ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
PHAN THỊ ANH ĐÀO
SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH VÀ NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2015
Trang 2ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
PHAN THỊ ANH ĐÀO
SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH VÀ NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L
Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
Mã số chuyên ngành: 62 44 01 18
Phản biện 1: TS Tôn Thất Quang
Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương Phản biện 3: TS Mai Đình Trị
Phản biện độc lập 1: PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ Phản biện độc lập 2: PGS.TS Trần Khắc Vũ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1.PGS.TS Nguyễn Thị Thanh Mai 2 PGS.TS Trần Lê Quan
TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2015
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn đến:
PGS.TS Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS TS Trần Lê Quan, người đã tận
tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu Cô Thầy luôn động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu
PGS.TS Nguyễn Trung Nhân và các Quý Thầy Cô trong Bộ môn Hóa Phân Tích đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành các môn học phần bổ sung
Thạc sỹ Nguyễn Xuân Hải và các bạn cùng phòng thí nghiệm đã luôn chia sẻ
những kinh nghiệm cũng như tạo cho tôi những giây phút vui vẻ giữa những tháng ngày miệt mài với công việc
TS Trương Thị Huỳnh Hoa cùng các kỹ thuật viên phòng máy NMR và
HPLC-MS thuộc phòng thí nghiệm Phân tích Trung tâm-ĐH Khoa học Tự nhiên- ĐH Quốc gia TP HCM
PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương cùng các anh chị thuộc Trung tâm Sâm và
Dược liệu TP HCM- ĐH Y Dược TP HCM
Phòng Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều
kiện thuận lợi giúp tôi giải quyết các thủ tục hành chính
Ban Giám hiệu và Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm-
Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện về
thời gian, cũng như các đồng nghiệp đã gánh vác công việc, hỗ trợ tôi trong thời
gian tôi đi học
Con xin cám ơn Ba Mẹ và Bố Mẹ đã hỗ trợ, động viên con yên tâm hoàn thành việc học Cảm ơn Anh và hai Con đã cho em một gia đình êm ấm để em vững tin
tiếp tục học tập và công tác
Trang 4LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan luận án Tiến sĩ Hóa học “Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa một số cây thuốc An giang và nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy hóa, bảo vệ gan của Tetrastigma erubescens Planch và Nauclea orientalis (L.) L.” là do
tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS.TS Trần Lê Quan Những kết quả nghiên cứu trong luận án này chưa được các tác giả khác công bố ở Việt Nam cũng như trên thế giới Điều này đã được kiểm tra bằng
cách tra cứu tài liệu tham khảo cung cấp bởi phần mềm SciFinder
Tôi xin cam đoan danh dự về công trình khoa học này
Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 09 năm 2015 Tác giả luận án
Phan Thị Anh Đào
Trang 51.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể 3
1.1.3 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể 7
1.1.4 Khái niệm về chất kháng oxy hóa 10
1.1.5 Phân loại 11
1.1.6 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa 16
1.2 TỒNG QUAN VỀ CÁC CÂY THUỐC SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 20
1.3 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH 21
1.3.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Tetrastigma erubescens Planch. 21
1.3.2 Nghiên cứu về dược học của cây T.erubescens 22
1.3.3 Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây T.erubescens 23
1.3.4 Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tetrastigma 24
1.4 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC NAUCLEA ORIENTALIS (L.) L 28
1.4.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Nauclea orientalis (L.) L 28
1.4.2 Nghiên cứu dược học của cây N orientalis 30
1.4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây N orientalis 31
1.4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Nauclea 34
1.5 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU 39
Trang 62.2.2 Điều chế các mẫu cao methanol 51
2.2.3 Trích ly và phân lập các hợp chất từ thân cây T.erubescens 51
2.2.4 Trích ly và phân lập các hợp chất từ thân cây N.orientalis 55
2.3 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC 59
2.3.1 Nguyên tắc 59
2.3.2 Chuẩn bị mẫu 59
2.3.3 Điều kiện chạy HPLC 59
2.3.4 Điều kiện chạy MS 60
2.4.2 Khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid 63
2.4.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan trên chuột nhắt bị suy giảm hệ miễn dịch bằng cyclophosphamide (mô hình in vivo) 65
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 67
3.1 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 67
3.1.1 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 67
3.1.2 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid 70
3.1.3 Bàn luận kết quả nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa 71
Trang 73.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA THÂN CÂY
T.ERUBESCENS VÀ THÂN CÂY N.ORIENTALIS 73
3.2.1 Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của thân cây T erubescens 73
3.2.2 Kết quả thử hoạt tính trên các mẫu cao của thân cây N orientalis 74
3.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY TETRASTIGMA ERUBESCENS PLANCH 75
3.3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất phenol đơn vòng 75
3.3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất stilbene 86
3.3.3 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất flavonoid 93
3.3.4 Khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất benzopyranoid 112
3.3.5 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất lignan 116
3.3.6 Khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất steroid 119
3.3.7 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất norisoprenoid 130
3.4 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY NUCLEA ORIENTALIS (L.) L 133
3.4.1 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất phenol đơn vòng 134
3.4.2 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất benzopyranoid 138
3.4.3 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất triterpenoid 147
3.4.4 Khảo sát cấu trúc hóa học các hợp chất monoterpenoid 157
3.4.5 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất anthraquinone 170
3.4.6 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất lignan 172
3.5 ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC 174
3.6 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 175
3.6.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 175
3.6.2 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid 181
3.6.3 Kết quả nghiên cứu trên mô hình gây suy giảm miễn dịch ở chuột nhắt bằng cyclophosphamide (mô hình in vivo) 183
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 187 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
Trang 8DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AO (AH) : Antioxidant (chất kháng oxy hóa) Asc : Ascorbic acid (vitamin C)
BHA : Butylated hydroxyanisole d : Doublet (mũi đôi)
DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer DMSO : Dimethyl sulfoxide
DNA : Acid deoxyribonucleic DPPH : 2,2-diphenylpicrylhydrazyl EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid
ET : Electron transfer methods GSH : Glutathione
HAT : Hydrogen atom transfer methods HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation
HR-ESI-MS : High resolution electro spray ionization mass spectroscopy HSQC : Heteronuclear single quantum coherence
IC50 : Nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50 % gốc tự do
J : Hằng số ghép m : Multiplet (mũi đa) MDA : Malonyldialdehyde
NADPH : Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NMR : Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân) NOS : Nitrogen oxygen species
NP : Nomal phase (pha thường) PBS : Phosphate buffered saline
PG : Propyl gallate Pr : Protein
Trang 9PTLC : Preparative thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng điều chế) quin : quintet (mũi năm)
RNS : Reactive nitrogen species ROS : Reactive oxygen species s : Singlet (mũi đơn)
SEM : Standard error of the mean (sai số chuẩn của giá trị trung bình) SKC : Sắc ký cột
TBA : Acid thiobarbituric TBHQ : tert-Butylhydroquinone
TCA : Acid Trichloroacetic
TLC : Thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng)
Trolox : Acid 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic UV : Ultraviolet (tử ngoại)
XO : Xanthine oxidase YHCT : Y học cổ truyền
Trang 10DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1 Một số chất kháng oxy hóa tổng hợp 12
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của acid L-ascorbic và acid dehydro ascorbic 14
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của vitamin E 14
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của β-carotene 15
Hình 1.5 Công thức cấu tạo của taurine và hypotaurine 15
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của acid α-lipoic 15
Hình 1.7 Phản ứng trung hòa gốc DPPH 17
Hình 1.8 Phản ứng tạo phức giữa malonyldialdehyde và acid thiobarbituric 19
Hình 1.9 Ảnh minh họa cây và quả của T erubescens 21
Hình 1.10 Cấu trúc các hợp chất béo phân lập từ chi Tetrastigma 25
Hình 1.11 Cấu trúc các hợp chất steroid phân lập từ chi Tetrastigma 25
Hình 1.13 Cấu trúc các hợp chất phenol phân lập từ chi Tetrastigma 26
Hình 1.14 Cấu trúc các hợp chất flavonoid phân lập từ chi Tetrastigma 27
Hình 1.15 Cấu trúc hợp chất trans-reveratrol phân lập từ chi Tetrastigma 27
Hình 1.16 Cấu trúc các hợp chất chứa nitrogen phân lập từ chi Tetrastigma 28
Hình 1.17 Cấu trúc một số hợp chất khác phân lập từ chi Tetrastigma 28
Hình 1.18 Ảnh minh họa cây, hoa và lá của N orientalis 29
Hình 1.19 Cấu trúc một số hợp chất alkaloid phân lập từ cây N orientalis 33
Hình 1.20 Cấu trúc một số hợp chất steroid và chất béo phân lập từ cây N orientalis33 Hình 1.21 Cấu trúc một số hợp chất terpenoid phân lập từ cây N orientalis 34
Hình 1.22 Cấu trúc một số hợp chất polyphenol phân lập từ cây N orientalis 34
Hình 1.24 Cấu trúc một số hợp chất steroid, terpenoid phân lập từ chi Nauclea 38
Hình 1.25 Cấu trúc một số hợp chất polyphenol phân lập từ chi Nauclea 39
Hình 3.1 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-2 77
Hình 3.2 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-4 79
Hình 3.3 Tương quan HMBC của hợp chất DR-5 81
Hình 3.4 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-9 85
Hình 3.5 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-10 88
Hình 3.6 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-11 90
Hình 3.7 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-12 92
Trang 11Hình 3.8 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-13 94
Hình 3.9 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-14 96
Hình 3.10 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-15 98
Hình 3.11 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-17 101
Hình 3.12 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-18 104
Hình 3.13 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-19 107
Hình 3.14a Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần thứ nhất của hợp chất DR-20 109
Hình 3.14b Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần thứ hai của hợp chất DR-20 110
Hình 3.14c Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-20 110
Hình 3.15 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-21 113
Hình 3.16 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-22 115
Hình 3.17 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-23 118
Hình 3.18 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-25 122
Hình 3.19 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-26 124
Hình 3.20 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-27 126
Hình 3.21 Tương quan HMBC trong hợp chất DR-28 128
Hình 3.22 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-29 131
Hình 3.23 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất DR-30 133
Hình 3.24 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-5 135
Hình 3.25 Tương quan HMBC trong hợp chất GV-6 137
Hình 3.26 Tương quan HMBC trong hợp chất GV-8 140
Hình 3.27 Tương quan HMBC trong hợp chất GV-9 141
Hình 3.28 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-10 143
Hình 3.29 Tương quan HMBC trong hợp chất GV-12 146
Hình 3.30 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-13 148
Hình 3.31 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-14 151
Hình 3.32 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-15 153
Hình 3.33 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-16 156
Hình 3.34 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-17 158
Trang 12Hình 3.35 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-18 160
Hình 3.36 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-19 162
Hình 3.37 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-20 164
Hình 3.38a Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần aglycone của hợp chất GV-21 167
Hình 3.38b Cấu trúc và tương quan HMBC và COSY trong phần đường của hợp chất GV-21 168
Hình 3.38c Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-21 169
Hình 3.38d Tương quan NOESY trong hợp chất GV-21 169
Hình 3.39 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-22 171
Hình 3.40 Tương quan HMBC và COSY trong hợp chất GV-23 173
Hình 3.41 Tổng kết các hợp chất phenolic đơn vòng có hoạt tính kháng oxy hóa
178
Hình 3.42 Tổng kết các hợp chất benzopyranoid có hoạt tính kháng oxy hóa 179
Hình 3.43 Tổng kết các hợp chất stilbene có hoạt tính kháng oxy hóa 179
Hình 3.44 Tổng kết các hợp chất flavonoid có hoạt tính kháng oxy hóa 180
Hình 4.1 Cấu trúc của 30 chất phân lập từ thân cây T erusbescens 189
Hình 4.2 Cấu trúc của 23 chất phân lập từ thân cây N orientalis 190
Trang 13DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Các dạng hoạt động của nitrogen 2
Bảng 1.2 Các dạng hoạt động của oxygen 2
Bảng 1.3 Các chất được phân lập từ các cây thuộc chi Tetrastigma 24
Bảng 1.4 Các hợp chất được phân lập từ các cây N orientalis 31
Bảng 1.5 Các hợp chất phân lập từ chi Nauclea 35
Bảng 2.1 Danh mục, tiêu chí lựa chọn, độ ẩm nguyên liệu và thu suất điều chế cao chiết methanol củacác cây thuốc nghiên cứu sàng lọc 45
Bảng 2.2 Khối lượng và thu suất các loại cao từ thân cây T.erubescens 51
Bảng 2.3 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây T erubescens 53
Bảng 2.4 Khối lượng và thu suất các loại cao từ thân cây N.orientalis 55
Bảng 2.5 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate của thân cây N orientalis 57
Bảng 2.6 Chương trình gradient pha động 59
Bảng 2.7 Khối lượng các mảnh ion phân tử được phân tách trên cột C18 60
Bảng 2.8 Điều kiện chạy MS 60
Bảng 2.9 Dữ liệu đường chuẩn của các hợp chất cần định lượng 61
Bảng 2.10 Đường chuẩn của các hợp chất 61
Bảng 3.4 Phần trăm ức chế và giá trị IC50 của chất đối chứng dương, trolox thử nghiệm bằng phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid 70
Bảng 3.5 Thu suất, phần trăm ức chế và giá trị IC50 của tám mẫu cao thử nghiệm bằng phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid 71
Bảng 3.6 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn trích ly từ thân cây T erubescens 73
Trang 14Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các phân đoạn từ cao
ethyl acetate của thân cây T erubescens 73
Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn từ thân cây N orientalis 74
Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các phân đoạn từ cao ethyl acetate của thân cây N orientalis 75
Bảng 3.10 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-1 so sánh với acid 4-hydroxybenzoic 76 Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-2 so sánh với methyl 4-hydroxybenzoate 77
Bảng 3.12 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-3 so sánh với acid protocatechuic 78
Bảng 3.13 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-4 so sánh với methyl protocatechuate80 Bảng 3.14 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-5 so sánh với acid vanillic 81
Bảng 3.15 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-6 so sánh với acid gallic 82
Bảng 3.16 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-7 so sánh với methyl gallate 83
Bảng 3.17 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-8 so sánh với catechol 84
Bảng 3.18 Số liệu phổ NMR của hợp chất DR-9 so sánh với của mallonanoside B 86
Bảng 3.19 Số liệu phổ của hợp chất DR-10 so sánh với (E)-resveratrol 88
Bảng 3.20 Số liệu phổ của hợp chất DR-11 so sánh với (E) 2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside 90
Bảng 3.21 Số liệu phổ của hợp chất DR-12 so sánh với trans-polydatin 92
Bảng 3.22 Số liệu phổ của hợp chất DR-13 so sánh với 6-demethoxytangeretin 94
Bảng 3.23 Số liệu phổ của hợp chất DR-14 so sánh với tangeretin 96
Bảng 3.24 Số liệu phổ của hợp chất DR-15 so sánh với 6-demethoxynobiletin 98
Bảng 3.25 Số liệu phổ của hợp chất DR-16 so sánh với nobiletin 100
Bảng 3.26 Số liệu phổ của hợp chất DR-17 so sánh với catechin và epicatechin 102
Bảng 3.27 Số liệu phổ của hợp chất DR-18 so sánh với (-)-epigallocatechin-3-O-gallate 104
Bảng 3.28 Số liệu phổ của hợp chất DR-19 so sánh với phlorizin 107
Bảng 3.29 Số liệu phổ của hợp chất DR-20 so sánh với phổ tham khảo 111
Bảng 3.30 Số liệu phổ của hợp chất DR-21 so sánh với bergenin 113
Bảng 3.31 Số liệu phổ của hợp chất DR-22 so sánh với 4-O-galloylbergenin 115