Thông tin tài liệu
NTTU-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2020 Tên đề tài: Phân lập, định danh khảo sát khả sinh trưởng lồi nấm có hoạt tính kháng khuấn Pycnoporus sp chất rắn Số hợp đồng: 2020.01.008 Chủ nhiệm đề tài: Ngô Nguyên Vũ Đơn vị công tác: Viện kỳ thuật công nghệ cao NTT- Đại học Nguyền Tất Thành Thời gian thực hiện: tháng (03/2020 - 9/2020) TP Hồ Chỉ Minh, ngày 21 thảng năm 2020 MỤC LỤC MỜ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kháng sinh vi khuẩn kháng kháng sinh 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn cũa hợp chất sản xuất từ nấm 1.3 Sơ lược loài nấm thuộc chi Pycnoporus 1.4 Sàng lọc sản xuất chất có hoạt tính kháng khuẩn từ nấm hoại gồ CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Sàng lọc mầu nấm bang xác định hình thái thứ nghiệm sinh hóa the 2.2.2 Phân lập dịng tơ nấm từ mầu quà thể tươi 2.2.3 Định danh loài nam phương pháp sinh học phân từ 2.2.4 Khảo sát nhu cầu dinh dưỡng cùa mầu nấm phân lập 10 2.2.5 Thừ nghiệm nuôi cấy tạo sinh khối nấm chất rắn 10 2.2.6 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cùa cao chiết sinh khối nấm dung môi hữu 11 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THAO LUẬN .12 3.1 Mô tà đặc điểm hình thái mẫu nấm phân lập 12 3.2 Định danh loài nấm phương pháp sinh học phân từ 14 3.3 Khảo sát tốc độ sinh trưởng tơ nấm môi trường thạch dinh dưỡng 16 3.4 Khảo sát tốc độ sinh trưởng tơ nấm môi trường thạch dinh dường 19 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết sinh khối nấm dung môi hữu 19 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 21 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ IDSA : Industrial Designers Society of America PDA : Potato dextrose agar TSA : Tryptic soy agar WHO : To chức Y te The giới - World Health Organization iv DANH MỤC CÁC so ĐỊ, HÌNH ẢNH Hình 1.1: Sơ lược lịch sử tượng kháng kháng sinh cùa loại vi sinh vật kèm với hệ kháng sinh xuất theo thời gian (Nguồn: ƯK Research and Innovation) Hình 1.2: Một số lồi nấm mục gồ có khả sản xuất họp chất với hoạt tính kháng khuẩn mạnh phát nghiên cứu (la): Pseudoplectania nigrella (Nguồn: Michael Wood) (1b): Clitopilus passeckerianus (Nguồn: Det H.Bender) (1c): Sparassis crispa (Nguồn: Michael Wood & Fred Stevens) (Id): Coprinus quadrifidus (Nguon: Jim Frink) Hình 1.3: Một so lồi nấm tiêu biêu thuộc chi Pycnoporus 2a: Pycnoporus sanguineus, 2b: Pycnoporus cinnabarinus, 2c: Pycnoporus puniceus, 2d: Pycnoporus coccineus (Nguồn: Tellez-Tellez M [20]) Hình 3.1: Một số đặc điểm hình thái khác mầu nấm Pycnoporus spp (la): Mặt cắt ngang thể (1b): Sợi tơ nấm kính hiển vi 40x (1c): Bào tử nấm kính hiến vi 40x Hình 3.2: Ket sequencing vùng ITS cùa mẫu nấm phân lập thực công ty Macrogen (Hàn Quốc) Hình 3.3: So sánh Tốc độ phát triển chủng Pycnoporus sanguineus loại thạch môi trường khác Hình 3.4: Hình thái tơ nấm Pycnoporus sanguineus môi trường dinh dưỡng khác sau ngày phát triển A: Môi trường Malt extract agar B: Môi trường PDA bố sung cao nấm men C: Môi trường Czapez D: Môi trường Saboraugh E: Môi trường Glucose 2% F: Mơi trường PDA khơng cao nấm men Hình 3.5: So sánh Tốc độ phát triển chủng Pycnoporus sanguineus nồng độ đường Glucose khác Hình 3.6: So sánh Tốc độ phát triển chủng Pycnoporus sanguineus tỉ lệ phối trộn chất rắn khác Hình 3.7: Ni cay Pycnoporus sanguineus chất thóc đe hình thành sinh khối có sắc tố V DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU Bảng 3.1: Các đặc điểm hình thái mẫu nấm thu thập thuộc chi Pycnoporus Bảng 3.2: Tốc độ phát triển tơ nấm Pycnoporus sanguineus loại thạch môi trường, (đơn vị: mm) Bảng 3.3: Tốc độ phát triển chùng Pycnoporus sanguineus loại thạch glucose với nong độ khác Đơn vị: mm Bảng 3.4: Kết thừ nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cao chiết nấm Pycnoporus sanguineus phương pháp dĩa giấy kháng sinh loại vi khuấn vi TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu STT Kết quà đạt Cơng việc thực Tìm thu thập mẫu nấm Pycnoporus Thu thập mẫu tai nấm có khả mọc hoang dại khu vực mien Nam cao thuộc chi Pycnoporus với đặc điểm hình thái trùng khớp với mô tả Việt Nam Phân lập dòng lưu trử mẫu Phân lập cấy truyền thành cơng nấm phịng thí nghiệm từ thể chúng nam Pycnoporus điều kiện quâ thu Chủng nấm định phịng thí nghiệm Ket định danh danh loài bang phương pháp per bang phương pháp giải trình tự vùng giải trình tự vùng Internal transcribed Internal transcribed spacer (ITS) cho thấy mẫu nấm thuộc lồi Pycnoporus spacer (ITS) sanguineus Ni cấy chủng nấm giá thê ran Chủng nâm Pycnoporus sanguineus đe phát triển sinh khối tơ nấm Thu phát triển tốt điều kiện chất sinh khối tơ nấm tiến hành tách ran có tỉ lệ Hydrocarbon cao độ am chiết họp chất kháng khuẩn bàng 60%, tạo sinh khối nhanh thời gian ngan Cao chiết chiết từ phần dung môi hữu cơ’ sinh khối nấm có sắc tố đỏ bang dung mơi Methanol cô quay 60 độ c Xác định hoạt tính kháng khn cùa Cao chiêt có hoạt tính kháng khn phơ dịch chiet tơ nấm phương pháp rộng chùng khuẩn gram dương đĩa giấy kháng sinh MIC bao gôm Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes chủng vi khuẩn gram âm Pseudomonas Escherichia coli aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus STT Xừ lý số liệu soạn thảo Sản phẩm đạt Sản phẩm đăng ký Quy trình ni cấy nấm Pycnoporus Quy trình ni cấy nấm Pycnoporus trên giá thể rắn có sinh chất kháng giá thể rắn có sinh chất kháng khuẩn vii khuân 01 báo đăng Tạp chí khoa 01 báo đăng Tạp chí khoa học học cơng nghệ đại học Nguyễn Tất công nghệ đại học Nguyễn Tất Thành Thành Thời gian thực hiện: 03/2020 - 09/2020 Thời gian nộp báo cáo: 21-08-2020 viii MỞ ĐÀU Nấm có the coi đối tượng tập trung nghiên cứu nhiều giới khoa học đặc điểm phi thường hành vi phức tạp cùa chúng tận dụng khai thác nhiều lĩnh vực khác Thành tựu lớn ngành công nghệ sinh học nấm khám phá kháng sinh, đặt nen móng cho phương pháp trị liệu chong lại bệnh nhiễm trùng vi sinh vật vốn coi hiểm nghèo thời kì Tuy nhiên, đời cùa kháng sinh khiển người chù quan lạm dụng phác đo điều trị bệnh nhiễm trùng kháng sinh cách bừa bãi Điều dần đến hậu dịng vi khuẩn có chế kháng thuốc xuất hiện, thúc việc tìm loại kháng sinh thay cho loại kháng sinh tác dụng cho đen thời điếm Bên cạnh kháng sinh sàn xuất loài nấm thuộc thuộc ngành Zygomycota Ascomycota (thường gọi chung nấm mốc), nấm thuộc ngành Basidiomycota (Nấm Đàm) sản xuất nhiều loại kháng sinh khác Các lồi nấm hoại gỗ từ ngành Basidiomycota có the ứng cử viên tiềm việc tìm kiếm loại kháng sinh mới, với nhiều loài số chúng phát có khà tổng hợp loạt hợp chất chống vi rút, kháng khuẩn chổng ung thư Pycnoporus chi nam thuộc họ Polyporaceae, ngành Ascomycota, thuộc nhóm nấm mục gỗ trang (white rot fungi) Các loài nấm thuộc chi Pycnoporus có the tìm thay thân gỗ phần gồ mục khu vực nhiệt đới ẩm nhiều nơi toàn giới Nhiều nghiên cứu chứng minh sắc to đỏ cùa loài nấm Pycnoporus sp có thành phần bao gom hợp chat cinnabarin, cinnabarinic acid tramesanguin, hợp chất the hoạt tính chống oxy hóa, khà tẩy gốc tự do, kháng nấm, kháng ung thư, tính điều hịa miền dịch, kháng khuẩn, hoạt tính chống viêm Hoạt tính kháng khuẩn cùa lồi nấm Pycnoporus nhiều nghiên cứu tiến hành tìm hiểu với khả nàng ức chế nhiều loại vi khuẩn khác nhau, bao gôm Bacillus subtilis, Burkholderia unamae, Escherichia coll, Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae Tuy nhiên cho den vần chưa có nghiên cứu thật sâu vào khai thác khà sản xuất kháng sinh loài nấm này, chưa có đánh giá cụ tiềm kháng khuẩn cùa chúng Việt Nam Việc đánh giá tiềm kháng khuẩn khả phát triển cùa loài nấm thuộc chi Pycnoporus điều kiện ni cấy nhân tạo tạo tiền đề phát triền loại kháng sinh sàn xuất từ loài nấm tương lai CHƯƠNG TỚNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kháng sinh vi khuẩn kháng kháng sinh Kháng sinh tên gọi chung cùa họp chất kiểm sốt, ngãn chặn ức ché hồn tồn phát triển, chí tiêu diệt loại vi sinh vật kí sinh trùng có hại cho thể vật chù [1] Mặc dù định nghĩa ve họp chất kháng khuẩn kháng sinh sừ dụng từ năm 1640, việc phát kháng sinh đau tiên penicillin từ nam mốc Penicỉllium chrysogenum ứng dụng phát đồ điều trị nhiễm khuẩn coi thành tựu vĩ đại xuyên suốt lịch sứ ngành công nghệ sinh học nấm [2] Ke từ penicillin đời, the hệ kháng sinh hợp chất chong nhiễm trùng the hệ phát triển cài tiến vài thập kỳ đe đoi phó với loại bệnh gây loại vi khuẩn khác Sau Alexander Fleming phát Penicillin vào năm 1928, trình sản xuất penicillin từ nấm mốc Penicillium đẩy mạnh vào năm 1940 từ thời diem kháng sinh phân phối vô rộng rãi bệnh viện sở y tế toàn giới [3] Thành tựu dòng lịch sữ phát triển cùa kháng sinh khám phá streptomycin từ vi khuẩn Streptomyces phân lập từ đất Nhiều loại thuốc kháng sinh nối tiếp sân xuất có nguồn gốc từ Streptomyces, bao gom Streptomycin từ Streptomyces grỉseus, Erythromycin từ Streptomyces erythreus, Tetracycline Streptomyces aureofaciens sản xuất, Vancomycin từ Streptomyces orientalis sản xuất [4][5][6][7] Các the hệ kháng sinh sau có tác động tích cực điều trị giảm thiểu đáng kể ti lệ tữ vong bệnh nhiễm trùng vi sinh vật gây [3] Tuy nhiên sau kháng sinh bị lạm dụng sừ dụng bất can thời gian dài khiến loài vi sinh vật gây bệnh dan dan thích nghi với chúng, sinh hệ sinh vật kháng thuốc [8] Van đe vi sinh vật kháng kháng sinh vấn đe có the giài cách đơn gián, chùng vi sinh vật kháng thuốc thường đen từ nhiều nguồn gốc khác Việc lạm dụng kháng sinh bừa bãi tiến hành biện pháp điều trị bệnh nhiễm trùng coi nguồn làm cho vi sinh vật kháng kháng sinh xuất [8] Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu có chứng chứng minh rang nước thài công nghiệp có the nguồn cho chùng vi khuẩn kháng thuốc xuất lan truyền môi trường [9], Do việc sừ dụng kháng sinh bừa bãi, lượng lớn thuốc kháng sinh thải môi trường theo nhiều đường khác nhau, bao gom chất thải dược phẩm chất thải chăn nuôi công nghiệp [10] Sự xuất cùa kháng sinh nước thài đẩy nhanh trình chọn lọc tạo chủng vi sinh vật kháng kháng sinh mới, mang đến hiểm họa cùa bệnh nhiễm trùng kháng thuốc nguy hiểm tương lai A BRIEF HISTORY OF ANTIBIOTICS & RESISTANCE Hình 1.1 Sơ lược lịch sử tượng kháng kháng sinh loại vi sinh vật kèm với hệ kháng sinh xuất theo thời gian (Nguồn: UK Research and Innovation) Báo cáo cùa Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công bố vào tháng năm 2014 nêu rõ, "mối đe dọa nghiêm trọng cùa kháng kháng sinh khơng cịn dự đốn tương lai đen, xảy khu vực the giới có khả ành hường den ai, lứa tuổi, quốc gia” Với tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc xuất nay, nhiều nhà khoa học dự đoán ngày tương lai loại thuốc kháng vi sinh cũa khơng cịn tác dụng tiêu diệt vi khuẩn vi sinh vật gây bệnh Đó lý tác nhân kháng khuẩn tích cực nghiên cứu tìm kiếm nhằm phát triển loại kháng sinh thay cho loại bị vơ hiệu hóa dần tương lai 1.2 Hoạt tính kháng khuẩn hợp chất sản xuất từ nấm Trong tự nhiên, hợp chất có hoạt tính kháng khuấn tìm thấy từ loại sinh vật khác nhau, đa dạng từ vi khuẩn, xạ khuẩn mốc, nấm men nấm đại Bên cạnh nhóm kháng sinh sản xuất xạ khuẩn, kháng sinh từ nấm mốc thuộc ngành Zygomycota từ lâu nhiều nhà khoa học nghiên cứu phát triển [11] Sau đời cùa Penicillin sán xuất Penicỉlliunì chrysogenum, nhiều loại kháng sinh khác sản xuất từ lồi mốc Kích thước 2x3cm, dày l-3mm tai nhỏ 4x7cm, dày 2-8mm tai lớn jL V Hình thái thụ Màu đỏ cam sậm mặt cùa tai nấm, tầng bao gồm lồ bào từ với kích thước 0.5-Imm đường kính phân bố từ phần tới rìa tai nam, khơng xuất ong sinh bào tữ khu vực khoảng 5-9mm viền tai nam Ket cấu ống Bao gom lỗ hình trụ có chiều sâu khoảng bào từ thụ tầng 50% độ dày qu the, khong 3-5mm ãã 13 ô Phn ng với Hóa đen phản ứng, chuyển từ từ 5% KOH thành màu xanh nâu phơi khô cấu trúc mặt cắt ngang, tơ nấm bào tử mầu nấm đuợc mơ tả hình Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái khác mẫu nấm Pycnoporus spp (la): Mặt cắt ngang thể (1b): Sợi tơ nấm kính hiến vi 40x (1c): Bào tử nấm kính hiến vi 40x 3.2 Định danh lồi nấm phương pháp sinh học phân tử Phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS mầu nam bang cặp moi ITS1 ITS4 tạo sản phẩm có kích thước gần bang 500bps Sản phẩm PCR gửi đen Công ty Macrogen (Hàn Quốc) để tinh chế giải trình tự Trình tự giải vùng ITS cùa chững nấm phân lập sau: 3’_GCTTCGAGTCTGAGGGGTTGTAGCTGGCCTTCCGGGGCATGTGCACACCCTGCTC ATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTAGGTTTGGCGTGGGCTTCGGGGCCTCCGG GCTCTGAGGCATTCTGCCGGCCTATGTATCACTACAAACACATAAAGTAACAGAATG TATTCGCGTCTAACGCATCTAAATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGC ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA ATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTT 14 TGAGTGTCATGGAATTCTCAACCCACACGTCCTTGTGATGTTGCGGGCTTGGATTTG GAGGCTTGCTGGCCCTCTGCGGTCGGCTCCTCTTGAATGCATTAGCTTGATTCCGTGC GGATCGGCTCTCAGTGTGATAATTGTCTACGCTGTGACCGTGAAGCGTTTGGCGAGC TTCTAACCGTCCTGTATGGGACAACTTCTTGACATCTGACCTCAAATCAGGTAGGAC TACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAAAACGGGGATAAGAAA ’ macrogen File: RJTSl.abl Sample: R-ITSI GCTT Signal G: 1063 A: 1447 C.2739 T2064 Lane: 13 10 CG G T CT G Base spacing: 14.671204 GT Page I of Ì 20 30 40 so M w _ M _ 90 100 110 120 GGGOTTOT GCTGGCCTTCCGGGGC TGTGC c CCCTGCTC ICC CTCT c CCTGTGC CTT CTGT -GGTTTGGCGTGGGCTTCGGGGCCTCCGGGCTCTG G 130 140 GCATTCTGCCGGCCT -TGI TCaCTaC 2S0 IGCG T 612 bases in 7333 scans 2M TOTO 270 'TTOC G ISO c Cat 200 FTC ora IM ơr c G rcrca 170 100 190 Ĩ GT TTCGCGTCI CGC -TCI r c 290 TCTTIO 200 CTTTC GC 210 220 230 COG VTCTCTTGGCTCTCGC xTCG TG 300 IIO 120 IM 340 3S0 CGC CCTTGCGCTCCTTOGT T ĨCCG GG GC 10CCTGI I 1G GTGTC TGG 380 390 400 410 420 4M OTG TGTTGCGGGCTTGG TTTGG'GGCTTGCTGGCCCTCTOCGOTCGGCTCCTCTTG 440 430 4M 4'0 TGC TT ' GCTTG TTCCGTGCGG TCGGCTCTC ‘ ƠTGTG T A'/Aa.AvẰWA)AWìMaM.'M-A'.-A-d\\iTMvWa SOO SI0 GCOTTTGGCG-GCTTCT 320 S30 CCGTCCTOT TOGO c aWAaAma MaaAvAa ạẠaạ a S40 330 340 570 300 CTTCTTG c\TCTG CCTC ■ ’ TCVGGT GG XTT CCCGCTG >CTT1 aV/V.AA a.Wa aaaA M 390 GC'TATC AAAzAVt G 240 CGC'GCO 3M 370 TTCTC CCCACaCOTCCTT 4M 490 \TTGTCT'-CGCTGTG CCGTG Íí MM AWA M0 410 CGGGGT\G - g———■ Hình 3.2 Kết sequencing vùng ITS mẫu nấm phân lập thực bới công ty Macrogen (Hàn Quốc) Ket quà BLAST với ngân hàng trình tự NCBI (Trung tâm Thơng tin Cơng nghệ sinh học Quốc gia, Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ) cho két trùng khớp tới 99,9% với loài Trametes sanguinea, hay ngày Pycnoporus sanguineus (L.) Murrill (1904) 15 3.3 Khảo sát tốc độ sinh trưởng tơ nấm môi trường thạch dinh dưỡng Tốc độ tâng trưởng cùa loài nấm Pycnoporus sanguineus khào sát vịng ngày so sánh đây: • Nhóm 1: Mơi trường Czapez, mơi trường PDA, mơi trường PDA bo sung 1% cao nam men, môi trường Saboraugh, môi trường Tryptic soy agar TSA, môi trường thạch Glucose 2% (Bảng 3.2, hình 3.3) Bảng 3.2: Tốc độ phát triển tơ nấm Pycnoporus sanguineus loại thạch môi trường, (đon vị: mm) Ngày Loại môi trường Czapez Medium Potato dextrose medium Potato dextrose bô sung yeast extract Saboraugh medium Tryptic soy medium Malt extract agar Glucose 2% 0 1,5 1,2 0,9 4,5 5,5 5,5 10,5 9,8 11,2 15 15,4 16 21.5 21 23,5 28.8 29 30 35,6 37 39 0 0 0,2 0,9 1,9 3,5 8.5 3,5 9,3 8,5 12 14,8 13 16 20,5 18.5 22 12 27,2 24.1 28 13,5 36 31,5 Hình 3.3 So sánh Tốc độ phát triển chủng Pycnoporus sanguineus loại thạch môi trường khác 16 Ket khảo sát tốc độ tăng trưởng cùa loài nấm Pycnoporus sanguineus loại môi trường dinh dường cho thấy môi trường thạch khoai tây PDA PDA bổ sung cao nấm men cho tốc độ phát triển cùa sợi tơ nam lên cao nhất, ke đen Malt extract agar, Crapez, Saborough môi trường Glucose 2% Môi trường Tryptic soy agar TSA cho ket quà mọc tơ nấm chậm rõ rệt loại Tuy nhiên tốc độ mọc lan cùa tơ nấm nhanh chưa hẳn chứng minh loại mơi trường tốt cho q trình sinh trường phát triển bình thường lồi nấm Qua kết quà đánh giá hình thái sac tố cùa tơ nấm sau ngày phát triển dĩa thạch (Hình 3.4), có the thấy bên cạnh tốc độ mọc lan cũa tơ nấm, loại môi trường khác có ánh hưởng định đen khả sinh sắc tố độ dày mật độ tơ nam phát triển Môi trường PDA bồ sung cao nấm men (hình 3.4B) cho Pycnoporus sanguineus khà phát triển tốt với mật độ tơ nấm dày hình thành sắc tố rõ ràng loại mòi trường thừ nghiệm Tuy tốc độ phát triển cùa môi trường thạch Glucose 2% (Hình 3.4E) khơng thua tốc độ phát triển PDA, quan sát thấy chì mồi Glucose khơng đũ cho sinh trưởng bình thường cùa loài nấm này, với lớp tơ nấm mọc mỏng sau ngày, gần suốt không he có sắc tố sinh Hình 3.4 Hình thái to- nấm Pycnoporus sanguineus môi trường dinh dưỡng khác sau ngày phát triển A: Môi trường Malt extract agar B: Môi trường PDA bổ sung cao nam men C: Môi trường Czapez D: Môi trường Saboraugh E: Mỏi trường Glucose 2% F: Môi trường PDA khơng cao nấm men 17 • Nhóm 2: mơi trường thạch Glucose 0.5%, 1%, 1.5% 2% Bảng 3.3: Tốc độ phát triển chủng Pycnoporus sanguineus loại thạch glucose với nồng độ khác Đơn vị: nun Ngày Loại môi trường^^ Glucose 0.5% 1,3 4,5 9,6 13,5 18,4 23,5 31 Glucose 1% 0,6 4,5 9,8 14,2 19,5 25,5 33 Glucose 1.5% 1,1 3,9 9,5 13,5 19 26,5 34 Glucose 2% 8,5 13 18,5 24,1 31,5 Glucose 0.5% B Glucose 1% À Glucose 1.5% ' ■■>
Ngày đăng: 10/11/2022, 19:44
Xem thêm:
