TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ NHỰA POLYETHYLENE
Polyethylen được tổng hợp lần đầu tiên bởi nhà hoá học người Đức Hans von Pechman vào năm 1898, một cách tình cờ trong quá trình ông nghiên cứu diazomethane Khi các đồng nghiệp của ông khảo sát hợp chất màu trắng, nhờn như mỡ sáp mà ông đã tổng hợp, họ nhận thấy nó chứa mạch dài -CH2- và đặt tên nó là polymethylene
Polyethylene hoặc polythene (PE), được coi là loại nhựa phổ biến nhất trên thê giới Tính đến năm 2017, hơn 100 triệu tấn nhựa PE được sản xuất hàng năm, chiếm 34% tổng thị trường nhựa (Geyer và cộng sự, 2017) Nhiều loại PE được biết đến, với hầu hết có công thức hóa học (C2H4)n PE thường là hỗn hợp các polyme với nhiều nhóm C2H4 liên kết với nhau bằng liên kết hydro
Polyethylene là một polyme tổng hợp có khối lượng phân tử cao chứa cấu trúc của hydrocacbon no mạch thẳng
Quá trình trùng hợp ethylene dẫn đến các chuỗi hydrocacbon dài mạch thẳng phân nhánh theo nhiều hướng khác nhau Mức độ phân nhánh này quyết định loại polyethylene Sử dụng các loại polyethylene khác nhau có một số ưu điểm, chẳng hạn như chúng có điểm nóng chảy và đông đặc rất cao Chúng được phân loại là polyethylene mật độ cao (HDPE), mật độ thấp (LDPE), mật độ thấp mạch thẳng (LLDPE)
1.2 Hiện trạng rác thải nhựa ở nước ta
Những con số thống kê lượng sử dụng túi nilon, chai nhựa cho thấy tình hình rác thải nhựa ở Việt Nam thật đáng lo ngại
Theo Bộ Tài nguyên và Môi trường, mỗi tháng, mỗi gia đình sử dụng đến 1kg túi nilon Ở những thành phố lớn như Hà Nội và Hồ Chí Minh, số lượng rác thải nhựa mỗi ngày thải ra môi trường lên tới 80 tấn Còn theo thống kê của Hiệp hội nhựa Việt Nam thì trong khoảng thời gian 1990 – 2015 số lượng tiêu thụ nhựa ở Việt Nam đã tăng lên chóng mặt, từ 3,8 kg/người/năm lên đến 41 kg/ người/ năm
Tuy nhiên việc thu hồi và xử lý rác thải tại Việt Nam còn rất hạn chế Lượng chất thải nhựa và túi nilon ở Việt Nam, chiếm khoảng 8-12% chất thải rắn sinh hoạt Nhưng 10% số lượng chất thải nhựa và túi nilon không được tái sử dụng mà thải bỏ hoàn toàn ra ngoài môi trường Lượng chất thải nhựa và túi nilon thải bỏ ở Việt Nam xấp xỉ khoảng 2,5 triệu tấn/năm Đây là một “gánh nặng” cho môi trường, thậm chí có thể dẫn đến thảm họa “ô nhiễm trắng” mà các chuyên gia đã gọi
Rác thải nhựa có thời gian phân hủy rất dài lên đến cả 100 năm thậm chí 1000 năm, chúng sẽ bị phân rã thành các mảnh nhựa siêu nhỏ, những hạt vi nhựa (microplastic) này đi vào nguồn nước, đất, không khí, thức ăn… và khi con người tiếp xúc, ăn phải những mảnh vi nhựa này thì sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe Đây cũng là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh nguy hiểm như bệnh về hô hấp, bệnh về thần kinh,…
Ngoài ra, theo các nhà khoa học việc xử lý rác thải nhựa bằng cách đốt cũng gây ra nhiều nguy hiểm cho sức khoẻ cả cộng đồng vì khi đốt rác thải nhựa sẽ tạo ra khí dioxin và furan… gây khó thở, rối loạn tiêu hoá, làm tăng khả năng ung thư.
TỔNG QUAN VỀ BƯỚM SÁP Achroia grisella
2.1 Giới thiệu về bướm sáp
Bướm sáp (Lesser wax moth) có tên khoa học là Achroia grisella, thuộc giới
Animalia, ngành Athropoda, lớp Insecta, bộ Lepidotera, họ Pyralidae, chi Achroia, loài A grisella
Loài được mô tả đầu tiên bởi Johan Christian Fabricius vào năm 1794 Con trưởng thành dài khoảng 0,5 inch (13 mm) và có đầu màu vàng riêng biệt với thân màu xám bạc hoặc màu be Trong tự nhiên, ấu trùng của loài bướm này sống như những ký sinh trùng làm tổ trong các đàn ong và ăn kén, phấn hoa, sáp ong, do đó có tên gọi là sâu sáp
Bướm sáp phân bố khắp nơi trên thế giới, đặc biệt những nơi có tổ ong, phát triển mạnh hơn ở các vùng cận nhiệt và nhiệt đới,chúng phân bố ở hầu hết Châu Phi (bao gồm Madagascar, Úc , Châu Âu và Bắc Mỹ Ấu trùng sâu sáp được sử dụng như là nguồn thức ăn lí tưởng cho nhiều loài động vật và thực vật ăn côn trùng Ngoài ra,
VƯƠNG GIA THANH 14 chúng cũng được sử dụng để làm thức ăn cho người, cũng như thức ăn sống cho vật nuôi và một số loài chim cảnh do hàm lượng chất béo cao, dễ sinh sản và khả năng tồn tại trong nhiều tuần ở nhiệt độ thấp
2.2 Giới thiệu về bướm sáp Achroia grisella
Hình 1 Bướm sáp Achroia grisella ( Nguồn internet ) Bướm sáp (Lesser wax moth) có tên khoa học là Achroia grisella, thuộc giới
Animalia, ngành Athropoda, lớp Insecta, bộ Lepidotera, họ Pyralidae, chi Achroia, loài A.grisella Vòng đời của bướm sáp gồm 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng, bướm trưởng thành
Thức ăn của bướm sáp là sáp ong, sáp ong là một dạng polymer, chất dẻo tự nhiên và có cấu trúc hóa học tương tự polyethylene
2.3 Sâu sáp và hệ vi sinh vật nội sinh đường ruột của sâu sáp Achroia grisella trong xử lý rác thải nhựa. Đến nay, các nhà nghiên cứu vẫn đang cố gắng phát hiện các vi sinh vật phân giải
PE thông qua các thử nghiệm liên quan đến đất bị ô nhiễm chất thải nhựa, bãi chôn lấp, phân trộn và biển sự sống và đã phân lập được một số chủng vi khuẩn Một số chủng vi khuẩn này đã cho thấy khả năng sử dụng PE làm nguồn cacbon dựa trên đặc điểm của sự hình thành màng sinh học trên màng PE, giảm trọng lượng vật liệu
PE, sự suy giảm bề mặt và những thay đổi trong tính chất cơ và nhiệt của PE Tuy nhiên, các báo cáo đầy hứa hẹn này về sự phân hủy của PE dựa trên việc thay đổi khối lượng vẫn chưa được xác nhận do không cung cấp được bằng chứng hỗ trợ chứng minh cho việc này, chẳng hạn như những thay đổi về tính kỵ nước ở bề mặt
VƯƠNG GIA THANH 15 của tấm nilon, sự hình thành của các nhóm cacbonyl bị oxy hóa, sự đứt gãy của các chuỗi phân tử dài (Yang Jung và cộng sự, 2014)
1 Kể từ đầu những năm 1970, các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu sự phân hủy sinh học của Polyethylene và tìm thấy một số chủng phân hủy Polyethylene nhất định, bao gồm Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Brevibacterium, Nocardia, Moraxella, Penicillium và Aspergillus từ đất, biển và bùn thải trong tự nhiên Tuy nhiên, tính kỵ nước mạnh, năng lượng liên kết hóa học cao và trọng lượng phân tử cao của PE cản trở sự phân hủy hiệu quả của nó đối với hầu hết các chủng, đặc biệt là trong thời gian ngắn Người ta đã chỉ ra rằng sự phân huỷ PE do nấm Penicillium simplicissimum và Nocardia asteroides có thể mất vài tháng hoặc thậm chí lâu hơn
2 Yang Jun và cộng sự (2014) đã báo cáo rằng PE có thể bị phân hủy đáng kể bởi vi sinh vật của sâu sáp Ấn Độ, hai chủng vi khuẩn nội sinh Enterobacter asburiae YT1 và Bacillus sp YP1, đã được phân lập từ ruột sâu sáp Sau thời gian ủ 60 ngày, khoảng 6% và 11% màng PE bị phân huỷ bởi YT1 và YP1 Những kết quả này chỉ ra rằng côn trùng có thể là một nguồn đầy hứa hẹn để thu được các vi sinh vật phân giải PE Tương tự, Paolo Bombelli và cộng sự nhận thấy rằng túi nhựa PE bị mất khối lượng 92 mg sau khi tiếp xúc với khoảng 100 con sâu sáp, và ethylene glycol được tạo ra trong 12 giờ (Liu Ren và cộng sự, 2019)
3 Liu Ren và cộng sự (2019) đã phân lập được chủng vi khuẩn Enterobacter sp D1 từ ruột sâu sáp Galleria mellonella và chủng vi khuẩn này có khả năng phân hủy màng polyethylene
4 Adriana Chalup và cộng sự ( 2018) đã nghiên cứu rằng loài bướm sáp Achroia grisella phá hại tổ ong có khả năng tiêu thụ túi silo (túi silo có thành phần gồm ba lớp polyethylene và một lớp chống tia cực tím dùng để quản lí tổ ong)
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG
1.1 Thiết bị và dụng cụ
- Tủ cấy vô trùng - Tủ sấy
- Nồi hấp (autoclave) - Tủ lạnh
- Kính hiển vi - Tủ ấm
- Ống nghiệm - Đũa thủy tinh
- Đĩa petri - Que cấy vòng
- Pipet (thủy tinh và micropipet) - Đèn cồn
- Máy đo pH - Cân phân tích
1.2 Hóa chất và môi trường
- Thuốc nhuộm: bộ nhuộm Gram
- Hóa chất: Ethanol 70 0 , Ethanol 96 0 , SDS (Sodium dodecyl sunfate), NaCl, D- glucose.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng ăn nhựa polyethylene và polypropylene của sâu sáp ở các tuổi trong giai đoạn ấu trùng
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức ứng với 5 tuổi của giai đoạn ấu trùng bướm sáp và nghiệm thức đối chứng với 3 lần lặp lại
Bảng 1: Bảng nghiệm thức thí nghiệm
Nghiệm thức Số sâu trong mỗi nghiệm thức (con)
A: Nghiệm thức gồm 30 ấu trùng sâu sáp tuổi 1 và 1g polyethylene/polypropylene B: Nghiệm thức gồm 30 ấu trùng sâu sáp tuổi 2 và 1g polyethylene/polypropylene
Hình 2: Bố trí thí nghiệm
C: Nghiệm thức gồm 30 ấu trùng sâu sáp tuổi 3 và 1g polyethylene/polypropylene D: Nghiệm thức gồm 30 ấu trùng sâu sáp tuổi 4 và 1g polyethylene/polypropylene E: Nghiệm thức gồm 30 ấu trùng sâu sáp tuổi 5 và 1g polyethylene/polypropylene
- Cân lại khối lượng nilon polyethylene, polypropylene sau 5, 10, 15, 20 ngày kể từ ngày thả sâu
• Chỉ tiêu theo dõi và phương pháp tính chỉ tiêu:
- Tỉ lệ sống sót của sâu sáp sau 5, 10, 15, 20 ngày ăn nilon: là tỉ lệ % giữa số sâu sống và tổng số sâu sau 5, 10, 15, 20 ngày
- Phần trăm nilon tổn thất được tính bằng cách sử dụng công thức sau (Das và
H: Hiệu xuất phân hủy nhựa
T: Khối lượng nilon đầu ở các nghiệm thức
S: Khối lượng nilon còn lại sau 5, 10, 15, 20 ngày
2.2 Thí nghiệm 2: Phân lập hệ vi vật đường ruột sâu sáp Achroia grisella
- Khử trùng mẫu sâu: ngâm mẫu trong cồn 75 0 trong 1 phút, rửa mẫu 2 lần với nước muối 0,85% NaCl, cắt rút đường ruột của sâu cho vào ống falcon chứa
40 ml nước muối và vortex trong 5 phút
- Hỳt 200 àl dịch cấy trang vào mụi trường SNB (Solid Nutrient Broth) nuụi cấy trong 24 giờ
- Làm thuần vi khuẩn nội sinh bằng phương pháp cấy ria trên môi trường SNB (Solid Nutrient Broth)
- Quan sát đặc điểm khuẩn lạc: màu sắc, hình dáng, …
- Nguyên tắc: Sự khác nhau giữa vách tế bào Gram (+) và Gram (-) làm cho khả năng bắt màu màng tế bào với thuốc nhuộm khác nhau giữa hai nhóm vi khuẩn Dựa vào đặc điểm này người ta phân thành hai nhóm vi khuẩn
• Nhỏ giọt nước lên một phiến kính sạch Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính cho đến khô
• Phủ hoàn toàn vết bôi với crystal violet Để yên 1 - 2 phút rồi nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm dư bằng nước
• Nhỏ dung dịch lugol trong khoảng 30 giây rồi lại rửa nhẹ nhàng với nước
• Tẩy cồn 96 o từ 15 - 30 giây, sau đó rửa nước Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin O và để yên trong 1 phút Rửa với nước
• Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, đặt lamen lên và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính x100 (Trần Linh Thước, 2007)
2.3 Thí nghiệm 3: Sàng lọc các chủng vi khuẩn từ đường ruột sâu sáp có khả năng phân hủy nhựa polyethylene
- Cấy các chủng vi khuẩn vừa phân lập được vào bình serum chứa 40 ml môi trường LCFBM (Liquid carbon – free basal medium) chứa tấm nilon polyethylene kích thước 3×3 cm Các bình serum không được cấy vi khuẩn sẽ là nghiệm thức đối chứng
- Nuôi lỏng lắc 220 vòng/ phút và ủ ở nhiệt độ 37 o C trong 60 ngày
- Sau 60 ngày, các tấm nilon sẽ được thu thập và được rửa bằng SDS (Sodium dodecyl sulfate) 2% và rửa bằng nước cất 3 lần để loại bỏ màng biofilm vi khuẩn bám trên bề mặt tấm nilon, sau đó cân bằng phân tích để xác định khối lượng polyethylene hao hụt Phần trăm nilon tổn thất được tính bằng cách sử dụng công thức sau (Das và Kumar, 2015):
H: Hiệu xuất phân hủy nhựa (%) T: Khối lượng nilon đầu ở các nghiệm thức
S: Khối lượng nilon còn lại sau 5, 10, 15, 20 ngày
- Các vi khuẩn phát triển trong môi trường LCFBM chứa tấm polyethylene, được coi là khuẩn lạc sàng lọc sơ cấp để tìm vi khuẩn phân hủy PE
2.4 Thí nghiệm 4: Định danh các chủng vi sinh vật đường ruột có khả năng phân hủy nhưa bằng kĩ thuật sinh học phân tử
❖ Li trích DNA vi khuẩn ( theo Võ Thị Xuân Hương và cộng sự, 2018)
DNA vi khuẩn được li trích bằng phương pháp đun sôi:
- Mẫu vi khuẩn được nuôi cấy tăng sinh ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Sau đó hút 1ml tăng sinh vi khuẩn cho vào ống tube eppendorf 1,5ml ly tâm 8000 vòng /phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy thu kết tủa
- Sau đó thêm 300ul TE buffer, votex để trộn đều tế bào vi khuẩn Cho vào nồi nước đang sôi ở 100°C trong vòng 15 phút Sau đó sốc nhiệt ở – 20°C trong
5 phút và ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút
- Tiếp tục hút 200ul dung dịch nổi phía trên cho vào ống tube 1,5ml mới, cho thêm 20ul CH3COONa, 600ul Etanol 70% ủ trong tù - 20°C trong 1 đến 2
Bảng 2: Bố trí thí nghiệm Hình 3: Bố trí thí nghiệm
VƯƠNG GIA THANH 22 giờ Ly tâm 13000 vòng/phút, bỏ dịch nổi để khô trong 10 phút ở nhiệt độ phòng
- Cuối cùng cho thêm 50ul TE buffer hoặc nước cất khử ion Bảo quản mẫu DNA ở - 20°C
- Đo OD để kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ của DNA
- Phản ứng tiến hành với cặp mỗi không chuyên biệt nhằm khuếch đại vùng gen 16S rRNA
- Thực hiện phản ứng PCR với tổng thể tích 25ul: 1,25ul primer-F; 1,25ul primer-R; lui mẫu DNA: 12,5ul GoTaq polymerase vào ống tube PCR Bổ sung thêm 9ụl nước cất khử ion Tất cả đều được trộn đều trước khi thực hiện phản ứng PCR
- Quy trình chạy phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt như sau: 95°C trong 4 phút, sau đó lặp lại 30 chu kỳ với các bước như sau: Biến tỉnh 95°C trong 30 giây, bắt cặp mồi ở 53°C trong 30 giây, tổng hợp DNA ở 72°C trong
1 phút Cuối cùng phản ứng duy trì ở 72°C trong 5 phút Bảo quản ở 4°C
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, trong dung dịch đệm TBE buffer 0,5X ở 100V, 90mA trong 20 phút Trộn đều mẫu và loader với tỉ lệ: 0,5ul loadingdye buffer 6X và 5ul sản phẩm PCR vào trong các giếng của gel ( Võ Thị Xuân Hương và cộng sự, 2018)
❖ Giải trình tự và xây dựng cây phát sinh loài
- Kết quả PCR được gửi đi giải trình tự ở công ty 1st Base Malaysia
- Định danh bằng phương pháp: BLAST, dựng cây phát sinh loài bằng phương pháp Maximum Likelihood
2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của chủng vi khuẩn đã phân lập
Tất cả số liệu thu được trong đề tài được phân tích thống kê ANOVA (Analysis of Variance) dưới bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely Randomized Design) Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần và thống kê bằng phần mềm Statgraphic version 3.0
Tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi trường Nutrient Broth trong 24h sau đó cấy trang trên môi trường SNB (Solid Nutrient Broth) Ủ đĩa petri ở nhiệt độ 20 o , 30 o và nhiệt độ phòng và tính toán mật độ vi khuẩn dựa theo công thức :
A : số tế bào vi khuẩn trong 1ml mẫu
N : tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
Ni : số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V : thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
Fi : độ pha loãng tương ứng
Tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi trường Nutrient Broth trong 24h sau đó cấy trang trên môi trường SNB (Solid Nutrient Broth) pH môi trường 6,0; 7,0; 8,0 và đo mật độ vi khuẩn bằng công thức như trên và tính toán mật độ vi khuẩn dựa theo công thức :
- N là số vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra (được tính bằng CFU/ ml)
- C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa petri được giữ lại;
- n1 là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;
- n2 là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;
- d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất
- V là thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa
