Thử nghiệm khả năng đối kháng của các chủng vi sinh nội sinh từ cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase .... 4: Kết quả khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn nội sinh từ
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
VẬT LIỆU
2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 10/03/2016 đến tháng 5/2016 tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Vi Sinh, Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học
Mở TP Hồ Chí Minh
Mẫu được thu thập từ mỗi cây sau: khổ qua, neem, rau diếp cá, đinh lăng, sâm đại hành, trầu không và vối thu nhận tại Bình Dương và Tây Ninh
Chủng vi khuẩn sinh enzym carbapenemase được cung cấp bởi Khoa Xét Nghiệm, Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh
2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, môi trường
Cân, nồi hấp, tủ lạnh, tủ mát, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, lò vi sóng, kính hiển vi, máy votex, máy ly tâm …
Dụng cụ Ống nghiệm, đĩa petri, micro pipet, bình cầu, becher, ống đong, que cấy, đèn cồn, lam, bình schott…
- Môi trường nuôi cấy phân lập: NA (Nutrient Agar)
- Môi trường để thực hiện thử nghiệm kháng sinh đồ: MHA (Mueller Hinton Agar)
• Hóa chất: NaCl, cồn Ethanol 96 o
PHƯƠNG PHÁ P NGHIÊN CỨU
Dựa vào mục tiêu nghiên cứu, chúng tôi bố trí thí nghiệm như sơ đồ 2.1
Sơ đồ 2 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.2.2 Quy trình phân lập vi sinh vật nội sinh
Xác định tên khoa học cây dược liệu
Các cây dược liệu được thu hái và giám định, mô tả hình thái thực vật, đặc điểm hoa, quả, hạt, xác định tên khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại Học Khoa Học
Tự Nhiên – Tp Hồ Chí Minh
Mẫu cây dược liệu được chọn là những cây khỏe mạnh, lá xanh tốt, không mắc bệnh và tăng trưởng tốt theo tiêu chí chọn những cây có cảm quan tối ưu nhất tại vị trí lấy mẫu (Roy và cs, 2010)
Quy cách lấy mẫu: mẫu được thu ở lúc sáng sớm hay chiều mát, thu toàn bộ cây rồi rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá; sau đó cắt rời rễ và thân cây ra
Tái kiểm tra vi khuẩn sinh enzym carbapenemase
Phân lập vi sinh vật nội sinh
Khảo sát khả năng đối kháng của vi sinh vật nội sinh cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase carbapenemase Định danh các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao a r
• Xử lý mẫu: để loại trừ các vi sinh vật có khả năng còn bám ở bề mặt, mẫu sau khi thu thập được tiến hành xử lý như sau: rửa sạch phần thân, rễ và lá dưới vòi nước mạnh; tiếp tục rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi cắt rễ và thân thành những đoạn nhỏ 1-2 cm, cắt lá thành những hình vuông có kích thước 1 x 1 cm sau đó làm khô mẫu bằng giấy hút ẩm vô trùng; sau đó lần lượt khử trùng mẫu (rễ, thân, lá) bằng cồn 70% trong 1 phút, sodium hypochloride 2,5% trong 4 phút, ethanol trong 30 giây và rửa lại với nước cất vô trùng 4 lần để tẩy rửa các loại hóa chất còn thừa (Costa và cs, 2012) Để kiểm tra khả năng các vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trùng, lấy 200 μL nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần thứ 4 (lần cuối) cấy lên các đĩa môi trường TSA (Trypticase Soy Agar ) và ủ ở 37 0 C, nếu sau 24 giờ ủ các đĩa môi trường này không có sự xuất hiện các khuẩn lạc thì các mẫu đã khử trùng đạt yêu cầu (Costa và cs, 2012)
• Phân lập vi khuẩn nội sinh
Mẫu sau khi mẫu đã xử lý xong, tiến hành phân lập trên môi trường TSA ủ 30 0 C trong điều kiện có ánh sáng trong 48 giờ để cho sự phát triển của vi khuẩn nội sinh (Roy và cs, 2010)
• Phân lập vi nấm nội sinh
Phương pháp tiến hành: cắt nhỏ mẫu lá sau khi được xử lý, tiến hành phân lập trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) có bổ sung kháng sinh Chloramphenicol 0,05 % và bọc kín parafilm ủ ở 27 ± 2 0 C từ vài ngày cho đến 2 tháng để cho sự phát triển của vi nấm nội sinh (Kafur, 2011; Idris, 2013)
• Đối với vi khuẩn nội sinh
Sau khi ủ, khuẩn lạc có hình thái khác nhau đã được lựa chọn và tiến hành cấy ria nhiều lần trên đĩa NA và ủ ở 28 0 C trong 48 giờ để làm thuần vi khuẩn nội sinh
Tiến hành cấy ria nhiều lần trên môi trường NA cho đến khi thu được khuẩn lạc có độ đồng đều về hình dạng, màu sắc Quan sát, nhận xét về đặc điểm hình thái như: màu sắc, hình dạng, kích thước, viền, bề mặt của khuẩn lạc (Arunachalam và cs, 2010) Lưu ý, từ một khuẩn lạc lấy từ mẫu thí nghiệm ta có thể có được ít nhất một chủng nội sinh
Các chủng đã được làm thuần được cấy giữ chủng vào các ống thạch nghiêng NA và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 0 C (Arunachalam và cs, 2010) Từ các khuẩn lạc trên mẫu lá phân lập được ít nhất 1 chủng vi sinh vật nội sinh (Phạm Quang Thu và cs, 2012)
• Đối với vi nấm nội sinh
Ghi nhận lại hình dạng, màu sắc, kết quả vi nấm nội sinh Sau đó tiến hành tách khuẩn lạc vi nấm và cấy từ các đĩa mọc lên từ lần phân lập đầu tiên lên môi trường PDA, lặp lại cho đến khi thu được sợi nấm thuần khiết có độ đồng đều về hình dạng và màu sắc (Roy và cs, 2010; Kafur và cs, 2011) Từ các khuẩn lạc trên mẫu lá phân lập được ít nhất 1 chủng nấm nội sinh (Phạm Quang Thu và cs, 2012)
Quan sát đại thể, vi thể
• Đối với vi khuẩn nội sinh
Xác định đặc điểm hình thái: hình dạng, kích thước và màu sắc của khuẩn lạc
Bảng 2 1: Các chỉ tiêu quan sát đại thể vi khuẩn trên thạch
Các chỉ tiêu đánh giá Mô tả
Hình dạng Hình dáng mép (tròn, răng cưa,…), có núm hay không
Kích thước Độ dày, đường kính… Độ trong, màu sắc Trên, dưới, có hay không khuếch tán ra môi trường xung quanh
Mùi khuẩn lạc Có/ không mùi
Khả năng sinh sắc tố huỳnh quang Có/ không
Nhuộm Gram, quan sát các chủng vi khuẩn phân lập được dưới kính hiển vi (Arunachalam và cs, 2010)
Nhuộm Gram: nhằm xác định hình dạng tế bào vi khuẩn, dạng cầu hay trực, quan sát cách sắp xếp dạng đơn lẻ, dạng chuỗi hay chùm và phân biệt tính chất bắt màu Gram (–) hoặc Gram (+)
Bảng 2 2: Các chỉ tiêu quan sát vi thể vi khuẩn trên kính hiển vi
Các chỉ tiêu đánh giá Mô tả
Hình thái Trực, cầu, chùy
Cách sắp xếp Riêng lẽ, chuỗi, tụ,…
Cách bắt màu Tím, hồng
• Đối với vi nấm nội sinh:
Khảo sát đại thể: bằng mắt thường, hay dùng kính lúp cầm tay nhận xét về kích thước, màu sắc,… của khuẩn lạc vi nấm nội sinh
Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên thạch
Giữ giống vi sinh vật là công việc hết sức cần thiết do chúng dễ bị thoái hoá nếu không được bảo quản đúng kỹ thuật Công việc giữ giống là thực hiện các kỹ thuật cần thiết để giữ cho vi sinh vật có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ
Sau khi thu được các chủng thuần, đem giữ giống trong môi trường thích hợp, đối với vi khuẩn nội sinh giữ giống trên môi trường NA và trên môi trường PDA đối với vi nấm bằng phương pháp cấy chuyền định kì, nên cấy chuyền thường xuyên (vài tuần hoặc một vài tháng tùy giống vi sinh vật) và có sổ ghi chép để tiện theo dõi
2.2.3 Quy trình tái kiểm tra vi khuẩn sinh carbapenemase
Từ những chủng vi khuẩn kháng thuốc sinh carbapenemase phân lập từ trước đó do Khoa Xét Nghiệm, Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh cung cấp, chúng tôi tiến hành tái kiểm tra bằng phương pháp thường quy
Sau khi nhận giống chúng tôi tiến hành làm thuần bằng cách cấy ria trên đĩa môi trường NA, ủ 37 o C/ 24 giờ Sau đó quan sát đại thể và nhuộm Gram
