TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NĂM HỌC 2017 2018 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHU[.]
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NĂM HỌC 2017 -2018 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KH̉N CỦA TINH DẦU VỎ CHANH Thuộc nhóm ngành khoa học: Khoa học tự nhiên Bình Dương, tháng 4/2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU VỎ CHANH Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thanh Tuyền Giới tính : Nữ Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: D14HHPT02 Năm thứ: 4/Số năm đào tạo: Ngành học: Hóa Học Người hướng dẫn: Thạc sĩ Lưu Huỳnh Vạn Long Thuộc nhóm ngành khoa học: Khoa học tự nhiên UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập – Tự – Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy hóa hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ chanh Nhóm sinh viên thực hiện: S Họ tên SV T Giới Dân tính tộc Lớp, Khoa Nguyễn Thị Nữ Kinh Thanh Tuyền Phạm Ngọc Nữ Kinh Nguyễn Thanh Nữ Kinh Nguyễn Hoàng Nữ Kinh Lê Huỳnh D14HHPT02 4/4 D14HHPT02 D14HHHC D14HHHC Nữ Kinh D14HHHC Khoa học tự nhiên Hóa học 4/4 Nhóm trưởng Hóa học 4/4 Hóa học 4/4 Khoa học tự nhiên Phương Thảo - học Khoa học tự nhiên Yến thứ/ Số năm Khoa học tự nhiên Thiện Ghi Khoa học tự nhiên Trân Ngành đào tạo T SV năm Hóa học 4/4 Hóa học Người hướng dẫn: Thạc sĩ Lưu Huỳnh Vạn Long Mục tiêu đề tài: - Khảo sát thành phần hóa học tinh dầu loại vỏ chanh: vỏ chanh Úc, vỏ chanh Mỹ, vỏ chanh Giấy - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu loại vỏ chanh: vỏ chanh Úc, vỏ chanh Mỹ, vỏ chanh Giấy - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu loại vỏ chanh: vỏ chanh Úc, vỏ chanh Mỹ, vỏ chanh Giấy Tính sáng tạo: Trước có số đề tài nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ chanh số nơi nước Đối với đề tài tiến hành với loại vỏ chanh thu hái Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh Ngồi thành phần hóa học hoạt tính kháng khuẩn, đề tài cịn tiến hành khảo sát khả kháng oxy hóa DPPH loại tinh dầu Kết nghiên cứu: Kết nghiên cứu xác định thành phần hóa học tinh dầu chanh Từ bảng kết so sánh (Bảng 3.5) thành phần hóa học mẫu ta nhận thấy hợp chất hidrocacbon chiếm đa số, hàm lượng D-Limonene chiếm thành phần chủ yếu tinh dầu Kết khảo sát phần trăm bắt gốc tự mẫu tinh dầu (Bảng 3.6) cho thấy phần trăm bắt gốc tự tinh dầu vỏ chanh giấy chanh Mỹ thấy chứng dương tinh dầu vỏ chanh Úc cao Như vậy, điều kiện thử nghiệm, hoạt tính kháng oxy hố theo phương pháp xếp theo thứ tự giảm dần: vỏ chanh Mỹ > vỏ chanh giấy > Trolox > vỏ chanh Úc Kết cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu vỏ chanh thơng qua khả bắt gốc tự DPPH Trong đó, theo phương pháp bắt gốc tự DPPH, tinh dầu vỏ chanh Mỹ chanh giấy có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, mạnh chất chuẩn Trolox Điều góp phần cung cấp dẫn liệu khoa học cho ứng dụng y học phát triển Do gia tăng hàm lượng gốc tự tế bào làm giảm q trình lão hóa bệnh tật Vì vậy, việc nghiên cứu tìm hợp chất có nguồn gốc tự nhiên có khả kháng oxy hóa trị bệnh có ý nghĩa thiết thực So sánh kết thử nghiệm tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ chanh Úc, Mỹ giấy với vi khuẩn thử nghiệm tinh dầu vỏ chanh giấy có đường kính vịng vơ khuẩn cao nhất, sau tinh dầu vỏ chanh Mỹ thấp tinh dầu vỏ chanh Úc Nổi bật tinh dầu vỏ chanh giấy cho đường kính vịng vơ khuẩn cao với vi khuẩn thử nghiệm Shigella flexneri NCDC 2747-71 Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài: Việc xác định thành phần hóa học, khả kháng oxy hóa khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ chanh góp phần cung cấp nguồn nguyên liệu thiên nhiên cho phát triển ngành công nghiệp hương liệu ngành công nghiệp dược liệu nước nhà Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài (ghi rõ họ tên tác giả, nhan đề yếu tố xuất có) nhận xét, đánh giá sở áp dụng kết nghiên cứu (nếu có): Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài Nguyễn Thị Thanh Tuyền Nhận xét người hướng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài: - Nhóm nghiên cứu phân tích thành phần cấu tử mẫu tinh dầu Vỏ chanh Mỹ, Úc, Giấy - Kiểm tra hoạt tính kháng oxy hóa DPPH mẫu tinh dầu cho kết yếu khả xếp theo thứ tự tăng dần: vỏ chanh Mỹ < vỏ chanh giấy < vỏ chanh Úc - Kiểm tra khả kháng dòng khuẩn mẫu tinh dầu cho thấy tinh dầu vỏ chanh giấy có đường kính vịng vơ khuẩn cao nhất, sau tinh dầu vỏ chanh Mỹ thấp tinh dầu vỏ chanh Úc Nổi bật tinh dầu vỏ chanh giấy cho đường kính vịng vơ khuẩn cao với vi khuẩn thử nghiệm Shigella flexneri NCDC 2747-71 Ngày tháng năm Xác nhận lãnh đạo khoa Người hướng dẫn (ký, họ tên) (ký, họ tên) UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập – Tự – Hạnh phúc THƠNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN: Ảnh 3x4 Họ tên: Nguyễn Thị Thanh Tuyền Sinh ngày: 13 tháng 02 năm 1995 Nơi sinh: Sông Bé Lớp: D14HHPT02 Khóa: 2014-2018 Khoa: Khoa học tự nhiên Địa liên hệ: ấp Rạch Kiến, xã Thanh Tuyền, huyện Dầu Tiếng, tỉnh Bình Dương Điện thoại: 0976580717 Email:thanhtuyen13295@gmail.com II Q TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích sinh viên từ năm thứ đến năm học): * Năm thứ 1: Ngành học: Hóa học Khoa: Khoa học tự nhiên Kết xếp loại học tập: Trung bình * Năm thứ 2: Ngành học: Hóa học Khoa: Khoa học tự nhiên Kết xếp loại học tập: Trung bình * Năm thứ 3: Ngành học: Hóa học Khoa: Khoa học tự nhiên Kết xếp loại học tập: Trung bình Xác nhận lãnh đạo khoa (ký, họ tên) Ngày tháng năm Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài (ký, họ tên) LỜI CẢM ƠN Được hướng dẫn Thầy Lưu Huỳnh Vạn Long, chúng em thực đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính kháng oxy hóa hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ chanh” Để hoàn thành đề tài này, chúng em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo tận tâm hướng dẫn, giảng dạy suốt trình chúng em học tập trường Đại học Thủ Dầu Một Xin chân thành cảm ơn Thầy Lưu Huỳnh Vạn Long, Cô Võ Thị Kim Thư đồng thời chúng em vô biết ơn nhà trường tạo điều kiện cho chúng em Mặc dù cố gắng thực đề tài cách hoàn chỉnh khơng thể tránh sai sót, chúng em mong nhận góp ý quý Thầy Cô giáo, bạn bè để nghiên cứu khoa học hoàn chỉnh Chúng em xin chân thành cảm ơn! Nhóm sinh viên thực MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.Tình hình nghiên cứu Lý lựa chọn đề tài Mục tiêu chọn đề tài Phương pháp nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu thực vật 1.1.1.Mô tả thực vật 1.1.1.1.Cây chanh giấy (Citrus aurantifolia) 1.1.1.2 Cây chanh Mỹ 1.1.1.3 Cây chanh Úc 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Công dụng 1.1.4 Tác dụng dược lý 1.2 Tìm hiểu chung tinh dầu 1.2.2 Những nét đặc trưng tinh dầu 1.2.3 Tính chất lý - hóa tinh dầu 1.2.3.1 Tính chất vật lý 1.2.3.2 Tính chất hóa học 10 1.2.4 Chỉ số vật lý 10 1.2.5 Thành phần hóa học 10 1.5.6 Hoạt tính kháng vi sinh vật 17 CHƯƠNG NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIÊM 20 2.1 Nguyên liệu 20 2.2 Khảo sát trích ly tinh dầu 20 2.3 Phương pháp chưng cất nước truyền thống 20 2.3.1 Nguyên tắc chung 20 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng q trình chưng cất 20 2.3.3 Thực hành 21 2.3.3.1 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 21 i 2.3.3.2 Các bước tiến hành 22 2.3 Xác định số vật lý 23 2.3.1 Chỉ số khúc xạ 23 2.3.1.1 Lý thuyết 23 2.3.1.2 Thực hành 24 2.3.1.2.1 Dụng cụ 24 2.3.1.2.2 Thao tác 24 2.3.1.3.3.Kết 24 2.3.1 Góc quay cực 24 2.4 Phương pháp thử hoạt tính bắt gốc tự DPPH 25 2.4.1 Về nguyên tắc 25 2.4.2 Qui trình thực 25 2.4.3 Tính tốn kết 25 2.5 Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật 26 2.5.1 Thiết bị hoá chất 26 2.5.2 Phương pháp tiến hành 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Chỉ số vật lý tinh dầu vỏ chanh 28 3.2 Kết xác định thành phần hóa học tinh dầu 28 3.3 Hoạt tính kháng oxy hóa DPPH tinh dầu vỏ chanh 31 3.4 Kết hoạt tính kháng vi sinh vật 31 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 4.1 Kết luận 33 4.2 Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 ii 31 β-Famesen 0,11 32 β-Cubeben 0,62 33 β-Selinen 0,19 34 α-Selinen 0,18 35 Germacren A 0,50 36 Cis-β -Bisabolen 4,50 37 γ-Elemen 1,27 38 Epiglobulol 0,22 39 (-)-Spatulenol 0,17 40 (+)-Ledol 0,37 41 Hidroxineoisolongifolan 0,34 42 α-Bisabolol 0,43 Hidroccarbon 82,71 Hợp chất oxigen 17,13 Tồng Tổng 99,84 Năm 2006, nhóm nghiên cứu Nguyễn Minh Hồng [6] xác định thành phần hóa học tinh dầu vỏ chanh giấy, kết nghiên cứu thành phần hóa học vỏ chanh giấy ghi (Bảng 1.5) Bảng 1.5 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ chanh Tên cấu phần TT Bicyclo [3.1.0] hexan, 4-metil-1-(1-metil etil)-, didehidro derive Hàm lượng (%) 0,13 α- Pinen 3,67 β-Pinen 17,14 Lemonen 26,36 γ- Terpinen 6,39 Terpinolen 1,00 β- Linalool 1,04 Trans-Pinocarveol 0,10 β-Citronellal 0,14 14 10 α- Terpineol 2,07 11 Nerol 0,14 12 α- Citral 3,73 13 β-Citral 2,79 14 Geraniol 1,89 15 Geraniol acetat 0,51 16 Caryophylen 4,27 17 Decanal 0,94 18 γ-Elemen 2,02 19 Piperiton 0,12 20 Undercanal 0,09 21 Eremophilen 0,13 22 γ-Muurolen 0,11 23 α-Bergamoten 3,81 24 α-Farnesen 7,02 25 δ-Elemen 1,68 26 Nerol acetat 0,21 27 β-Elemen 1,37 28 α-Humulen 0,74 29 β-Santalen 0,34 30 Germacrene D 1,33 31 Isocaryophylen 0,49 32 β-cis-Ocimen 1,15 33 α-Selenen 0,54 34 α-Himachalen 0,24 35 Epiglobulol 0,17 36 Tetradecanal 0,24 37 α-Bisabolol 0,56 Tổng cộng 98,31 15 Năm 2004, Nguyễn Văn Lợi, Nguyễn Thị Minh Tú Hồng Đình Hịa [8] nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu vỏ chanh thu kết (Bảng 1.6) Bảng 1.6 Thành phần hóa học tinh dầu chanh Tân Yên Tên thành phần hóa học STT Hàm lượng (%) α-pinene 13,04 camphene 8,13 β-pinene 3,27 Sabinene 6,02 Myrcene 4,73 α-phellandrene 1,07 α-terpinene 0,95 l-limonene 28,06 Thujene 0,64 10 γ-terpinene 6,71 11 p-cymene 0,52 12 α-farnesene 0,84 13 α-humulene 1,28 14 β-bisabolene 1,57 15 Octanal 0,92 16 Nonanal 1,34 17 Citronellal 1,15 18 Decanal 0,33 19 Geranial 0,82 20 Tridecanal 1,28 21 terpinen-4-ol 3,47 22 Nonanol 2,93 23 α-terpineol 3,44 24 cis-p-menth-8-en-2-one 1,38 25 neryl acetate 2,36 26 perillyl acetate 1,54 monoterpene 73,14 16 sesquiterpene 3,69 Aldehyde 5,83 Alcohol 9,84 Ketone 1,38 ester 3,90 Tổng lớp chất terpenhydro 20,95 Tổng dẫn xuất chứa oxy terpen 76,83 Tổng cộng 97,78 1.5.6 Hoạt tính kháng vi sinh vật Qua nghiên cứu trước cho thấy tinh dầu vỏ chanh diệt số loại vi khuẩn nấm Năm 2001, nhóm tác giả Nguyễn Thị Thảo Trân Lê Ngọc Thạch [4] thử nghiệm tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ chanh chủng vi khuẩn Kết thử nghiệm tính kháng khuẩn trình bày (Bảng 1.7) Bảng 1.7 Kết đường kính vịng kháng khuẩn tinh dầu vỏ chanh (Citrus aurantifolia) STT Chủng vi khuẩn Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) Salmonclla enteritidis Bacillus subtilis 10 Vibrio cholerae 17 Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Escherichia coli 10 Streptococcus pneumoniae Năm 2006, Thạc sĩ Nguyễn Minh Hoàng [6] nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu vỏ chanh giấy (Bảng 1.8) 17 Bảng 1.8 Kết thực nghiệm kháng khuẩn tinh dầu vỏ chanh giấy Đường kính vịng vơ khuẩn(mm) Vi khuẩn C0 C1 C2 C3 C 11 0 Shigella 10 0 Salmonella paratyphi A 16 13 10 10 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Năm 2004, Nguyễn Văn Lợi, Nguyễn Thị Minh Tú Hồng Đình Hòa [8] tiến hành khảo sát khả kháng khuẩn tinh dầu chanh Tân Yên nồng độ khác (Bảng 1.9) Bảng 1.9 Kết thực nghiệm kháng khuẩn tinh dầu vỏ chanh Chủng vi sinh vật kiểm chứng STT Đường kính vịng kháng khuẩn D- d(mm) Staphylococcus aureus 2,2 Escherichia coli 2,4 Salmonella typhy 2,6 Bacillus cereus 2,8 Năm 2005, tác giả Nguyễn Thị Thảo Trân [5] tiến hành khảo sát khả kháng khuẩn tinh dầu vỏ chanh nồng độ khác (100, 10-1, 10-2, 10-3) (Bảng 1.10) Bảng 1.10 Kết đường kính (mm) vòng ức chế vi khuẩn vỏ trái chanh Chủng vi khuẩn Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) Bacillus pumilus 33 20 13 09 06 Bacillus subtilis 20 13 09 06 06 Escherichia coli 39 24 13 09 06 Pseudomonas aeruginosa 15 07 06 06 06 Salmonella typhi 15 09 06 06 06 Salmonella paratyphi 11 06 06 06 06 Sarcina lurtea 19 07 06 06 06 18 Shigella spp 09 06 06 06 06 Staphylococcus aureus 33 14 06 06 06 Vibrio cholera 11 06 06 06 06 Nồng độ C0 C1 C2 C3 C4 19 CHƯƠNG NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIÊM 2.1 Nguyên liệu Mẫu vỏ chanh thu hái vườn chanh giấy Sáu Danh loại vỏ chanh không hạt (chanh Mỹ chanh Úc) vườn Chín Ấp Bốn Phú, xã Trung An, huyện Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh, tháng 7/2017 Vỏ chanh: chanh giấy thu hoạch từ chanh năm tuổi, chanh không hạt thu hoạch từ chanh 2-3 năm tuổi, sau thu hoạch bảo quản kín, điều kiện nhiệt độ phịng 2.2 Khảo sát trích ly tinh dầu Việc trích ly tinh dầu thực phịng thí nghiệm Bộ mơn Hóa học Hữu cơ, khoa Khoa học tự nhiên, Trường Đại học Thủ Dầu Một 2.3 Phương pháp chưng cất nước truyền thống 2.3.1 Nguyên tắc chung Phương pháp lôi tinh dầu nước dựa nguyên lý trình chưng cất hỗn hợp không tan lẫn vào nước tinh dầu Khi hỗn hợp gia nhiệt, hai chất dều bay Nếu áp suất nước cộng với áp suất tinh dầu với áp suất mơi trường, hỗn hợp sơi tinh dầu lấy với nước Phương pháp có ưu điểm lượng nhiệt độ sôi hỗn hợp thấp nhiệt độ sôi nước (1000C) nhiệt độ sôi tinh dầu lớn 100oC áp suất khí Ví dụ, chưng cất lôi tinh dầu thông nước áp suất khí quyển, nhiệt độ sơi dầu thơng 1580C nhiệt độ sôi hỗn hợp khoảng 950C Chưng cất lơi nước khơng địi hỏi nhiều thiết bị phức tạp, có khả cất gần triệt để tinh dầu có nguyên liệu Ngồi ra, phương pháp cịn cho phép phân ly cấu tử có tinh dầu thành phần riêng biệt có độ tinh khiết cao dựa vào khác biệt tính chất bay 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng q trình chưng cất 2.3.2.1 Sự khuếch tán 20 Khi nguyên liệu làm vỡ vụn có số mơ chứa tinh dầu bị vỡ cho tinh dầu thoát tự ngồi theo nước lơi Phần lớn tinh dầu cịn lại mơ thực vật tiến dần bề mặt nguyên liệu hòa tan thẩm thấu Ở nhiệt độ nước sôi, phần tinh dầu hịa tan vào nước có sẵn tế bào thực vật Dung dịch thẩm thấu dần bề mặt nguyên liệu bị nước Còn nước vào nguyên liệu theo chiều ngược lại tinh dầu lại tiếp tục hòa tan vào lượng nước Quy trình lặp lặp lại tinh dầu mơ hết Đồng thời hợp chất dễ hịa tan nước lơi trước Như vậy, diện nước cần thiết, chưng cất phải sử dụng nước nhiệt, ý tránh để nguyên liệu bị khô Nhưng lượng nước sử dụng thừa q khơng có lợi, trường hợp tinh dầu có chứa cấu phần dễ tan nước Nguyên liệu làm vỡ vụn nhiều tốt, cần cho lớp nguyên liệu có độ xốp định để nước vào lớp đồng dễ dàng 2.3.2.2 Sự thủy giải Những cấu phần este tinh dầu thường dễ bị thủy giải cho axit ancol đun nóng thời gian dài với nước Do đó, để hạn chế tượng này, chưng cất lôi nước phải thực thời gian ngắn tốt 2.3.2.3 Nhiệt độ Nhiệt độ cao làm phân hủy tinh dầu Do đó, tiến hành chưng cất phải điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp với giai đoạn Sau cấu phần dễ bay lơi hết dùng nước q nhiệt (trên 1000C) để chưng cất (nên thực việc giai đoạn cuối chưng cất) Tuy nhiên, hầu hết tinh dầu bền tác dụng nhiệt nên ta phải hạn chế thời gian chịu nhiệt độ cao tinh dầu Các yếu tố có mối liên hệ lẫn tăng nhiệt độ khuếch tán thẩm thấu tăng, hòa tan tinh dầu nước tăng phân hủy tinh dầu tăng theo 2.3.3 Thực hành 2.3.3.1 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất Dụng cụ, thiết bị: 21 Dao bào Dao thái lan nhỏ Đũa thủy tinh Bình cầu Ống sinh hàn Phiễu chiết Etylen Cân đồng hồ Hóa chất: Nước cất Na2SO4 khan 2.3.3.2 Các bước tiến hành Cho 1100g nguyên liệu vỏ chanh cắt nhuyễn thêm 3500ml nước vào bình cầu 5000ml Lắp hệ thống chưng cất, tiến hành chưng cất, đun nhiệt độ 100oC Hơi nước bay lên lôi tinh dầu lên, ngưng tụ ống sinh hàn tách lớp phận tách tinh dầu Để nguội, trích ly phần tinh dầu phiễu chiết Làm khan nước Na2SO4 khan Cân xác lượng tinh dầu trích ly Quy trình sản xuất Hình 2.1 Quy trình sản xuát tinh dầu vỏ chanh 22 Hình 2.2 Vỏ chanh cắt nhuyễn Hình 2.3 Hệ thống chưng cất lơi nước 2.3 Xác định số vật lý 2.3.1 Chỉ số khúc xạ 2.3.1.1 Lý thuyết 23 Chỉ số khúc xạ (hay gọi chiết suất) tỷ số sin góc tới sin góc khúc xạ tia sáng có độ dài sóng xác định từ khơng khí qua tinh dầu nhiệt độ định [2] Người ta thường dùng ánh sáng đèn natrium (D) có độ dài sóng 589.3 ± 0.3 nm Nhiệt độ tham chiếu 20oC trừ trường hợp tinh dầu không thể lỏng nhiệt độ phải chọn 25 30o [2] 2.3.1.2 Thực hành 2.3.1.2.1 Dụng cụ Sử dụng khúc xạ kế có số khúc xạ từ 1,3000 đến 1,7000 với độ xác 0,0002 Ở 20oC số khúc xạ sau tham chiếu: 1,3330 cho nước cất; 1,4906 cho p-cimen; 1,5685 cho benzoat benzil; 1,6585 cho 1-bromonaptalen[1] 2.3.1.2.2 Thao tác Cho dịng nước nóng chảy khúc xạ kế để trì máy nhiệt độ cần thực (bộ phận có sẵn máy) nhiệt độ đo không nên sai nhiều so với nhiệt độ tham chiếu (sai số 0,2oC) Trước đặt mẫu vào khúc xạ kế, nên đưa mẫu thử đến nhiệt độ gần với nhiệt độ cần thực [2] 2.3.1.3.3.Kết Chỉ số khúc xạ, tính theo cơng thức sau [2] : số khúc xạ nhiệt độ quy định (thí dụ 20oC) : số khúc xạ đo nhiệt độ t’ Kết lấy đến số lẻ thứ 2.3.1 Góc quay cực Hầu hết tinh dầu có tính quang hoạt, nghĩa có khả làm quay mặt phẳng ánh sáng xuyên qua Khả làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực tinh dầu khác biểu thị góc quay cực (góc quay quan sát) Góc quay cục tinh dầu ( kí hiệu phẳng ánh sáng có độ dài sóng 589,3 ), tính độ, góc quay mặt 0,3 nm, sáng truyền ngang qua ống chứa tinh dầu dài 1dm điều kiện định Những tinh dầu làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo chiều kim đồng hồ gọi tinh dầu hữu triền (+,d) ngược lại gọi tinh dầu tả triền (-,l) 24 Để xác định góc quay cực người ta thường sử dụng loại triền quang kế dùng đèn natrium kính lọc màu vàng da cam, (D) điều chỉnh tay hay tự động số Góc quay cực phần lớn loại tinh dầu thay đổi theo nhiệt độ, xác định nhiệt độ phịng [2] 2.4 Phương pháp thử hoạt tính bắt gốc tự DPPH Hoạt tính chống oxy hóa thử nghiệm tại: Phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh học phân tử trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp Hồ Chí Minh theo phương pháp diệt gốc tự DPPH 2.4.1 Về nguyên tắc Là phương pháp nhằm xác định khả kháng oxi hoá hợp chất dựa khả bắt gốc tự DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) có khả tạo gốc tự bền methanol có độ hấp thu cực đại bước sóng 517 nm Khi cho mẫu thử ngiệm vào hỗn hợp này, chất có khả làm trung hồ bao vây gốc tự làm DPPH chuyển từ màu tím sang vàng Tín hiệu đo máy ELISA reader Hoạt tính kháng oxi hố chất thử nghiệm đánh giá thông qua phần trăm làm giảm giá trị hấp thụ ánh sáng mẫu thử nghiệm so với đối chứng Có nhiều phương pháp khác để thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa chất Trong tất phương pháp thử, phương pháp làm gốc tự DPPH phương pháp sử dụng phổ biến Ngoài ra, phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp với điều kiện có sẵn phịng thí nghiệm nên hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu vỏ chanh đánh giá phương pháp DPPH 2.4.2 Qui trình thực Chuẩn bị dung dịch DPPH 150 µM pha methanol 80% (sử dụng ngay) pha mẫu cao chiết với nồng độ khác Cho 200 µL DPPH 150 µM chuẩn bị vào giếng đĩa 96 giếng Sau đó, thêm vào 25 µL/giếng dung dịch mẫu cần đo nồng độ khác Đo mật độ quang bước sóng 517 nm, đo theo thời gian 10 phút/lần 60 phút Trolox sử dụng làm chứng dương 2.4.3 Tính tốn kết Tỉ lệ phần trăm bắt gốc tự DPPH tính theo cơng thức sau: 25 Trong đó: ODt: mật độ quang mẫu thí nghiệm sau trừ blank (khơng có DPPH) ODc: mật độ quang mẫu control sau trừ blank (khơng có DPPH) Giá trị SC50 (nồng độ chất thử nghiệm bắt giữ 50% gốc tự DPPH) xác định dựa đường chuẩn giá trị mật độ quang mẫu nồng độ khác 2.5 Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật Hoạt tính kháng vi sinh vật thực Phòng Vi sinh Thực phẩm, Khoa xét nghiệm, Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh Hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu vỏ chanh thử nghiệm chủng vi sinh vật bao gồm vi khuẩn Gram (+), vi khuẩn Gram (-) Tinh dầu vỏ chanh thử nghiệm mẫu chủng vi sinh vật: Vi khuẩn Gram (+): - Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng): vi khuẩn gây mụn nhọt, áp xe, viêm mũi, viêm phổi, ngộ độc thực phẩm Vi khuẩn Gram (-): - Escherichia coli: vi khuẩn gây rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy cấp tính - Salmonella typhi: vi khuẩn gây bệnh thương hàn - Shigella flexeri: nhóm vi khuẩn thuộc vi khuẩn Shigella, tác nhân gây bệnh lỵ trực khuẩn loài linh trưởng người - Vibrio cholera: vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng đường ruột Nguyên tắc: Tải FULL (82 trang): https://bit.ly/3fQM1u2 Dự phịng: fb.com/KhoTaiLieuAZ Hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu thực phương pháp khuếch tán kiểm sốt thạch Dung mơi sử dụng pha mẫu DMSO Trải vi khuẩn với số lượng định mặt thạch, cho tiếp xúc Đặt đĩa giấy tẩm tinh dầu sẵn lên bề mặt thạch Tinh dầu khuếch tán vào thạch ức chế tăng trưởng vi sinh vật, tạo thành vòng kháng vi sinh vật xung quanh đĩa giấy 2.5.1 Thiết bị hoá chất - Hộp petri 26 - Que gòn Kẹp hấp khử trùng - Giấy lọc Whatman dày, đường kính mm, hấp khử trùng - Đèn cồn - Pipetman - Đầu típ vàng, đầu típ xanh - Eppendof nồi hấp khử trùng - Tủ sấy - Tủ ấm 37oC Tải FULL (82 trang): https://bit.ly/3fQM1u2 Dự phịng: fb.com/KhoTaiLieuAZ - Dietil eter Mơi trường nuôi cấy MHA (Mueller Hinton Agar), Sabouraud Agar Độ đục chuẩn Mc Farland 0.5 2.5.2 Phương pháp tiến hành Hấp khử trùng đĩa petri 50 phút, để tủ sấy cho đĩa khơ hồn tồn Chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nấu sôi khuấy Cho mơi trường vào bình thuỷ tinh hấp khử trùng 50 phút Cho khoảng 20 ml môi trường nuôi cấy vào đĩa petri, ủ 37oC 24 để kiểm tra vô trùng Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm định vào đĩa petri (nồng độ vi sinh vật khoảng 108 tế bào) Dùng kẹp hấp khử trùng đặt đĩa giấy lọc Whatman vào lọ tinh dầu (loại nguyên chất pha loãng), đặt lên mặt thạch cấy sẵn vi khuẩn cần kiểm định Mỗi đĩa petri đặt đĩa giấy cách nhau, ủ 37oC Sau 24 giờ, lấy quan sát đo đường kính vịng vơ trùng 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chỉ số vật lý tinh dầu vỏ chanh Tiến hành xác định số vật lý tinh dầu để xác định góc quay cực, số khúc xạ riêng loại tinh dầu vỏ chanh Kết thể (Bảng 3.1) Bảng 3.1 Chỉ số vật lý tinh dầu vỏ chanh Mẫu vỏ chanh Góc quay cực Chỉ số khúc xạ Vỏ chanh Úc α25D = +42,220 n20D = 1,63692 Vỏ chanh Mỹ α25D = +47,834 n20D = 1,63436 Vỏ chanh Giấy α25D = +30,806 ntD = 1,63646 3.2 Kết xác định thành phần hóa học tinh dầu Tinh dầu vỏ chanh giấy, vỏ chanh Mỹ, vỏ chanh Úc, sau khai thác phương pháp chưng cất lôi theo nước làm khan Na2SO4 sử dụng phương pháp GC-MS định danh thành phần hóa học GC-FID để xác định phần trăm chất có tinh dầu (Bảng 3.2, Bảng 3.3, Bảng 3.4) Bảng 3.2 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ chanh giấy Tên hợp chất Tỷ lệ có mẫu STT RT 5,618 1R-α-Pinene 2,006 6,758 Sabinene 1,978 6,922 (-)-β-Pinene 21,438 8,517 p-Cymen 11,658 8,703 D-Limonene 44,149 12,870 Limonene oxide, cis-(-)- 1,531 16,788 Trans-Carveol 0,896 17,866 (S)-Carvone 1,058 26,267 Trans-α-Bergamotene 0,494 10 29,510 β-Bisabolene 0,785 28 8734554 (%) ... hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu loại vỏ chanh: vỏ chanh Úc, vỏ chanh Mỹ, vỏ chanh Giấy - Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu loại vỏ chanh: vỏ chanh Úc, vỏ chanh Mỹ, vỏ chanh Giấy Tính sáng... kháng khuẩn tinh dầu vỏ chanh Mục tiêu chọn đề tài Khảo sát thành phần hóa học tinh dầu loại vỏ chanh: vỏ chanh Úc, vỏ chanh Mỹ, vỏ chanh Giấy Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu loại vỏ chanh: ... lý tinh dầu vỏ chanh 28 Bảng 3.2 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ chanh giấy 28 Bảng 3.3 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ chanh Mỹ 29 Bảng 3.4 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ chanh