Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa một số cây thuốc an giang và nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy hóa của tetrastigma erubescens planch và nauclea orientalis

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHAN THỊ ANH ĐÀO

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,

HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH VÀ NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2015

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHAN THỊ ANH ĐÀO

SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,

HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH VÀ NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L

Chuyên ngành: Hóa Phân Tích

Mã số chuyên ngành: 62 44 01 18

Phản biện 1: TS Tôn Thất Quang

Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương Phản biện 3: TS Mai Đình Trị

Phản biện độc lập 1: PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ Phản biện độc lập 2: PGS.TS Trần Khắc Vũ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1.PGS.TS Nguyễn Thị Thanh Mai 2 PGS.TS Trần Lê Quan

TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2015

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn đến:

PGS.TS Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS TS Trần Lê Quan, người đã tận

tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu Cô Thầy luôn động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

PGS.TS Nguyễn Trung Nhân và các Quý Thầy Cô trong Bộ môn Hóa Phân Tích đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành các môn học phần bổ sung

Thạc sỹ Nguyễn Xuân Hải và các bạn cùng phòng thí nghiệm đã luôn chia sẻ

những kinh nghiệm cũng như tạo cho tôi những giây phút vui vẻ giữa những tháng ngày miệt mài với công việc

TS Trương Thị Huỳnh Hoa cùng các kỹ thuật viên phòng máy NMR và

HPLC-MS thuộc phòng thí nghiệm Phân tích Trung tâm-ĐH Khoa học Tự nhiên- ĐH Quốc gia TP HCM

PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương cùng các anh chị thuộc Trung tâm Sâm và

Dược liệu TP HCM- ĐH Y Dược TP HCM

Phòng Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều

kiện thuận lợi giúp tôi giải quyết các thủ tục hành chính

Ban Giám hiệu và Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm-

Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện về

thời gian, cũng như các đồng nghiệp đã gánh vác công việc, hỗ trợ tôi trong thời

gian tôi đi học

Con xin cám ơn Ba Mẹ và Bố Mẹ đã hỗ trợ, động viên con yên tâm hoàn thành việc học Cảm ơn Anh và hai Con đã cho em một gia đình êm ấm để em vững tin

tiếp tục học tập và công tác

Trang 4

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận án Tiến sĩ Hóa học “Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa một số cây thuốc An giang và nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy hóa, bảo vệ gan của Tetrastigma erubescens Planch và Nauclea orientalis (L.) L.” là do

tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS.TS Trần Lê Quan Những kết quả nghiên cứu trong luận án này chưa được các tác giả khác công bố ở Việt Nam cũng như trên thế giới Điều này đã được kiểm tra bằng

cách tra cứu tài liệu tham khảo cung cấp bởi phần mềm SciFinder

Tôi xin cam đoan danh dự về công trình khoa học này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 09 năm 2015 Tác giả luận án

Phan Thị Anh Đào

Trang 5

1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể 3

1.1.3 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể 7

1.1.4 Khái niệm về chất kháng oxy hóa 10

1.1.5 Phân loại 11

1.1.6 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa 16

1.2 TỒNG QUAN VỀ CÁC CÂY THUỐC SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 20

1.3 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH 21

1.3.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Tetrastigma erubescens Planch. 21

1.3.2 Nghiên cứu về dược học của cây T.erubescens 22

1.3.3 Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây T.erubescens 23

1.3.4 Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tetrastigma 24

1.4 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L 28

1.4.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Nauclea orientalis (L.) L 28

1.4.2 Nghiên cứu dược học của cây N orientalis 30

1.4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây N orientalis 31

1.4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Nauclea 34

1.5 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU 39

Trang 6

2.2.2 Điều chế các mẫu cao methanol 51

2.2.3 Trích ly và phân lập các hợp chất từ thân cây T.erubescens 51

2.2.4 Trích ly và phân lập các hợp chất từ thân cây N.orientalis 55

2.3 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC 59

2.3.1 Nguyên tắc 59

2.3.2 Chuẩn bị mẫu 59

2.3.3 Điều kiện chạy HPLC 59

2.3.4 Điều kiện chạy MS 60

2.4.2 Khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid 63

2.4.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan trên chuột nhắt bị suy giảm hệ miễn dịch bằng cyclophosphamide (mô hình in vivo) 65

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 67

3.1 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 67

3.1.1 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 67

3.1.2 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid 70

3.1.3 Bàn luận kết quả nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa 71

Trang 7

3.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY

T.ERUBESCENS VÀ THÂN CÂY N.ORIENTALIS 73

3.2.1 Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của thân cây T erubescens 73

3.2.2 Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của thân cây N orientalis 74

3.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH 75

3.3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất phenol đơn vòng 75

3.3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất stilbene 86

3.3.3 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất flavonoid 93

3.3.4 Khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất benzopyranoid 112

3.3.5 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất lignan 116

3.3.6 Khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất steroid 119

3.3.7 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất norisoprenoid 130

3.4 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY NUCLEA ORIENTALIS (L.) L 133

3.4.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất phenol đơn vòng 134

3.4.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất benzopyranoid 138

3.4.3 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất triterpenoid 147

3.4.4 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất monoterpenoid 157

3.4.5 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất anthraquinone 170

3.4.6 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất lignan 172

3.5 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC 174

3.6 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 175

3.6.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 175

3.6.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid 181

3.6.3 Kết quả nghiên cứu trên mô hình gây suy giảm miễn dịch ở chuột nhắt bằng cyclophosphamide (mô hình in vivo) 183

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 187 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

Trang 8

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AO (AH) : Antioxidant (chất kháng oxy hóa) Asc : Ascorbic acid (vitamin C)

BHA : Butylated hydroxyanisole d : Doublet (mũi đôi)

DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide

DNA : Acid deoxyribonucleic DPPH : 2,2-diphenylpicrylhydrazyl EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

ET : Electron transfer methods GSH : Glutathione

HAT : Hydrogen atom transfer methods HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation

HR-ESI-MS : High resolution electro spray ionization mass spectroscopy HSQC : Heteronuclear single quantum coherence

IC50 : Nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50 % gốc tự do

J : Hằng số ghép m : Multiplet (mũi đa) MDA : Malonyldialdehyde

NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

NMR : Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) NOS : Nitrogen oxygen species

NP : Nomal phase (pha thường) PBS : Phosphate buffered saline

PG : Propyl gallate Pr : Protein

Trang 9

PTLC : Preparative thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng điều chế) quin : quintet (mũi năm)

RNS : Reactive nitrogen species ROS : Reactive oxygen species s : Singlet (mũi đơn)

SEM : Standard error of the mean (sai số chuẩn của giá trị trung bình) SKC : Sắc ký cột

TBA : Acid thiobarbituric TBHQ : tert-Butylhydroquinone

TCA : Acid Trichloroacetic

TLC : Thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng)

Trolox : Acid 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic UV : Ultraviolet (tử ngoại)

XO : Xanthine oxidase YHCT : Y học cổ truyền

Trang 10

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Một số chất kháng oxy hóa tổng hợp 12

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của acid L-ascorbic và acid dehydro ascorbic 14

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của vitamin E 14

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của β-carotene 15

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của taurine và hypotaurine 15

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của acid α-lipoic 15

Hình 1.7 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 17

Hình 1.8 Phản ứng tạo phức giữa malonyldialdehyde và acid thiobarbituric 19

Hình 1.9 Ảnh minh họa cây và quả của T erubescens 21

Hình 1.10 Cấu trúc các hợp chất béo phân lập từ chi Tetrastigma 25

Hình 1.11 Cấu trúc các hợp chất steroid phân lập từ chi Tetrastigma 25

Hình 1.13 Cấu trúc các hợp chất phenol phân lập từ chi Tetrastigma 26

Hình 1.14 Cấu trúc các hợp chất flavonoid phân lập từ chi Tetrastigma 27

Hình 1.15 Cấu trúc hợp chất trans-reveratrol phân lập từ chi Tetrastigma 27

Hình 1.16 Cấu trúc các hợp chất chứa nitrogen phân lập từ chi Tetrastigma 28

Hình 1.17 Cấu trúc một số hợp chất khác phân lập từ chi Tetrastigma 28

Hình 1.18 Ảnh minh họa cây, hoa và lá của N orientalis 29

Hình 1.19 Cấu trúc một số hợp chất alkaloid phân lập từ cây N orientalis 33

Hình 1.20 Cấu trúc một số hợp chất steroid và chất béo phân lập từ cây N orientalis33 Hình 1.21 Cấu trúc một số hợp chất terpenoid phân lập từ cây N orientalis 34

Hình 1.22 Cấu trúc một số hợp chất polyphenol phân lập từ cây N orientalis 34

Hình 1.24 Cấu trúc một số hợp chất steroid, terpenoid phân lập từ chi Nauclea 38

Hình 1.25 Cấu trúc một số hợp chất polyphenol phân lập từ chi Nauclea 39

Hình 3.1 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-2 77

Hình 3.3 Tương quan HMBC của hợp chất DR-5 81

Hình 3.4 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-9 85

Hình 3.7 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-12 92

Trang 11

Hình 3.8 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-13 94

Hình 3.9 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-14 96

Hình 3.14a Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần thứ nhất của hợp chất DR-20 109

Hình 3.14b Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần thứ hai của hợp chất DR-20 110

Hình 3.14c Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-20 110

Hình 3.24 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-5 135

Hình 3.25 Tương quan HMBC trong hợp chất GV-6 137

Trang 12

Hình 3.38a Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần aglycone của hợp chất GV-21 167

Hình 3.38b Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần đường của hợp chất GV-21 168

Hình 3.38c Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-21 169

Hình 3.38d Tương quan NOESY trong hợp chất GV-21 169

Hình 3.41 Tổng kết các hợp chất phenolic đơn vòng có hoạt tính kháng oxy hóa

178

Hình 3.42 Tổng kết các hợp chất benzopyranoid có hoạt tính kháng oxy hóa 179

Hình 3.43 Tổng kết các hợp chất stilbene có hoạt tính kháng oxy hóa 179

Hình 3.44 Tổng kết các hợp chất flavonoid có hoạt tính kháng oxy hóa 180

Hình 4.1 Cấu trúc của 30 chất phân lập từ thân cây T erusbescens 189

Hình 4.2 Cấu trúc của 23 chất phân lập từ thân cây N orientalis 190

Trang 13

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Các dạng hoạt động của nitrogen 2

Bảng 1.2 Các dạng hoạt động của oxygen 2

Bảng 1.3 Các chất được phân lập từ các cây thuộc chi Tetrastigma 24

Bảng 1.4 Các hợp chất được phân lập từ các cây N orientalis 31

Bảng 1.5 Các hợp chất phân lập từ chi Nauclea 35

Bảng 2.1 Danh mục, tiêu chí lựa chọn, độ ẩm nguyên liệu và thu suất điều chế cao chiết methanol củacác cây thuốc nghiên cứu sàng lọc 45

Bảng 2.2 Khối lượng và thu suất các loại cao từ thân cây T.erubescens 51

Bảng 2.3 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây T erubescens 53

Bảng 2.4 Khối lượng và thu suất các loại cao từ thân cây N.orientalis 55

Bảng 2.5 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây N orientalis 57

Bảng 2.6 Chương trình gradient pha động 59

Bảng 2.7 Khối lượng các mảnh ion phân tử được phân tách trên cột C18 60

Bảng 2.8 Điều kiện chạy MS 60

Bảng 2.9 Dữ liệu đường chuẩn của các hợp chất cần định lượng 61

Bảng 2.10 Đường chuẩn của các hợp chất 61

Bảng 3.4 Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của chất đối chứng dương, trolox thử nghiệm bằng phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid 70

Bảng 3.5 Thu suất, phần trăm ức chế và giá trị IC50 của tám mẫu cao thử nghiệm bằng phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid 71

Bảng 3.6 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn trích ly từ thân cây T erubescens 73

Trang 14

Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các phân đoạn từ cao

ethyl acetate của thân cây T erubescens 73

Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn từ thân cây N orientalis 74

Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các phân đoạn từ cao ethyl acetate của thân cây N orientalis 75

Bảng 3.10 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-1 so sánh với acid 4-hydroxybenzoic 76 Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-2 so sánh với methyl 4-hydroxybenzoate 77

Bảng 3.12 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-3 so sánh với acid protocatechuic 78

Bảng 3.13 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-4 so sánh với methyl protocatechuate80 Bảng 3.14 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-5 so sánh với acid vanillic 81

Bảng 3.15 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-6 so sánh với acid gallic 82

Bảng 3.16 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-7 so sánh với methyl gallate 83

Bảng 3.17 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-8 so sánh với catechol 84

Bảng 3.18 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-9 so sánh với của mallonanoside B 86

Bảng 3.19 Số liệu phổ của hợp chất DR-10 so sánh với (E)-resveratrol 88

Bảng 3.20 Số liệu phổ của hợp chất DR-11 so sánh với (E) 2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside 90

Bảng 3.21 Số liệu phổ của hợp chất DR-12 so sánh với trans-polydatin 92

Bảng 3.22 Số liệu phổ của hợp chất DR-13 so sánh với 6-demethoxytangeretin 94

Bảng 3.23 Số liệu phổ của hợp chất DR-14 so sánh với tangeretin 96

Bảng 3.24 Số liệu phổ của hợp chất DR-15 so sánh với 6-demethoxynobiletin 98

Bảng 3.25 Số liệu phổ của hợp chất DR-16 so sánh với nobiletin 100

Bảng 3.26 Số liệu phổ của hợp chất DR-17 so sánh với catechin và epicatechin 102

Bảng 3.27 Số liệu phổ của hợp chất DR-18 so sánh với (-)-epigallocatechin-3-O-gallate 104

Bảng 3.28 Số liệu phổ của hợp chất DR-19 so sánh với phlorizin 107

Bảng 3.29 Số liệu phổ của hợp chất DR-20 so sánh với phổ tham khảo 111

Bảng 3.30 Số liệu phổ của hợp chất DR-21 so sánh với bergenin 113

Bảng 3.31 Số liệu phổ của hợp chất DR-22 so sánh với 4-O-galloylbergenin 115