VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện trong thời gian từ 10/2015– 05/2016 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 3), 68 Lê Thị Trung, TP Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương.
VẬT LIỆU
Các mẫu rễ, thân và lá cây cỏ hôi khỏe mạnh được thu hái từ thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương và quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh
Các chủng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở – Tp Hồ Chí Minh, gồm các chủng:
− Vi khuẩn gây bệnh thông thường: E coli, S aureus, S typhi, P.aeruginosa
− Vi nấm gây bệnh thông thường: T rubrum
Chủng vi khuẩn sinh enzym carbapenemase được cung cấp bởi Khoa Xét Nghiệm, Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh
2.2.2 Thiết bị, dụng cụ, môi trường
Tủ cấy vô trùng, nồi hấp (autoclave), kính hiển vi, tủ sấy, tủ lạnh, tủ ấm, microwave, cân phân tích, máy ly tâm, bộ lọc,…
2.2.2.2 Dụng cụ Ống nghiệm, đĩa petri, lame, becher, erlen, ống đong, phễu, bộ nhuộm gram, que cấy, que cấy trang, đèn cồn, kẹp gắp, cây đục lỗ,…
− Môi trường NA (Nutrient Agar)
− Môi trường NB (Nutrient Broth)
− Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)
− Môi trường SDA (Sabouraud Dextrose Agar)
− Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar)
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 20
− Môi trường thạch bán lỏng di động
− Thuốc nhuộm tím kết tinh (Crystal violet)
− Thuốc thử: Dung dịch α – naphthon 5 %, dung dịch KOH 40 %, Gress A (acid sulfanilic), Gress B (α – naphthylamin), Kovac’s, H2O2 5 %,
Phương pháp thí nghiệm
Mẫu cây cỏ hôi khỏe mạnh Xác định tên khoa học cây thuốc
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 21
Hình 2 1: Quy trình bố trí thí nghiệm 2.3.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật nội sinh
Mẫu cây cỏ hôi được chọn là những cây khỏe mạnh, lá xanh tốt, không mắc bệnh và tăng trưởng tốt Nên chọn những cây có cảm quan tối ưu nhất tại vị trí lấy mẫu (Roy và cs., 2010) Sau khi lấy mẫu được gửi định danh tại trường đại học Khoa Học
Lấy mẫu: mẫu được thu ở lúc sáng sớm hay chiều mát, thu toàn bộ cây rồi rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá; sau đó cắt rời rễ và thân cây ra
Phân lập vi khuẩn nội sinh trên môi trường TSA, phân lập vi nấm nội sinh trên môi trường PDA
Khảo sát đại thể, vi thể vi sinh vật nội sinh
Bảo quản chủng vi sinh vật nội sinh Đánh giá khả năng kháng khuẩn kháng nấm gây bệnh của chủng vi sinh vật nội sinh Định danh các chủng nội sinh có hoạt tính đa kháng
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 22
Để loại bỏ các vi sinh vật có thể bám trên bề mặt mẫu, mẫu được rửa sạch dưới vòi nước mạnh, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng Mẫu được cắt thành những đoạn nhỏ và khử trùng bằng cồn 70%, sodium hypochloride 2,5% và ethanol Sau đó, mẫu được rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng để loại bỏ hóa chất Để kiểm tra hiệu quả khử trùng, nước cất rửa mẫu được cấy vào đĩa môi trường TSA và ủ ở 37oC Nếu sau 24 giờ ủ không xuất hiện khuẩn lạc thì mẫu đã được khử trùng đạt yêu cầu.
⮚ Phân lập vi khuẩn nội sinh
Mẫu sau khi mẫu đã xử lý xong, tiến hành phân lập trên môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) ủ 30 0 C trong điều kiện có ánh sáng trong 48 giờ để cho sự phát triển của vi khuẩn nội sinh (Roy và cs., 2010)
⮚ Phân lập vi nấm nội sinh
Phương pháp tiến hành: cắt nhỏ mẫu lá sau khi được xử lý, tiến hành phân lập trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) có bổ sung kháng sinh cloramphenicol 0,05
% và bọc kín parafilm ủ ở 27 ± 2 0 C từ vài ngày cho đến 2 tháng để cho sự phát triển của vi nấm nội sinh (Kafur, 2011; Idris, 2013)
⮚ Đối với vi khuẩn nội sinh
Sau khi ủ, khuẩn lạc có hình thái khác nhau đã được lựa chọn và tiến hành cấy ria nhiều lần trên đĩa NA và ủ ở 28 0 C trong 48 giờ để làm thuần vi khuẩn nội sinh Tiến hành cấy ria nhiều lần trên môi trường NA cho đến khi thu được khuẩn lạc có độ đồng đều về hình dạng, màu sắc Quan sát, nhận xét về đặc điểm hình thái như: màu sắc, hình dạng, kích thước, viền, bề mặt của khuẩn lạc (Arunachalam và cs., 2010)
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 23
Lưu ý, từ một khuẩn lạc lấy từ mẫu thí nghiệm ta có thể có được ít nhất một chủng nội sinh
Các chủng vi khuẩn đã được thuần hóa được cấy giữ vào ống thạch nghiêng NA và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 độ C Từ các khuẩn lạc thu được trên mẫu lá, các nhà nghiên cứu đã phân lập được ít nhất một chủng vi sinh vật nội sinh.
⮚ Đối với vi nấm nội sinh
Ghi nhận lại hình dạng, màu sắc, kết quả vi nấm nội sinh
Sau đó tiến hành tách khuẩn lạc vi nấm và cấy từ các đĩa mọc lên từ lần phân lập đầu tiên lên môi trường PDA, lặp lại cho đến khi thu được khuẩn lạc vi khuẩn và sợi nấm thuần khiết có độ đồng đều về hình dạng và màu sắc (Roy và cs., 2010; Kafur và cs., 2011) Từ các khuẩn lạc trên mẫu lá phân lập được ít nhất 1 chủng vi sinh vật nội sinh (Phạm Quang Thu và cs., 2012)
2.3.2.5 Quan sát đại thể, vi thể
⮚ Đối với vi khuẩn nội sinh
Xác định đặc điểm hình thái: hình dạng, kích thước và màu sắc của khuẩn lạc
Bảng 2 1: Các chỉ tiêu quan sát đại thể vi khuẩn trên thạch
Các chỉ tiêu đánh giá Mô tả
Hình dạng Hình dáng mép (tròn, răng cưa,…), có núm hay không
Kích thước Độ dày, đường kính… Độ trong, màu sắc Trên, dưới, có hay không khuếch tán ra môi trường xung quanh
Mùi khuẩn lạc Có/ không mùi
Khả năng sinh sắc tố huỳnh quang Có/ không
Nhuộm Gam, quan sát các chủng vi khuẩn phân lập được dưới kính hiển vi (Arunachalam và cs., 2010)
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 24
Phản ứng nhuộm Gram được thực hiện để xác định hình dạng tế bào vi khuẩn (cầu hoặc trực), cách sắp xếp (đơn lẻ, chuỗi hoặc chùm), cũng như để phân biệt tính chất bắt màu Gram âm (-) hoặc Gram dương (+) Quy trình tiến hành gồm các bước: đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh hình chữ U.
Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
Tẩy màu bằng cồn 96 o , khoảng 15 - 20 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô
Nhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin trong 30 giây, rửa nước, thấm khô Quan sát bằng vật kính dầu, độ phóng đại 1.000 lần
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím crystal violet, vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng safranin
Bảng 2 2: Các chỉ tiêu quan sát vi thể vi khuẩn trên kính hiển vi
Các chỉ tiêu đánh giá Mô tả
Hình thái Trực, cầu, chùy
Cách sắp xếp Riêng lẻ, chuỗi, tụ,…
Cách bắt màu Tím, hồng
⮚ Đối với vi nấm nội sinh:
Khảo sát đại thể: bằng mắt thường, hay dùng kính lúp cầm tay nhận xét về kích thước, màu sắc,… của khuẩn lạc vi nấm nội sinh
Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên thạch và kính hiển vi (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2003; Nguyễn Lân Dũng và cs., 2006):
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 25
Bảng 2 3: Các chỉ tiêu quan sát nấm sợi trên thạch
Các chỉ tiêu đánh giá Mô tả
Kích thước Đường kính, chiều dày
Dạng bề mặt Nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, có khía hay không,…
Màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới Vàng, đỏ, đen, nâu, xám,…
Dạng mép khuẩn lạc Mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo,…
Giọt tiết (nếu có) Nhiều, ít, màu sắc
Mùi khuẩn lạc Có/ không mùi
Sắc tố hoà tan Màu của môi trường xung quanh khuẩn lạc (nếu có)
Các cấu trúc khác Bó sợi, bó giá, các cấu trúc mang bào tử trần như: đĩa giá hoặc túi giá, đệm nấm, hạch nấm,
Để quan sát vi nấm nội sinh, tiến hành làm tiêu bản nấm và quan sát hình thái học dưới kính hiển vi, sử dụng vật kính với độ phóng đại 10X và 40X.
Bảng 2 4: Các chỉ tiêu quan sát vi thể nấm sợi
Các chỉ tiêu đánh giá Mô tả Đặc điểm của sợi nấm Màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn Đặc điểm của cơ quan sinh sản Hình dạng, cách sắp xếp các bộ phận của cơ quan sinh sản
Bào tử Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp của bào tử
Làm tiêu bản nhuộm nấm, tiến hành theo các cách sau:
Lấy một lam kính sạch, trong, đã sấy khô Nhỏ 1 giọt lactophenol lên giữa lam kính Dùng que cấy nhọn đầu lấy một phần khóm nấm mọc trên đĩa thạch môi trường PDA (cả phần mọc trên và dưới mặt thạch) để vào giọt dung dịch lactophenol Dùng
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 26 kim có cán hay que cấy nhọn dìm nấm vào giọt dung dịch lactophenol để thấm ướt Khi nấm bị thấm ướt hoàn toàn thì đậy lá kính (lamen) lên trên và ép nhẹ
Tiến hành quan sát với vật kính 10X, 40X
− Khi đậy lá kính đừng để có bọt khí, nếu có sẽ gặp khó khăn trong khi soi kính
− Khi ép nhẹ lá kính tránh làm vỡ, nên dùng giấy thấm bớt dung dịch lactophenol thừa để dung dịch không tràn lên trên mặt lá kính
− Phương pháp này dùng trong trường hợp cần quan sát ngay các mẫu nấm mốc
Lấy một lam kính sạch, trong, đã sấy khô Cắt một khung giấy lọc hình vuông cạnh 2 cm và có độ dày của cạnh khung là 0,3 cm Đặt khung giấy lên giữa lam kính rồi bơm dịch môi trường PDA bán lỏng (0,1 – 0,3 % agar) (khoảng 10 μL) lên lam kính vào giữa khung giấy Tiếp đến cấy nấm lên trên môi trường vừa mới bơm vào (cấy đơn bào tử hay cấy đỉnh sợi nấm) Đậy lamen lên và đặt lên thanh chữ U trong buồng ẩm (ở đây sử dụng đĩa petri bên trong có chứa bông gòn ướt bên trên có đặt thanh chữ U bằng thủy tinh) Để trong hơn 2 ngày, lấy lam kính ra bỏ khung giấy lọc, tiến hành nhuộm bằng lactophenol
Tiến hành quan sát với vật kính 10X, 40X
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.1 Kết quả giám định tên khoa học của cây
Mẫu cây thu hái được định danh tại bộ môn thực vật trường đại học khoa học tự nhiên như sau:
Các tên gọi khác: Cứt lợn, cây hoa ngũ vị, cây bù xít, thắng hồng kế, cỏ thúi địch
3.1.2 Kết quả phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi
Từ các mẫu rễ, thân và lá cây cỏ hôi khỏe mạnh chúng tôi đã phân lập và làm thuần được 38 chủng vi khuẩn nội sinh và 12 chủng vi nấm nội sinh, kết quả được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3 1: Kết quả phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi Địa điểm lấy mẫu Số mẫu Số chủng vi khuẩn nội sinh thu được
Số chủng vi nấm nội sinh thu được
3.1.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh
Từ 38 chủng vi khuẩn nội sinh, chúng tôi tiến hành làm thuần và khảo sát đặc điểm đại thể, vi thể khuẩn lạc trên môi trường NA, kết quả được tình bày ở bảng 3.2 và hình 3.2
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 45
Bảng 3 2: Kết quả quan sát đại thể, vi thể các chủng vi khuẩn nội sinh
STT Nguồn gốc phân lập
Hình dạng, màu sắc, bề mặt Đặc điểm nhuộm gram
1 Bình Dương BR1 Mọc lan, không đều, trắng đục, dẹt
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, chuỗi
2 Bình Dương BR2 Không lan, bờ đều, trắng đục, không tâm, bóng
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
3 Bình Dương BR3 Không lan, bờ đều, vàng, có tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, trắng ngà, không tâm, bóng
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
Mọc lan, bờ không đều vàng nhạt, tâm vàng nhô, bóng
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
Mọc lan, bờ không đều, nâu nhạt, không tâm, bóng
Trực ngắn, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
7 Bình Dương BT1 Không lan, bờ không đều, trắng đục, bóng, dẹt
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, chuỗi
Không lan, bờ không đều, trắng đục, có tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, trắng trong, có tâm trắng đục, nhô, bóng
Không lan, bờ đều, trắng đục, có tâm vàng đục, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 46
STT Nguồn gốc phân lập
Hình dạng, màu sắc, bề mặt Đặc điểm nhuộm gram
Không lan, bờ đều, trắng đục, có tâm vàng đục, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
12 Bình Dương BL1 Không lan, bờ đều, trắng đục, không tâm, bóng
Trực ngắn, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, trắng đục, có tâm, bóng, dẹt
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
14 Bình Dương BL3 Không lan, bờ đều, trắng đục, tâm vàng, nhô
Trực ngắn, Gram dương, không bào tử, chuỗi
Không lan, bờ không đều, vàng nhạt, có tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, cam nhạt, có tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, trắng sữa, tâm lõm, xù xì
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ đều, vàng nhạt, không tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, trắng đục, có tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, trắng đục, không tâm, khô
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 47
STT Nguồn gốc phân lập
Hình dạng, màu sắc, bề mặt Đặc điểm nhuộm gram
Không lan, bờ không đều, trắng sữa, có tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, trắng đục, có tâm, nhô, khô
Trực ngắn, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, trắng đục, tâm nhô, bóng
Trực ngắn, Gram dương, không bào tử, riêng lẻ
HT2 Không lan, bờ đều, vàng đục, có tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, trắng sữa, không tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, trắng sữa, có tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, trắng đục, không tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, vàng đục, có tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram dương, không bào tử, riêng lẻ
Mọc lan, bờ không đều, trắng đục, không tâm, bóng, ướt
Trực ngắn, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, vàng đục, không tâm, nhô, bóng
Trực dài, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 48
STT Nguồn gốc phân lập
Hình dạng, màu sắc, bề mặt Đặc điểm nhuộm gram
HT9 Không lan, bờ đều, vàng nhạt, không tâm, bóng
Trực ngắn, mảnh, Gram dương, không bào tử, riêng lẻ
HL1 Không lan, bờ không đều vàng đục, tâm nhô, bóng
Trực ngắn, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, hồng nhạt, có tâm, nho, bóng
Trực dài, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, vàng nhạt, tâm lõm, xù xì
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, cam nhạt, có tâm, nhô, bóng
Trực dài, mảnh, Gram âm, không bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, vàng đục, có tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram dương, không bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, vàng đục, không có tâm, nhô, bóng
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
Không lan, bờ không đều, trắng đục, có tâm nhô, khô
Trực ngắn, Gram dương, có bào tử, riêng lẻ
Trong đó: nguồn gốc chủng vi sinh vật thu thập được được ký hiệu theo cách thức: tên địa đểm lấy mẫu (Bình Dương _ B, TP Hồ Chí Minh _ H ) - bộ phận phân lập (rễ
Nhận xét: từ bảng 3.1 chúng tôi thu được kết quả trong 38 chủng vi khuẩn nội sinh có: 23 chủng là vi khuẩn Gram dương trong đó có 22 chủng có dạng trực và 1 chủng có dạng cầu; và 15 chủng là vi khuẩn Gram âm có dạng trực
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 49
13 chủng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ mẫu rễ, 14 chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ mẫu thân và 11 chủng được phân lập từ mẫu lá của cây cỏ hôi
Hình 3 1: Phân lập vi khuẩn nội sinh trên đĩa TSA
A: đĩa TSA đối chứng (đĩa trang nước rửa mẫu lần cuối) B: đĩa TSA phân lập vi khuẩn nội sinh
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 50
Hình 3 2: Hình ảnh quan sát đại thể và vi thể một số chủng vi khuẩn nội sinh
A: Hình ảnh đại thể chủng BR1
B: Hình ảnh nhuộm Gram chủng BR1
C: Hình ảnh đại thể chủng HT9
D: Hình ảnh nhuộm Gram chủng HT9
3.1.2.2 Kết quả phân lập vi nấm nội sinh
Từ 12 chủng vi nấm nội sinh, chúng tôi tiến hành làm thuần và khảo sát đặc điểm đại thể, vi thể khuẩn lạc trên môi trường PDA được tình bày ở bảng 3.3 và hình 3.4
Bảng 3 3: Kết quả khảo sát đại thể và vi thể vi nấm nội sinh từ cây cỏ hôi
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 51
Hình dạng, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường PDA Khảo sát vi thể
Khóm nấm màu trắng, có vòng, tơ nấm màu trắng đục, thưa và mọc lan
Khuẩn ti khống có vách ngăn
Khóm nấm màu xanh đậm, có vòng trắng, tơ nấm xốp, mọc cao
Bào tử đính, cuống sinh bào tử phân nhánh, khuẩn ti không có vách ngăn
Khóm nấm màu trắng, tơ nấm nhỏ, mọc nhô và lan mạnh Khuẩn ti có vách ngăn
Khóm nấm màu trắng đục, có vòng, tơ nấm ở vòng ngoài thưa và lan mạnh
Bào tử đốt, khuẩn ti có vách ngăn, cuống sinh bào tử phân nhánh
Khóm nấm màu đen nâu, có vòng trắng ở ngoài, có hạt nhỏ liti trên bề mặt
Khuẩn ti không có vách ngăn, cuống sinh bào tử không phân nhánh, thể bình hình ovan, bào tử đính
H2 Khóm nấm màu xám, tơ nấm màu trắng, có vòng
Khuẩn ti có vách ngăn, cuống sinh bào tử phân nhánh
Khóm nấm màu trắng, tạo khía, có vòng, vòng trong có hạt đen nhỏ li ti trên bề mặt, vòng ngoài tơ nấm trắng, mọc lan
Khuẩn ti không có vách ngăn, cuống sinh bào tử không phân nhánh, thể bình hình cầu, bào tử đính
H4 Khóm nấm màu trắng, có vòng màu xám ở ngoài
Khuẩn ti không có vách ngăn, cuống sinh bào tử không phân nhánh
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 52
Hình dạng, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường PDA Khảo sát vi thể
Khóm nấm màu xám, tơ nấm có hạt li ti màu trắng, mọc cao, xốp
Khuẩn ti không có vách ngăn, cuống sinh bào tử không phân nhánh, bào tử trần đính trên thể bình hình trứng
H6 Khóm nấm màu trắng, tơ nấm nhỏ, mọc lan
Bào tử kín hình elip, đính trên cuống sinh bào tử có vách ngăn
H7 Khóm nấm xanh đậm, tơ nấm nhỏ màu trắng
Khuẩn ti có vách ngăn, cuống sinh bào tử phân nhánh
Khóm nấm màu đen, không có tơ nấm, có hạt màu đen xám trên bề mặt
Khuẩn ti có vách ngăn
Trong đó: nguồn gốc chủng vi sinh vật thu thập được được ký hiệu theo cách thức: tên địa đểm lấy mẫu (Bình Dương_B, TP Hồ Chí Minh_H )
Nhận xét: từ bảng 3.3 chúng tôi thu được kết quả trong 12 chủng vi nấm nội sinh có:
4 chủng phân lập từ Bình Dương và 8 chủng phân lập từ TP Hồ Chí Minh
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 53
Hình3 3: Kết quả phân lập vi nấm nội sinh cây cỏ hôi trên PDA
A: đĩa PDA đối chứng (đĩa trang nước rửa mẫu lần cuối) B: đĩa PDA phân lập vi khuẩn nội sinh
Hình 3 4: Hình ảnh quan sát đại thể và vi thể một số chủng vi nấm nội sinh
A: Hình ảnh đại thể chủng H3 B: Hình ảnh nhuộm nấm chủng H3
3.1.3 Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của chủng vi sinh nội sinh phân lập từ cây cỏ hôi 3.1.3.1 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn nội sinh
Từ 38 chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được, chúng tôi tiến hành thử nghiệm đối kháng với 4 chủng vi khuẩn gây bệnh là E coli, P aeruginosa, S typhi và S aureus Kết quả được trình bày trong bảng 3.4
Bảng 3 4: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh của chủng vi khuẩn nội sinh
Chủng vi khuẩn nội sinh Đối chứng (ĐC)
Chủng vi khuẩn gây bệnh
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 54
Chủng vi khuẩn nội sinh Đối chứng (ĐC)
Chủng vi khuẩn gây bệnh
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 55
Chú thích: (+): ức chế, (-): không ức chế
Nhận xét: sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh trên 4 chủng vi khuẩn gây bệnh bao gồm: S aureus, S typhi, P aeruginosa và E coli, thu được kết quả sau:
Có 1/ 38 chủng kháng với cả 4 đối tượng chủng gây bệnh là chủng HL6
Có 4/ 38 chủng kháng với 3 đối tượng chủng gây bệnh là các chủng HR2, HR3, BL3, BR6
Có 8/ 38 chủng kháng với 2 đối tượng chủng gây bệnh là các chủng BT5, HR5, HR1, HT1, HR6, HL2, HT6, HT4
Có 10/ 38 chủng chỉ kháng với 1 đối tượng chủng gây bệnh, đó là các chủng HT3, HT5, HT7, HL1, HL5, HR4, BT3, BL1, BR2, BR4
Có 15/ 38 chủng không kháng với đối tượng chủng gây bệnh nào là các chủng HT2, HT8, HT9, HL3, HL4, HL7, HR7, BT1, BT2, BT4, BL2, BL4, BR1, BR3
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 56
Hình 3 5: Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của chủng vi khuẩn nội sinh
A: Các chủng nội sinh kháng với E coli B: Các chủng nội sinh kháng với S aureus
3.1.3.2 Kết quả khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh
Từ những chủng dương tính với thử nghiệm đối kháng của vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của dịch lọc vi khuẩn nội sinh đối với 4 loại vi khuẩn gây bệnh , kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.5:
Bảng 3 5: Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch lọc các vi khuẩn nội sinh đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh
Chủng vi khuẩn nội sinh Đối chứng
Chủng vi khuẩn gây bệnh (Đường kính vòng kháng, D – mm)
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 57
Trong cùng một cột, các trị số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05 qua phép thử Duncan
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
Biểu đồ 3 1: Khả năng kháng khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn nội sinh Nhận xét: sau khi tiến hành thử nghiệm khảo sát khả năng đối kháng của dịch lọc vi khuẩn nội sinh đối với vi khuẩn gây bệnh, thu được kết quả sau:
Dịch lọc của chủng vi khuẩn HL6 và HR2 có khả năng đối kháng với 2/4 chủng vi khuẩn gây bệnh, trong đó chủng HL6 kháng mạnh đối với chủng S aureus và chủng E coli với đường kính vòng kháng lần lượt là 22,00 ± 1,26 (mm) và 20,17 ± 0,17 (mm)
HT4 HT6 HR3 HL6 BR6 HR6 BT5 HR2 Đ ườn gkií nh vòng kh áng, D (m m )
Chủng vi khuẩn nội sinh
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 58
Dịch lọc chủng HT4, HT6, HR3, BR6, HR6, BT5 có khả năng đối kháng với 1/4 chủng vi khuẩn gây bệnh, trong đó chủng HT6 có khả năng đối kháng mạnh với chủng bệnh S typhi với đường kính vòng kháng là 11,17 ± 0,44 (mm) và chủng HR6 khả năng đối kháng mạnh với chủng P aeruginosa với đường kính vòng kháng là 13,83 ± 0,44 (mm)
Hình 3 6: Kết quả khả năng đối kháng qua dịch lọc vi khuẩn đối với vi khuẩn gây bệnh E Coli
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 59
3.1.3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn sinh carbapenemase của chủng vi khuẩn nội sinh
Kết quả thử nghiệm cho thấy vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 07-4/A, Pseudomonas aeruginosa 07-14/A, Escherichia coli 09-10/A có khả năng kháng carbapenem đối với tất cả 13 chủng vi khuẩn sinh carbapenemase được thử nghiệm.
Bảng 3 6: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn sinh carbapenemase của chủng vi khuẩn nội sinh
Chủng vi khuẩn nội sinh Đối chứng
Chủng vi khuẩn sinh carbapenemase
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 60
Chủng vi khuẩn nội sinh Đối chứng
Chủng vi khuẩn sinh carbapenemase
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 61
Chú thích: (+): ức chế, (-): không ức chế
Nhận xét: sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn sinh enzym carbapenemase của chủng vi khuẩn nội sinh, thu được kết quả sau:
Có 1/ 38 chủng kháng với 8 đối tượng chủng sinh carbapenemase là chủng BR6
Có 1/ 38 chủng kháng với 7 đối tượng chủng sinh carbapenemase là chủng HR2
Có 1/ 38 chủng kháng với 5 đối tượng chủng sinh carbapenemase là chủng HL6
Có 3/ 38 chủng kháng với 4 đối tượng chủng sinh carbapenemase là các chủng HL2, HL3, HR6
Có 3/ 38 chủng kháng với 3 đối tượng chủng sinh carbapenemase là các chủng HT3, HT5, HR5
Có 4/ 38 chủng kháng với 2 đối tượng chủng sinh carbapenemase là các chủng HT7, BR1, BR2, BR4
Có 12/ 38 chủng chỉ kháng với 1 đối tượng chủng sinh carbapenemase, đó là các chủng HT1, HT4, HT6, HL1, HR1, HR3, HR4, BT3, BT5, BL1, BL3, BR5
Có 13/ 38 chủng không kháng với đối tượng chủng sinh carbapenemase nào là các chủng HT2, HT8, HT9, HL4, HL5, HL7, HR7, BT1, BT2, BT4, BL2, BL4, BR3
Hình 3 7: Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn sinh carbapenemase của chủng vi khuẩn nội sinh
A: Các chủng nội sinh kháng chủng Klebsiella spp (133k) B: Các chủng nội sinh kháng chủng Klebsiella spp (26k)
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 62
3.1.3.4 Kết quả khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh đối với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase
Từ những chủng dương tính với thử nghiệm đối kháng của vi khuân nội sinh với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của dịch lọc vi khuẩn nội sinh đối với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase, kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.7:
Bảng 3 7: Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch lọc các vi khuẩn nội sinh đối với các chủng vi khuẩn sinh enzym carbapenemase
Chủng vi khuẩn nội sinh Đối chứng
Chủng vi khuẩn sinh carbapenemase (Đường kính vòng kháng, D – mm)
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 63
Trong cùng một cột, các trị số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05 qua phép thử Duncan
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
THẢO LUẬN
Từ 10 mẫu cây cỏ hôi chúng tôi đã phân lập được 38 chủng vi khuẩn nội sinh, trong đó có 15 chủng phân lập ở Bình Dương, 23 chủng phân lập ở TP Hồ Chí Minh và 12 chủng vi nấm nội sinh, trong đó có 4 chủng phân lập ở Bình Dương, 8 chủng phân lập ở TP Hồ Chí Minh
Qua thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn nội sinh thu được chủng HL6 và chủng HR2 có hoạt tính kháng mạnh với đường kính vòng kháng giữa chủng HL6 với S aureus là 22,00 ± 1,26 (mm).
Qua thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn sinh carbapenemase của các chủng vi khuẩn nội sinh thu được chủng HL6 và chủng BR6 có hoạt tính kháng mạnh với đường kính vòng kháng giữa chủng BR6 với P aeruginosa (86p) là 20,33 ± 0,33 (mm)
Qua thử nghiệm hoạt tính kháng nấm gây bệnh T rubrum của chủng vi khuẩn nội sinh thu được chủng HR2, BR6, HL6 có hoạt tính kháng mạnh với đường kính vòng kháng của chủng HR2 với vi nấm T rubrum là 27, 00 ± 1,73 mm
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 75
Qua thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh của các chủng vi nấm nội sinh không thu được chủng vi nấm nội sinh nào có hoạt tính kháng với các chủng vi khuẩn sinh carbapenemase
Qua thử nghiệm hoạt tính kháng chủng nấm bệnh T rubrum của các chủng vi nấm nội sinh chúng tôi thu được 1 chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính kháng cao nhất là chủng H3 với phần trăm ức chế trung bình là 76,2 ± 0,37% Đề tài về vi sinh vật nội sinh cây cỏ hôi đã được một số các tác giả quan tâm nghiên cứu, các công trình ngoài nước có thể kể đến như:
Lê Thị Thùy Dương (2009) khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây cỏ hôi cho thấy cao cây cỏ hôi có khả năng ức chế trên vi khuẩn Gram dương và Gram âm, đặc biệt tác động mạnh nhất trên các vi khuẩn gây bệnh cho cá (gồm E tarda, E ictaluri và A hydrophila) Hoạt tính kháng khuẩn của cao cây cỏ hôi đối với S aureus, E.coli,
P aeruginosa, A hydrophila, các giá trị MIC E ictaluri, E tarda bằng nhau và bằng
Theo Osho, A và Adetunji, T (2011), sự nhạy cảm của vi khuẩn và vi nấm với tinh dầu cây cỏ hôi đã được xác định P aeruginosa không nhạy cảm với tinh dầu B subtilis, K pneumoniae và S aureus nhạy cảm với tinh dầu cây cỏ hôi với nồng độ ức chế tối thiểu dao động từ 2,0 mg/ml và 4,0 mg/ml Sự ức chế các vi khuẩn bởi tinh dầu cây cỏ hôi làm cho nó là một tác nhân kháng khuẩn thay thế đầy hứa hẹn
Hiện nay, trong và ngoài nước vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong cây cỏ hôi Hầu hết các nghiên cứu tập trung vào khả năng kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa của cao chiết từ cây cỏ hôi Do đó, kết quả nghiên cứu của chúng tôi tạo tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi.
SVTT: PHẠM THỊ NGỌC PHƯỢNG 76
