Phân lập và đánh giá khả năng phân hủy nhựa polyethylene của vi khuẩn đường ruột sâu sáp Achroia grisella

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thí nghiệm 2: Phân lập hệ vi vật đường ruột sâu sáp Achroia grisella - Khử trùng mẫu sâu: ngâm mẫu trong cồn 750 trong 1 phút, rửa mẫu 2 lần với. - Làm thuần vi khuẩn nội sinh bằng phương pháp cấy ria trên môi trường SNB (Solid Nutrient Broth). Khi phiến kính khô hoàn toàn, đặt lamen lên và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính x100 (Trần Linh Thước, 2007).

Thí nghiệm 3: Sàng lọc các chủng vi khuẩn từ đường ruột sâu sáp có khả năng phân hủy nhựa polyethylene. - Cấy các chủng vi khuẩn vừa phân lập được vào bình serum chứa 40 ml môi trường LCFBM (Liquid carbon – free basal medium) chứa tấm nilon polyethylene kớch thước 3ì3 cm. - Sau 60 ngày, các tấm nilon sẽ được thu thập và được rửa bằng SDS (Sodium dodecyl sulfate) 2% và rửa bằng nước cất 3 lần để loại bỏ màng biofilm vi khuẩn bám trên bề mặt tấm nilon, sau đó cân bằng phân tích để xác định khối lượng polyethylene hao hụt.

- Các vi khuẩn phát triển trong môi trường LCFBM chứa tấm polyethylene, được coi là khuẩn lạc sàng lọc sơ cấp để tìm vi khuẩn phân hủy PE. Thí nghiệm 4: Định danh các chủng vi sinh vật đường ruột có khả năng phân hủy nhưa bằng kĩ thuật sinh học phân tử. Sau đó hút 1ml tăng sinh vi khuẩn cho vào ống tube eppendorf 1,5ml ly tâm 8000 vòng /phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy thu kết tủa.

- Định danh bằng phương pháp: BLAST, dựng cây phát sinh loài bằng phương pháp Maximum Likelihood. Thí nghiệm 5: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của chủng vi khuẩn đã phân lập. Tất cả số liệu thu được trong đề tài được phân tích thống kê ANOVA (Analysis of Variance) dưới bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely Randomized Design).

Tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi trường Nutrient Broth trong 24h sau đó cấy trang trên môi trường SNB (Solid Nutrient Broth). N : tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn Ni : số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i. - N là số vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra (được tính bằng CFU/ ml) - C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa petri được giữ lại;.

Hiệu suât ăn nhựa của ấu trùng sâu sáp

• Giá trị phần hiệu suất ăn nilon polyethylene của sâu sáp đã được chuyển đổi. - Hiệu suất ăn nhựa polyethylene cao hơn hiệu suất ăn nhựa polypropylene sau 10 ngày, sau 15, 20 ngày và có sự khác biệt qua thống kê. ❖ Giá trị phần trăm sống sót của sâu sáp đã được chuyển đổi arcsin trước khi xử lí thống kê.

Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05 qua phép thử Duncan. - Giá trị phần trăm sống sót của sâu sáp đã được chuyển đổi arcsin trước khi xử lí thống kê. ❖ So sánh tỉ lệ sống chết của sâu sáp ăn nhựa polyethylene và polypropylene Bảng 8.

Qua thống kê cho thấy tỉ lệ sống sót của sâu sáp ăn nhựa polyethylene và polypropylene có sự khác biệt có ý nghĩa qua thống kê. Kết quả cho thấy ấu trùng sâu sáp ở tất cả các tuổi đều có khả năng tiêu thụ polyethylene và polypropylene qua việc hoàn thành vòng đời của chúng ( thành bướm). Tỉ lệ sống sót và hiệu suất tiêu thụ poplyethylene và polypropylene ở tuổi 1,2 thấp nguyên nhân có thể là do hệ thống nhai chưa hoàn thiện, sự thích ứng với sự thay đổi môi trường, sự thay đổi thức ăn yếu.

Qua thống kê, hiệu suất tiêu thụ và tỉ lệ sống sót của ấu trùng sâu sáp với 2 nguồn thức ăn polyethylene và propylene sau 5,10 ngày không có sự khác biệt có ý nghĩa, sau 10, 15 ngày có sự khác biệt có ý nghĩa.

THÍ NGHIỆM 4: ĐỊNH DANH CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT SÂU SÁP BẰNG KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

Chủng T1 có tiềm năng trong phân hủy nhựa polyeythylene so với các chủng vi khuẩn khác nên chúng tôi đã chọn chủng vi khuẩn này để định danh. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy có khối lượng phân tử khoảng 1,5 kb. Băng điện di cho thấy nồng độ DNA không cao, ít bị đứt gãy ( vệt sáng lớn).

Tuy nhiên, có vệt mờ ở phía trên của băng điện di cho thấy DNA bị nhiễm protein ( do protein có kích thước lớn). Điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Lucia Giacomucci và cộng sự (2019), chủng Bacillus flexus có khả năng tạo màng biofilm ở bề mặt tấm nhựa và làm giảm khối lượng của tấm nhựa polyvinyl chloride. Arkatkar và cộng sự (2010) cũng đã chứng minh rằng chủng Bacillus flexus giúp giảm khối lượng của nhựa 2.5% sau 1 năm nuôi cấy.

Trong số các enzymes có khả năng oxy hoá thì laccase đã được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, dệt may, và các ngành công nghiệp khác như là một loại enzyme phân huỷ các sản phẩm nguy hiểm. Qua thống kê cho thấy khả năng phát triển của các chủng vi khuẩn giữa các nồng độ pH có sự khác biệt có ý nghĩa (P=0,000). VƯƠNG GIA THANH 41 Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05 qua phép thử Duncan.

Qua thống kê cho thấy khả năng phát triển của các chủng vi khuẩn giữa các nồng độ pH có sự khác biệt có ý nghĩa (P=0,000). Qua thống kê cho thấy khả năng phát triển của các chủng vi khuẩn giữa các nồng độ pH có sự khác biệt có ý nghĩa (P=0,000). Liu Ren và cộng sự (2019) đã phân lập được chủng vi khuẩn Enterobacter sp D1 từ ruột sâu sáp Galleria mellonella; Yang Jun và cộng sự (2014) đã phân lập được hai chủng vi khuẩn nội sinh Enterobacter asburiae YT1 và Bacillus sp.

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu về khả năng phân hủy nhựa ở các chủng vi khuẩn nội sinh trong hệ đường ruột sâu sáp nhưng vẫn chưa có báo cáo nào nói về cơ chế chuyển hóa của các chủng vi sinh.