KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG. CỦA MỘT SÓ CHỦNG Trichoderma CHỌN LỌC ĐÓI VỚI NẤM BỆNH HẠI CÂY TRÒNG

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG Trichoderma CHỌN LỌC ĐỐI VỚI NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Ngành SVTH Niên khóa : CƠNG NGHỆ SINH HỌC : VŨ ĐỨC TÂM : 2007 – 2012 TP.Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA MỘT SỐ CHỦNG Trichoderma CHỌN LỌC ĐỐI VỚI NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC SVTH : VŨ ĐỨC TÂM GVHD : PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG CN ĐỖ THỊ TUYẾN TP.Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành tốt khóa luận em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Khoa Học Ứng Dụng trường ĐH Tơn Đức Thắng tận tình giảng dạy em suốt thời gian học tập trường Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Tiến Thắng cô Đỗ Thị Tuyến hết lòng hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực đề tài Xin cảm ơn thầy cô, anh chị Viện Sinh Học Nhiệt Đới tận tình giúp đỡ trình thực tập tốt nghiệp Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè theo sát động viên suốt thời gian vừa qua Sinh viên thực Vũ Đức Tâm i TÓM TẮT VŨ ĐỨC TÂM, Đại học Tôn Đức Thắng, TP.HCM tháng 7/2012 “Khảo sát khả đối kháng số chủng Trichoderma chọn lọc nấm bệnh hại trồng” Hội đồng hướng dẫn:  PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG  CN ĐỖ THỊ TUYẾN Hiện việc phòng trừ sâu bệnh hại trồng biện pháp sinh học đẩy mạnh nghiên cứu nhiều nước, xem lĩnh vực quan trọng Phòng trừ sinh học bệnh hại trồng chủ yếu khai thác sử dụng khả đối kháng số loại nấm loại nấm bệnh hại trồng Góp phần bảo vệ mơi trường sở phát triển cho nông nghiệp sinh thái bền vững Trên lẽ chúng tơi tiến hành khảo sát khả đối kháng số chủng Trichoderma chọn lọc nấm bệnh hại trồng thu kết sau:  Đánh giá khả đối kháng nấm Fusarium oxysporum Phytophthora palmivora chủng Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei, Trichoderma paceramocum  Bước đầu thu nhận chế phẩm Trichoderma, khảo sát khả đối kháng chế phẩm nấm bệnh hại trồng ii MỤC LỤC Trang Trang tựa Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục hình ảnh vii Danh mục bảng ix Danh mục biểu đồ x CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục đích 1.3 Ý nghĩa đề tài CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu bệnh 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Các giai đoạn phát triển bệnh 2.1.4 Bệnh truyền nhiễm điều kiện quy định phát triển bệnh 2.1.5 Quá trình nấm gây bệnh 2.2 Đặc điểm sinh học chủng nấm gây bệnh dùng nghiên cứu 2.2.1 Nâm Fusarium oxysporum 2.2.2 Nấm Phytophthora palmivora 2.3 Đặc điểm sinh học chủng nấm Trichoderma 12 2.3.1 Trichoderma harzianum 12 2.3.2 Trichoderma reesei 13 2.3.3 Trichoderma paceramocum 13 2.3.4 Cơ chế hoạt động nấm Trichoderma 14 iii 2.3.5 Một số ứng dụng Trichoderma 16 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm 19 3.1.1 Địa điểm 19 3.1.2 Thời gian 19 3.2 Nội dung nghiên cứu 19 3.3 Vật liệu thí nghiệm 19 3.3.1 Các chủng vi sinh vật dùng nghiên cứu 19 3.3.2 Dụng cụ thiết bị 19 3.3.3 Môi trường nuôi cấy 20 3.4 Phương pháp nghiên cứu 22 3.4.1 Quan sát hình thái nấm 22 3.4.2 Xác định hoạt lực enzyme Chitinase chủng Trichoderma 23 3.4.3 Khảo sát khả đối kháng chủng Trichoderma nấm bệnh hại trồng (Phương pháp đối kháng trực tiếp) 25 3.4.4 Phương pháp lên men xốp 26 3.4.5 Khảo sát khả đối kháng chế phẩm Trichoderma nấm bệnh hại trồng 27 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Quan sát hình thái nấm 29 4.1.1 Quan sát hình thái đại thể 29 4.1.2 Quan sát hình thái vi thể 30 4.2 Xác định hoạt lực enzyme chitinase chủng Trichoderma 31 4.2.1 Môi trường 32 4.2.2 Môi trường 33 4.2.3 Môi trường 34 4.2.4 Nhận xét chung 35 4.3 Khảo sát khả đối kháng chủng Trichoderma nấm bệnh hại trồng (Phương pháp đối kháng trực tiếp) 36 4.3.1 Khả đối kháng nấm Trichoderma harzianum 36 4.3.2 Khả đối kháng nấm Trichoderma reesei 39 iv 4.3.3 Khả đối kháng nấm Trichoderma paceramocum 40 4.4 Lên men xốp thu nhận chế phẩm Trichoderma 44 4.5 Khảo sát khả đối kháng chế phẩm Trichoderma với nấm bệnh hại trồng 45 4.5.1 Khả đối kháng chế phẩm Trichoderma harzianum 45 4.5.2 Khả đối kháng chế phẩm Trichoderma reesei 48 4.5.3 Khả đối kháng chế phẩm Trichoderma paceramocum 50 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 54 5.2 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT T.harzianum : Trichoderma harzianum T.reesei : Trichoderma reesei T.paceramocum : Trichoderma paceramocum F.oxysporum : Fusarium oxysporum P.palmivora : Phytophthora palmivora AOX : Các hợp chất halogen thấm nước PGA : Potato Glucose Agar T.mycoparasitic : Trichoderma mycoparasitic vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 2.1: Bệnh héo rũ Chuối Hình 2.2: Bệnh thối trái Sầu Riêng 10 Hình 2.3: Nhánh Sầu Riêng bị thối nấm P.palmivora 11 Hình 2.4: Lá Sầu Riêng bị cháy nấm P.palmivora 11 Hình 2.5: Hình ảnh Rhizoctonia solani kính hiển vi sau Trichoderma mycoparasitic gỡ bỏ Enzyme T.mycoparasitic tiết làm thủng tế bào nấm gây bệnh Hình 3.1: Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng Trichoderma với nấm bệnh Hình 3.2: 15 25 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng chế phẩm Trichoderma nấm bệnh 27 Hình 4.1: Khuẩn lạc T.harzianum 29 Hình 4.2: Khuẩn lạc T.reesei 29 Hình 4.3: Khuẩn lạc T.paceramocum 29 Hình 4.4: Khuẩn lạc F.oxysporum 29 Hình 4.5: Khuẩn lạc P.palmivora 30 Hình 4.6: Khuẩn ty T.harzianum 30 Hình 4.7: Khuẩn ty T.reesei 30 Hình 4.8: Khuẩn ty T.paceramocum 30 Hình 4.9: Khuẩn ty F.oxysporum 31 Hình 4.10: Khuẩn ty P.palmivora 31 Hình 4.11: Sự ức chế F.oxysporum T.harzianum 37 Hình 4.12: Sự ức chế P.palmivora T.harzianum 38 Hình 4.13: Sự ức chế F.oxysporum T.reesei 39 Hình 4.14: Sự ức chế P.palmivora T.reesei 40 Hình 4.15: Sự ức chế F.oxysporum T.paceramocum 41 Hình 4.16: Sự ức chế P.palmivora T.paceramocum 42 Hình 4.17: Chế phẩm Trichoderma thu 45 vii Hình 4.18: Khả đối kháng chế phẩm T.harzianum nấm F.oxysporum 46 Hình 4.19: Khả đối kháng chế phẩm T.harzianm nấm P.palmivora 47 Hình 4.20: Khả đối kháng chế phẩm T.reesei nấm F.oxysporum 48 Hình 4.21: Khả đối kháng chế phẩm T.reesei nấm P.palmivora 49 Hình 4.22: Khả đối kháng chế phẩm T.paceramocum nấm F.oxysporum 50 Hình 4.23: Khả đối kháng chế phẩm T.paceramocum nấm P.palmivora 51 viii 4.3.2 Khả đối kháng nấm Trichoderma paceramocum Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng nấm T.paceramocum nấm bệnh F.oxysporum P.palmivora trình bày hình 4.15 hình 4.16: Ngày Đối chứng Mặt trước Thí nghiệm Mặt sau Mặt trước Hình 4.15: Sự ức chế F.oxysporum T.paceramocum 41 Mặt sau Đối chứng Ngày Mặt trước Thí nghiệm Mặt sau Mặt trước Hình 4.16: Sự ức chế P.palmivora T.paceramocum 42 Mặt sau 43 Kín đĩa 50 Kín đĩa 14 ĐC Ngày nuôi 10 Tiếp xúc 12 Bị bao quanh Không phát triển Không phát triển TN F.oxysporum Phủ kín đĩa 85 50 15 ĐC ĐC 20 Bị bao quanh Không phát triển Không phát triển 18 Bị bao quanh Không phát triển Không phát triển TN 14 ĐC P.palmivora 12 TN F.oxysporum Trichoderma reesei ĐC Bị bao quanh 10 Bị bao quanh Không phát triển Không phát triển TN F.oxysporum ĐC Bị bao quanh Bị bao quanh Không phát triển Không phát triển TN P.palmivora Trichoderma paceramocum Bảng 4.4: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh có nấm Trichoderma 10 Tiếp xúc 12 Bị bao quanh Không phát triển Không phát triển TN P.palmivora Trichoderma harzianum Đường kính khuẩn lạc nấm gây bệnh (mm) Nhận xét: Nấm Trichoderma có khả ức chế tiêu diệt nấm F.oxysporum P.palmivora cao Trong T.harzianum T.paceramocum có khả ức chế cao Trong ngày đầu, Trichoderma mọc nhanh, lấn chiếm phần thạch trống Đến ngày thứ Trichoderma mọc tràn lên mặt khuẩn lạc nấm bệnh nhờ chế ký sinh Trichoderma Theo quan sát nhận thấy nấm bệnh thưa dần theo thời gian Quá trình đối kháng diễn theo trình tự sau:  Đầu tiên chế cạnh tranh: Trichoderma phát triển cạnh tranh dinh dưỡng nấm bệnh môi trường thạch  Tiếp theo ký sinh: Trichoderma xâm nhập vào nấm bệnh, phát triển ký sinh nấm bệnh Cuối nấm bệnh bị tiêu diệt 4.4 Lên men xốp thu nhận chế phẩm Trichoderma  Sơ đồ quy trình: Ống giống Mơi trường nhân giống (trong bình tam giác) Môi trường lên men (bổ sung môi trường xốp, nuôi – ngày 29 – 32oC) Sấy khô (50 – 60oC) Xay mịn, rây Chế phẩm Trichoderma dạng bột  Thuyết minh quy trình: Các chủng giống Trichoderma từ ống giống cấy vào bình có mơi trường nhân giống vơ trùng, sau đem nuôi nhiệt độ 30 – 32oC nấm lên trắng Sau chuyển giống từ bình nhân giống vào bình lên men có sẵn mơi trường vơ trùng đem ni từ – ngày 30 – 32oC bào tử 44 lên trắng khắp bình Đem sấy khô 50 – 60oC, xay nhuyễn rây để thu chế phẩm Hình 4.17: Chế phẩm Trichoderma thu 4.5 Khảo sát khả đối kháng chế phẩm Trichoderma với nấm bệnh hại trồng 4.5.1 Khả đối kháng chế phẩm Trichoderma harzianum Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng nấm T.harzianum nấm bệnh F.oxysporum P.palmivora trình bày hình 4.18 hình 4.19: 45 46 ngày Ngày Đối chứng 0,2g 0,4g 0,6g 0,8g Hình 4.18: Khả đối kháng nấm T.harzianum nấm F.oxysporum Nồng độ Ngày TN Chế phẩm T.harzianum đối kháng nấm F.oxysporum 1g 47 ngày Ngày Đối chứng 0,2g 0,4g 0,6g 0,8g Hình 4.19: Khả đối kháng nấm T.harzianum nấm P.palmivora Nồng độ Ngày TN Chế phẩm T.harzianum đối kháng nấm P.palmivora 1g 0,6g 0,4g 0,2g 48 ngày Ngày Đối chứng Nồng độ Ngày TN Chế phẩm T.reesei đối kháng nấm F.oxysporum 0,8g Hình 4.20: Khả đối kháng nấm T.reesei nấm F.oxysporum 1g 4.5.2 Khả đối kháng chế phẩm Trichoderma reesei Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng chế phẩm T.reesei nấm bệnh F.oxysporum P.palmivora trình bày hình 4.20 hình 4.21: 49 ngày Ngày Nồng độ Ngày TN 0,2g 0,4g 0,6g 0,8g Hình 4.21: Khả đối kháng nấm T.reesei nấm P.palmivora Đối chứng Chế phẩm T.reesei đối kháng nấm P.palmivora 1g 0,6g 0,4g 0,2g 50 ngày Ngày Đối chứng Nồng độ Ngày TN Chế phẩm T.paceramocum đối kháng nấm F.oxysporum 0,8g Hình 4.22: Khả đối kháng nấm T.paceramocum nấm F.oxysporum 1g 4.5.3 Khả đối kháng chế phẩm Trichoderma paceramocum Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng chế phẩm T.paceramocum nấm bệnh F.oxysporum P.palmivora trình bày hình 4.22 hình 4.23: 51 ngày Ngày Đối chứng 0,2g 0,4g 0,6g 0,8g Hình 4.23: Khả đối kháng nấm T.paceramocum nấm P.palmivora Nồng độ Ngày TN Chế phẩm T.paceramocum đối kháng nấm P.palmivora 1g Nhận xét: Kết cho thấy so với thí nghiệm đối chứng (không rắc chế phẩm Trichoderma) từ nồng độ chế phẩm 0,6 – g cho khả ức chế tiêu diệt nấm bệnh tốt Ở ngày ngày thứ 2, nấm bệnh chế phẩm phát triển chậm, bào tử mọc rải rác quanh đĩa Đến ngày thứ 4, thấy dấu hiệu ức chế nấm bệnh chế phẩm, làm nấm bệnh mọc chậm lại, tơ co lại Bào tử chế phẩm mọc nhiều Những ngày tiếp theo, nấm bệnh khơng cịn phát triển nữa, tơ nấm lụi dần, phát triển chế phẩm Trichoderma 52 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 Kết Luận 5.1 Qua quan sát thực đề tài số liệu thu ta đến số kết luận sau: Các chủng Trichoderma khả sát có khả chống lại nấm bệnh cách tiếp xúc trực tiếp hay sử dụng chế phẩm Khả ức chế nấm bệnh T.harzianum T.paceramocum mạnh nấm T.reesei Chế phẩm Trichoderma tiêu diệt nấm bệnh P.palmivora nhanh diệt nấm F.oxysporum Thành phần mơi trường ni cấy có tính định khả tổng hợp enzyme chitinase Trichoderma Sự sinh trưởng Trichoderma không phụ thuộc nhiều vào thành phần khoáng vi lượng mà chủ yếu dựa vào nguồn carbon nitơ cung cấp Kiến nghị 5.2 Qua q trình thực đề tài, tơi có số kiến nghị sau: Thực nghiệm khả kháng nấm chủng Trichoderma nhiều đối tượng nấm bệnh khác Khảo sát hoạt tính chế phẩm Trichoderma theo thời gian nhiệt độ để chọn điều kiện tối ưu cho việc bảo quản chế phẩm Tiến hành thí nghiệm chế phẩm Trichoderma loại trồng Nghiên cứu kết hợp chế phẩm Trichoderma với chất dinh dưỡng, phân bón trồng để tạo sản phẩm đa chức giúp trồng vừa phòng bệnh vừa kích thích tăng trưởng Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phát triển Trichoderma Khảo sát thêm số chủng Trichoderma khác tiến hành chọn lọc giống Trichoderma có khả kháng nấm tương ứng với đối tượng nấm bệnh cụ thể 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Thị Dung, 1996 Sử dụng phương pháp Elson-Morgan để định tính định lượng glucosamin, khóa luận tốt nghiệp ĐH Tổng hợp TP.HCM [2] PGS Phạm Văn Kim, Các nguyên lý bệnh hại trồng, ĐH Cần Thơ [3] GS.TS Vũ Triệu Mân,2007 Giáo trình bệnh đại cương, Đh Nông Nghiệp I – Hà Nội [4] Dương Minh, Tác động chủng nấm đối kháng Trichoderma nội địa việc phòng trị bệnh Phytothora palmovora gây hại sầu riêng Cần Thơ Bến Tre, ĐH Cần Thơ [5] Nguyễn Văn Thành, Giáo trình nấm học, Rice University, Houston, Texas [6] Trần Linh Thước, 2005 Phương pháp phân tích vi sinh vật, NXB Giáo Dục [7] Nguyễn Mạnh Tuấn, Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase môi trường lên men bán rắn chủng Trichoderma paceramocum, khóa luận tốt nghiệp ĐH Mở TP.HCM  Tài liệu tiếng nước [8] P.Chaverri & Samuels, 2003 Hypocrea/Trichoderma (Ascomycota, Hypocreales, Hypocreaceae): species with green ascospores [9] M.R.el – Geweky, 1993 Biotechnology annual review, vol  Tài liệu từ Internet [10]http://baovecaytrong.com/kythuatcaytrongchitiet.php?Id=43&caytrongkythu at=c%C3%A2y%20s%E1%BA%A7u%20ri%C3%AAng [11] http://explow.com 55 ... đề tài: ? ?Khảo sát khả đối kháng số chủng Trichoderma chọn lọc nấm gây bệnh hại trồng” 1.2 Mục đích Khảo sát khả đối kháng trực tiếp với nấm bệnh Xác định hoạt lực enzyme Chitinase chủng Trichoderma. .. Quan sát hình thái nấm Xác định hoạt lực enzyme Chitinase chủng Trichoderma Khảo sát khả đối kháng chủng Trichoderma chọn lọc nấm gây bệnh hại trồng Lên men xốp thu nhận chế phẩm Trichoderma Khảo. .. Chitinase chủng Trichoderma 23 3.4.3 Khảo sát khả đối kháng chủng Trichoderma nấm bệnh hại trồng (Phương pháp đối kháng trực tiếp) 25 3.4.4 Phương pháp lên men xốp 26 3.4.5 Khảo sát khả đối kháng