pháp khác nhau.
[1] M Sawamura “Citrus essential oils: Flavor and Fragrance,” John Wiley &
[2] Đỗ Tat Loi Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam Nhà xuất bản Y học 2006.
[3] P V Duệ Giáo trinh kỹ thuật trồng cây ăn qua Nhà xuất ban Hà Nội, 2005.
[4] S5 C Huang et ai, “Alkaloids and coumarins of Citrus grandis,”
[5] Y.Takemura et al., “Structure of acriginine-1, the first naturally occurring acridonolignoid from citrus plans,” Chemical and Pharmaceutical Bulletin, vol 41, no 2, pp 406 — 407, Feb 1993.
[6] T.S Wu “Baityumine-A and B, two acridone alkaloids from Citrus grandis,”
[7] T.S Wu “Alkaloids and coumarins of Citrus grandis,” Phytochemistry, vol.
[SE T S.Wu, et al., “Coumarin, Acridone alkaloids and a flavones from Citrus grandis,’ Phytochemistry 1998;21(6): 585-587 1998.
[9] I.Stewart “Identification of caffeine in citrus flowers and leaves,” Journal of Agriculture and Food Chemistry, vol 33, no 6, pp 1163 — 1165 1985.
[10] A.N Radhakrishnan et al., ““Nitrogenous constituents in plants free amino acids in leaves and leguminous seeds,” Journal of the Indian Institute of Science, vol 37, pp 178 — 194 1955.
[II] Y.Q Ma et ai, “Isolation and identification of water — soluble active principles in guangdong snake bite drug,” Chung Ts’ao Yao, vol 13, no 5, pp 193
[12] I Jantan et al., “Chemical composition of some Citrus oils from Malaysia,”
Journal of Essential Oil Research, vol 8, no 6, pp 627 — 632, 1996.
[13] L Shi, Y.Gotou and K.Shindo, “Synephrine contents and their seasonal variation in peel of Citrus plants.” Shoyakugaku Zasshi, vol 46, no 2, pp 150 —
[14] D J Wang “Studies on the constituents of the essential oil of four aromatic flowers,” K’o Hsueh Fa Chan Yueh K 'an, vol 7, pp 1036 — 1048 1979.
[15] U Palasiri “Priliminary studies on pectin of Citrus maxima,’ Journal of Pharmaceutical Association of Siam, vol 2, no 1, pp 18 — 24 1948.
[16] M Sawamura et al., “Seasonal changes of isoprenoid - related substances in Citrus peels,” Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, vol 33, no 8, pp 566 — 571.
[17] B M Feng et al., “Structure determination of the constituents from Citrus grandis Osbeck,” In China Journal of Chinese Meteria Medica, vol 26, no 11, pp 764 — 765 2001.
[18] H H El-Gohary et al., “ A study on the coumarin contents of Citrus grandis fruits growing in Egypt,” Zagazig Journal of Pharmaceutical Sciences, vol 3, no.
[19] B Feng and Y Pei “Study on the coumarins from Citrus grandis,” Shenyang Yaoke Daxue Xuebao, vol 17, no 4, pp 253 — 255 2000.
[20] K Ogawa etal., “Evaluation of auraptene content in Citrus grandis and their products,” Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 48, no 5, pp 1763 —
[21] M Mizuno et al., “Chemotaxonomy of the genus Citrus based on polymethoxyflavones,” Chemical and Pharmaceutical Bulletin, vol 39, no 4, pp.
[22] M Anis “Flavonoid pattern of leaves of some Citrus species and their hybrids,” Plant Biochemical Journal, vol 8, pp 56 — 60 1981.
[23] Y C Huo et al., “Determination and comparision of naringin and naringenin contents among water extracts of various processed Citrus grandis pericarpium,”
Chinese Pharmaceutical Journal, vol 50, no 3, pp 137 — 147 1998.
[24] X H Yang et al., “GC/MS analysis of the chemical constituents of pomelo peel volatile oil,” Wuhan Huagong Cueyuan Xuebao, vol 23, no 2, pp 13 — 15.
[25] Y H Zhou et ai, “GC/MS analytical of essential oil from pomelo peel obtained in rong country,” Guangxi Daxuel Xuebao, vol 29, no 1, pp 70 — 72.
[26] M Sawamura et ai, “Volatile constituents of several varieties of pommelos and characteristics among Citrus species,” Agricultural of Biological Chemistry , vol 55, no 10, pp 2571 — 2578 1991.
[27] A G.Vlisidis and K.I.Israilidis, “Analysis of essential oil fraction from Greek Citrus species,” Chemika Chronika, vol 60, no 3, pp 75 — 78 1998.
[28] N X Dung et al., “The essential oil of flowers of Citrus maxima (J Burman) Merrill from Vietnam,” Journal of Essential Oil Research, vol 3, pp 359 — 360, Sep 1991.
[29] Y H Taufiq-Yap and T H Peh, “Chemical variaility and some biological activities of leaf essential oil from five species of Malaysian Citrus,” Oriental Journal of Chemistry, vol 17, no 3, pp 387 — 390 2001.
[30] M Sawamura et al., “Seasonal changes of isoprenoid-related substances in Citrus peels,” Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, vol 33, no 8, pp 566 — 571.
[31] F Baomin and P.Yuehu, “Chemical constituents of peels of Citrus grandis,”
Shenyang Yaoke Daxue Xuebao, vol 17, no 5, pp 332 — 333 2000.
[32] Kundusen et al., “Evaluation of in vitro antioxidant activity of Citrus limetta and Citrus maxima on reactive oxygen and nitrogen species,” Pharmacologyonline, vol 3, pp S50 — 857 2010.
[33] Shivananda A et al., “Analgesic and anti-inflammatory activities of Citrus maxima (J.Burm) Merr in animal models,” Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, vol 4, no 2, pp 1800 — 1810 2013.
[34] Kundusen ef al., “Exploration of Anti-inflammatory potential of Citrus limetta Risso and Citrus maxima (J Burm.) Merr,” Pharmacologyonline, vol 1,pp 702 — 709 2011.
[35] Abdul Muneer Mt et al, “Evaluation of the anti-diabetic activity of ethanolic extract of Citrus maxima stem bark,” International Journal Of Pharmaceutical And Chemical Sciences, vol 3, no 3, pp 642 — 650 2014.
[36] A Oyedepot and S.O Babarinde, “Effects of shaddock (Citrus maxima) fruit juice on glucose tolerance and lipid profile in type-II diabetic rats,” Chemical
Science Transactions, vol 2, no 1, pp 19 — 24 2013.
[37] Vikram H Potdar and Swati J Kibile, “Evaluation of antidepressant - like effect of Citrus maxima leaves in animal models of depression,” Jranian Journal of Basic Medical Sciences, vol 14, no 5, pp 478 — 483 2011.
[38] Sriparna Kundusen “Antitumor activity of Citrus maxima (Burm.) Merr. leaves in ehrlich's ascites carcinoma cell-treated mice,” Jsrn Pharmacology Article Id: 138737 2011.
[39] Sriparna Kundusen et al., “Exploration of in vivo antioxidant potential of Citrus maxima leaves against paracetamol induced hepatotoxicity in rats,” Pelagia Research Library Der Pharmacia Sinica, vol 2, no 3, pp 156 — 163 2011.
[40] Mohammed Riaz Hasan Chowdhury et ai, “Supplementation of Citrus maxima peel powder prevented oxidative stress, fibrosis, and hepatic damage in carbon tetrachloride (CCl4) treated rats,” Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Article Id: 598179 pp 1 — 100 2015.
[41] S Barrion et al., “Phytochemical composition, antioxidant and antibacterial properties of pummelo (Citrus maxima (Burm.)) Merr against Escherichia coli and Salmonella typhimurium,” Food and Nutrition Sciences, vol 5, pp 749 — 758.
[42] G Oboh et al., “Hypocholesterolemic properties of grapefruit (Citrus paradisii) and Shaddock (Citrus maxima) Juices and Inhibition of Angiotensin-1- Converting Enzyme Activity,” Journal of Food and Drug Analysis, vol 22, pp.
[43] V C Hậu, 7rồng cdy ăn qua ở Việt Nam, 1999.
[45] S Hasegawa, et al., “Limonoids in citrus seeds: origin and relative concentration”, Journal of Agriculture and Food Chemistry, vol 28, no 5, pp 922
[46] R Rouseff and S Nagy, “Distribution of limonoids in Citrus seeds,”
[47] H Ohta and S Hasegawa, “Limonoids in Pummelos [Citrus grandis (L.) Osbeck],” Journal of Food Science, vol 60, no 6, pp 1284 — 1285, Nov 1995.
[48] R.L Rouseff and S Nagy “Distribution of limonoids in citrus seeds, ” Phytochemistry, vol 2l, no 1, pp 85 — 90 1982.
[49] F Hashinaga and S Hasegawa S “Limonoids in seeds of sudachi (Citrus sudachi Hort ex Shirai),” Journal of Japanese Society for Horticultural Science, vol 58, no O1, pp 227 — 229 2007.
[50] F Hashinaga et al., “Limonoids in seeds of Yuzu (Citrus junos Sieb Ex Tanaka),” Nippon Shokuhin Kogyo Kakkaishi, vol 37, no 5, pp 380 — 382 2011.
[51] Y Ozaki et ai, “Limonoid glucosides in citrus seeds,” Agricultural and Biological Chemistry, vol 55, no 01, pp 137 — 141 2014.
[52] A Virkam et al., “Simultaneous determination of Citrus limonoid aglycones and glucosides by high performance liquid chromatography”, Analytica Chimica Acta, vol 590, no 2, pp 180 — 186, May 2007.
[53] P Zhao et al., “Chemical and biological comparison of the fruit extracts of Citrus wilsoniit Tanaka and Citrus medica L.,’ Food Chemistry, vol 173, pp 54 — 56, Apr 2015.
[S54] E Balestrieri et al., “Antiviral activity of seed extract from Citrus bergamia towards human retroviruses,” Bioorganic and Medicinal Chemistry, vol 19, no 6, pp 2084 — 2089, Mar 2011.
[55] J S Yoon et al., “Limonoids from Dictamnus dasycarpus Protect AgainstGlutamate-induced Toxicity in Primary Cultured Rat Cortical Cells,’ Journal ofMolecular Neuroscience, vol 42, no 1, pp 9 — 16, Sep 2010
[56] M.K.N Chidambara et al., “Citrus limonin and Its Glucoside Inhibit Colon denocarcinoma Cell Proliferation through Apoptosis,” Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 59, no 6, pp 2314 — 2323 2011.
[57] H Ohta and S Hasegawa, “Limonoids in pummelos (Citrus grandis Osbeck.),” Journal of Food Science, vol 60, no 6, pp 1284 — 1285, Nov 1995.
[58] L K Lam et al., “Effects of Citrus limonoids on glutathione S-transferase activity in mice,” Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 37, no 4, pp.
[S59] E G Miller, A P Gonzales-Sanders, A.M.Couvilon, J.M.Wnight, and S.H.A.
[60] L Lam, J Zhang, S Hasegawa, and H Schut, “Food Phytochemicals for Cancer Prevention I Fruits and Vegetables,” American Chemical Society:
[61] T Tanaka et al., “Citrus limonoids obacunone and limonin inhibit the development of a precursor lesion, aberrant crypt foci, for colon cancer in rats,”
ACS Symposium Series, vol 758, pp 145 — 163, Jul 2000.
[62] Y B Liu et al., “Effects and modes of action of Citrus limonoids against leptinotarsa decemlineata,” Physiological Entomology, vol 15, no 1, pp 37 — 45, Mar 1990.
[63] N K P Phung, Phuong pháp cô lập hop chất hữu cơ, 2007.
[64] H Ohta et al., “Thin-layer and high-performance liquid chromatographic analyses of limonoids and limonoid glucosides in Citrus seeds,” Journal of Chromatography A, vol 639, no 2, pp 295 — 302, Jun 1993.
[65] J.R Patil et al., “Characterization of Citrus aurantifolia bioactive compounds and their inhibition of human pancreatic cancer cells through apoptosis,”
Microchemical Journal, vol 94, no 2, pp 108 — 117, Mar 2010.
[66] King and Bott, Extraction of Natural products using near critical solvents, Blackie Academic Profesional 1993
[67] M Mukhopadhyay, Natural Extracts Using Supercritical Carbon Dioxide,CRC Press 2000.
[68] G Brunner, Gas Extraction, Physical Chemistry 1994.
[69] R Cannel, Natural products isolation, Humana Press Inc 1998.
[70] P Vitzthum, “Fluid extraction of hop, spices, and tabaco with supecritical gases’ Chem Int, vol 17, no 10, pp 710 — 715, Oct 1978.
[71] M Masatsugu et al., “Preparation of (-)-guaia-1(10),11-dien-15 ,2-olide and (- )-2a-hydrox y-guaia-1(10),1 1-dien-15-oic acid, fragrant sesquiterpenes inagarwood (Aquilaria agallocha Roxb.),” Tetrahedron Letters, vol 48, no 47, pp 10265 — 10276, Nov 1992.
[72] J Yu et al., “Supercritical fluid extraction of limonoids and naringin from grapefruit (Citrus paradisi Macf.) seeds,” Food Chemistry, vol 105, no 3, pp 1026
[73] L N Thach, Tinh dau, Nhà xuất ban Dai hoc Quốc Gia Thanh phố Hồ Chí
[74] J Kuldiloke “Effect of ultrasound, temperature and pressure treatments on enzyme activity and quality indicators of fruit and vegetable juices,” Berlin 2002. agarwood (Aquilaria agallocha Roxb.),” Tetrahedron Letters 1992.
[75] L H Chính, Vi sinh vat y học, Nha xuat ban Y hoc, 2007.
[76] T L Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm va mỹ phẩm Nhà xuất bản Giáo dục, 2005.
[77] N D Nga, Ký sinh tràng, Nha xuat ban Gido duc Viét Nam, 2009.
[78] Viện Dược liệu - Bộ Y tế, Phương pháp nghiên cứu tac dung được lý của thuốc từ được thảo, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật 2006.
[79] A Prakash et al., “Antioxidant activity,” Analytical progress Medallion Laboratories 2000.
[80] K K Mandadi et al., “Red Mexican Grapefruit: A Novel Source for Bioactive Limonoids and their Antioxidant Activity,” Zeitschrift fur Naturforschung, vol 62, no 3, pp 179 — 188, Mar 2007.
[Sl] J Yu et al., “Antioxidant Activity of Citrus Limonoids, Flavonoids, andCoumarins,” Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 53, no 6, pp 2009 —2014, Mar 2005.
[82] S Kim and K Shin “Evaluation of physiological activities of the Citron (Citrus junos Sieb ex Tanaka) seed extracts,” Preventive Nutrition and Food Science, vol 18, no 3, pp 196 — 202, Sep 2013
[83] H Li et al., “Evaluation of two methods for the extraction of antioxidants from medicinal plants,” Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol 388, no 2, pp 483
[84] L Prior and G Cao, “In vivo total antioxidant capacity: comparison of different analytical methods,” Free Radical Biology and Medicine, vol 27, no 11, pp 1173 — 1181, Dec 1999.
[85] CW Mulholland and JJ Strain, “Total radical-trapping antioxidant potential (TRAP) of plasma: effects of supplementation of young healthy volunteers with large doses of alpha-tocopherol and ascorbic acid,” International Journal for Vitamin and Nutrition Research, vol 63, no 1, pp 27 — 30 1993.
[86] M Hossain et al., “Investigation of total phenolic content and antioxidant activities of Azadirachta indica roots,” Avicenna Journal of Phytomedicine, vol 4, no 2, pp 97 — 102, Mar 2014.
[87] Z Cvetnic et al., “Antimicrobial activity of grapefruit seed and pulp ethanolic extract,” Acta Pharm, vol 54, no 3, pp 243 — 250, Sep 2004.
[88] L Giamperi et al., “Antioxidant activity of Citrus paradisi seeds glyceric extract,” Fitoterapia, vol 75, no 2, pp 221 — 224, Mar 2004.
[89] H Ueno et al., “Supercritical Carbon Dioxide Extraction of Valuable Compounds from Citrus junos Seed,” Food Bioprocess Technology, vol 1, no 4, pp 357 — 363, Dec 2008.
[90] F Anwar et al., “Physico — chemical characteristics of Citrus seeds and seed oils from Pakistan,” Journal of the American Oil Chemists' Society, vol 85, no 4, pp 321 — 330, Apr 2008.
[91] Priyanka Singh et al., “Chemical profile, antifungal, antiaflatoxigenic and antioxidant activity of Citrus maxima Burm and Citrus sinensis (L.) Osbeck essential oils and their cyclic monoterpene, DL-limonene,” Food and ChemicalToxicology, vol 48, no 6, pp 1734 — 1740, Jun 2010.
[92] U Rashid et al., “Biodiesel from Citrus reticulata (mandarin orange) seed oil, a potential non-food feedstoc,” Industrial Crops and Products, vol 45, pp 355 — 359, Feb 2013.
[93] N V Lợi và cộng sự., “Nghiên cứu thành phan hoa hoc va hoat tinh sinh hoc của tinh dau lá bưởi, cam va chanh,” 7% ap chí Khoa học va Công nghệ, vol 52, pp |
[94] K.C Chilaka et al., “Evaluation of the effects of Citrus sinensis seed oil on blood glucose, lipid profile and liver enzymes in rats injected with alloxan monohydrate,” Journal of Acute Disease, vol 4, no 2, pp 129 — 134, Jun 2015.
[95] N T Lan Phi và cộng sự., “Khảo sat ham lượng phenolic tong va hoat tinh chéng oxi hóa của dau hat Citrus,” T ap chí Khoa học Giáo duc Kỹ thuật, vol 31.
[96] N T Hoang Lan va cộng sự., “ Kha nang khang khuẩn của tinh dau tia tô,”
Tap chi Khoa hoc va Phat trién, vol 13, no 2, pp 245 — 250 2015.
[97] N T Lan Phi et al., “Impact of growth locations and genotypes on antioxidant and antimicrobial activities of Citrus essential oils in Vietnam,” Journal Of Essential Oil Bearing Plants, vol 18, no 6, pp 1421 — 1432, Nov 2015.
[98] R Hsu et al., “The study of supercritical carbon dioxide extraction of Ganoderma lucidum,” Industrial & Engineering Chemistry Research, vol 40, no.
[99] Y Fu et al., “Breaking the spores of fungus Ganoderma lucidum by supercritical CO2,” Food Chemistry, vol 112, no 1, pp 71 — 76, Jan 2009.
[100] A C Kumoro and M Hasan, “Extraction of Sarawak Black Pepper Essential Oil using Supercritical Carbon,” Arabian Journal for Science & Engineering, vol.
[101] S Burt “Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods — A Review,” International Journal of Food Microbiology,vol 94, no 3, pp 223 — 253, Aug 2004.
[102] J Sikkema et al., “Interactions of cyclic hydrocarbons with biological membranes,” The Journal of Biotechnical Chemistry, vol 269, no 11, pp 8022 — 8028, Mar 1994.
[103] P Yap et al., “Essential oils, A new horizon in combating bacterial antibiotic resistance,” The Open Microbiology Journal, vol 8, pp 6 — 14 2014.
[104] S Chanda et al., Fruit and vegetable peels — Strong natural source of antimicrobics 2010.
[105] L Tavares et al., “Limonin Derivatives: Synthesis Using Methodology in Solution and Heterogeneous Medium and Evaluation of the Antimicrobial Activity,” Journal of the American Chemical Society, vol 27, no 01, pp 161 — 178.
[106] Subal Debnath et al., “Antimicrobial screening of various fruit seed extracts,”
Pharmacognosy Journal, vol 3, no 19, pp 83 — 86, Jan, 2011.
[107] Zhou et al., “Effects of extraction solvent on wheat bran antioxidant activity estimation,” Food Science and Technology, vol 37, no 7, pp 717 — 721, Nov, 2004.
[108] J Yu et al., “Antioxidant activity of Citrus limonoids, flavonoids, and coumarins,” Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 53, no 6, pp 2009 — 2014, Mar 2005.
[109] Valavanidis et al., “Comparison of the radical scavenging potential of polar and lipidic fractions of Olive oil and other vegaetable oils under normal conditions and after thermal treatment,” Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 52,no 8, pp 2358 — 2365, Apr 2004.
PHU LUC 1: PHO HPLC HAM LUONG LIMMONIN TRONG DỊCH CHIET TRICH LI BANG CO, SIEU TOI HAN DE KHAO SAT NHIET DO mAU |
RetTime Type Area Amt /Area Amount Grp Name
Hình 4.1 Mẫu khảo sát trích li bang CO, siêu tới hạn ở 40 °C mAU | J đới
siêu tới hạn sử dụng 30% EtOH
Ret Time Type Area Amt /Area Amount Grp Name [min] [mAU*s] [ppm]
SS (SSS Se Se SS SS SSS SSS 20.465 BB 829.79730 1.45292e-1 120.56275 Limonin
Hình 4.6 Mẫu khảo sát trích li bang CO, siêu tới han sử dụng 40% EtOH
PHU LUC 3: PHO HPLC HAM LƯỢNG LIMMONIN TRONG DỊCH CHIET TRICH LI BANG CO, SIEU TOI HAN DE KHAO SAT AP SUAT mAU 4 cụ
RetTime Type Area Amt/Area Amount Grp Name
Hình 4.7 Mau khảo sat trích li băng CO, siêu tới hạn tai 15 MPa mAU `]
Hinh 4.8 Mau khao sat trich li bang CO, siêu tới han tai 20 MPa
Area Amt/Area Amount Grp Name [mAU*s] [ppm]
Hinh 4.9 Mau khao sat trich li bang CO, siéu toi han tai 25 MPa
PHU LUC 4: PHO HPLC HAM LƯỢNG LIMMONIN TRONG DỊCH CHIẾT TRICH LI BANG CO, SIEU TOI HAN DE KHAO SAT THOI GIAN mAU J ae
7 yg wr, f\ o = = 1 sen ơ LấN ẹ ẹ J \ 0——— MỊ —+ alr omar a Wy — b5 ————>—+_ T——————— 5————
-20 as T LV LE DJ Ì A ' lạ r T + Mã Ỷ : T We a "5 L I Us TT 7 1ứ i lu HU T T T * | ee T
RetTime Type Area Amt/Area Amount Grp Name
~— = Ee | St OIE X⁄x S——=—