BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞--- NGUYỄN TƯỜNG VI KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GENE LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP LOVASTATIN TRÊN CÁC
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 2.1 Mẫu nấm thực nghiệm (X)
1.1 Các phần mềm và trang web sử dụng
Ngân hàng cơ sở dữ liệu sinh học NCBI (national Center for Biotechnology Information) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) phần mềm dùng cho việc thu thập tìm kiếm dữ liệu thông tin Genbank: Dùng để tìm kiếm thông tin như trình tự nucleotide và protein, taxonomy, genome, cấu trúc protein, thông tin vùng domain và bài báo đã công bố trên Pubmed Pubmed: dùng để thu thập toàn bộ các công trình nghiên cứu đã được công bố khoa học về Y – Sinh trong MEDLINE
Phần mềm trực tuyến BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) trên NCBI: giúp tìm kiếm những trình tự tương đồng với các trình tự mục tiêu bằng cách các đoạn mồi khi đưa vào chương trình sẽ được so sánh với những trình tự được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu Genbank của NCBI
IDT analyzer (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer) giúp khảo sát các thông số quan trọng của mồi như: chiều dài của mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy của mồi và khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp (Hairpin-dimer, Self-dimer, Hetero-dimer)
Phần mềm Annhyb 4.946: là phần mềm dùng để kiểm tra độ đặc hiệu của mồi, đọc trình tự, tìm kiếm, sắp xếp trình tự
Phần mềm Chromas Lite 2.1.1: là phần mềm giúp đọc kết quả giải trình tự Phần mềm Bioedit: là phần mềm dùng để sắp xếp trình tự, so sánh và sắp giống cột các trình tự
Vật liệu sử dụng cho nghiên cứu bao gồm 2 mẫu nấm thuộc chi Pleurotus được thu mua tại Aeon Mall, thành phố Thuận An, tỉnh Bình Dương
Hình 2.1 Mẫu nấm thực nghiệm (X)
Các dụng cụ được sử dụng trong quá trình nghiên cứu chính bao gồm: kẹp lấy mẫu, chày, đèn cồn, eppendorf, micropipet, đầu túyp, ống đong, erlen, beaker,
Máy Vortex (Vortex ZX3, Velp Ý)
Máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức)
Tủ đông, cân kĩ thuật (Satorious, Đức)
Máy đo quang phổ (Scanning UV/VIS, Smart Spec, BioRad)
1.2.3 Hóa chất cần thiết cho quá trình tách chiết RNA
1.2.4 Hóa chất cần thiết cho quá trình Real-time PCR và điện di
Hình 2.2 Mẫu nấm thực nghiệm (T)
Primer reverse 10 μM dd H2O (đã hấp)
Hình 2.3 Quy trình nghiên cứu
2.1 Phương pháp khai thác dữ liệu
Tìm kiếm và thu thập dữ liệu từ các bài báo khoa học theo các nguồn dữ liệu khoa học trên Google Scholar, PUBMED có liên quan đến đề tài với các từ khoá:
Pleurotus, Lovastatin, với các thông tin:
- Tổng quan về chi Pleurotus
- Phương pháp định danh đã được thực hiện
- Trình tự vùng gene và các cặp mồi tương ứng
2.2 Phương pháp đánh giá mồi
Sau khi thu nhận thông tin và trình tự các cặp mồi, tiến hành kiểm tra các thông số vật lý và độ bắt cặp đặt hiệu của mồi bằng phần mềm IDT analyzer và chương trình BLAST của NCBI
Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi:
Sử dụng phần mềm Annhyb 4.964 để kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi và trình tự đích
Sau khi đánh giá các thông số vật lý của mồi và xác định đã đạt tiêu chuẩn, tiếp tục thực hiện quá trình đánh giá kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm BLAST trên NCBI để kiểm tra mức độ tương đồng và tính phổ quát của mồi
Thu nhận trình tự FASTA của gene trên ngân hàng Genbank của NCBI, tiến hành sắp giống cột, kiểm tra kích thước sản phẩm So sánh kết quả dự kiến với kết quả của các bài báo đã công bố về gene đã chọn
2.3.1 Tách chiết RNA theo phương pháp Trizol/Chloroform
- Bước 1: Thu nhận mẫu mô và tách RNA bằng trizol
+ Dùng que cấy vòng (vô trùng) tiến hành lấy một phần tai nấm (khoảng 1,5g) vào trong trong ống eppendorf, sau đú tiến hành thờm 500 àl Trizol và 100 àl chloroform vào trong eppendorf chứa sẵn một phần tai nấm, sau đó tiến hành đem đi vortex
+ Tiến hành ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi
+ Thu dịch nổi, tiến hành bổ sung V àl Isopropanol lạnh
+ Tiến hành ly tâm mẫu ở 13000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 o C
+ Loại bỏ dịch nổi, thu phần kết tủa Bổ sung 1 ml ethanol 75%, lắc đều + Ly tâm mẫu ở 13000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 o C
+ Loại bỏ dịch nổi Phơi khô mẫu tự nhiên
2.3.2 Phản ứng chuyển đổi cDNA
Phản ứng chuyển đổi RNA thành cDNA được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit
2.3.3 Khuếch đại trình tự bằng phản ứng Real - time PCR
Sau khi thực hiện tách chiết RNA và chuyển đổi cDNA Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR
Quy trình Real – time PCR xác định sản phẩm khuếch đại bằng thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR green SYBR green liên kết với tất cả các DNA mạch đôi hiện diện trong mẫu và phát ra tín hiệu huỳnh quang Tuy nhiên, để đảm bảo tính đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, cần tiến hành phân tích melt curve vì SYBR green có thể liên kết với các trình tự DNA không đặc hiệu.
Thành phần của một phản ứng Real-time PCR:
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng Real-time PCR
Forward Primer (10uM) 0,25 μl Reverse Primer (10uM) 0,25 μl cDNA n μl dd H2O m μl
Chu kỳ Real-time PCR (40X):
Hình 2.4 Chu trình nhiệt độ
2.3.4 Kiểm tra độ tinh sạch của RNA
Tiến hành đo OD ở các bước sóng 230 nm, 260 nm và 280 nm để xác định độ tinh sạch, nồng độ và các thông số có liên quan Tỉ số A260/A280 dùng để đánh giá độ tinh sạch của DNA Tỉ số A260/A280 trên 2,0 cho thấy RNA đã tách chiết được tinh sạch Trường hợp tỉ số nhỏ hơn 1,8 chứng tỏ mẫu còn nhiễm protein Chỉ số A230 cho thấy mẫu RNA có khả năng bị nhiễm tạp chất (carbonhydrate hoặc phenol)
- RNA sau khi tách chiết được pha loãng 50 lần bằng dd H2O
- Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào cuvette và đo nồng độ RNA ở các bước sóng 230 nm, 260 nm, 280 nm
- Độ tinh sạch của RNA được xác định bằng tỉ số A260/A280
- Tỉ số này lớn hơn 2,0 là đạt yêu cầu.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hình 3.1 Kết quả khảo sát Annhyb của cặp mồi LovD-F/LovD-R
1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO
1.1 Kết quả khảo sát in silico gene LovD và gene LovF
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát insilico của gene LovD và gene LovF
Gene Kí hiệu Trình tự (5’-3’)
Kích thước sản phẩm khuếch đại
∆G (kcal/mol -1 ) Tài liệu tham khảo
Chú thích: Y là C hoặc T, W là A hoặc T, D là A hoặc G hoặc T, M là A hoặc C, R là A hoặc G, Tm là nhiệt độ nóng chảy của mồi, Hairpin dimer là cấu trúc kẹp tóc, Self dimer tự bắt cặp của mồi, Hetero dimer là mồi xuôi và mồi ngược bắt cặp với nhau
Kết quả khảo sát gene LovD cho thấy cặp mồi LovD-F/LovD-R đạt yêu cầu để khuếch đại vùng gene LovD của chi nấm Pleurotus: chiều dài 2 mạch là 21 nucleotide nằm trong khoảng 18-28 bp % GC của cặp mồi là 57,10% nằm trong khoảng 40-60
%, nhiệt độ nóng chảy của mồi là 56,70 o C nằm trong khoảng 50 o C đến 65 o C
Kết quả khảo sát gene LovF cho thấy thấy cặp mồi LovF-F/LovF-R đạt yêu cầu để khuếch đại vùng gene LovF của chi nấm Pleurotus: chiều dài mồi LovF-F là
19 và mồi LovF-R là 20 nucleotide nằm trong khoảng 18-28 bp % GC của mồi LovF-
F là 45% và LovF-R 42,1% nằm trong khoảng 40-60 %, nhiệt độ nóng chảy của mồi là LovF-F là 53,3 o C và mồi LovF-R là 49,8 o C xấp xỉ thuộc khoảng 50 o C đến 65 o C
Chiều dài của các mồi nằm trong khoảng 18-28 bp Nếu mồi quá ngắn sẽ làm giảm độ đặc hiệu, mồi quá dài sẽ tăng khả năng xuất hiện các cấu trúc thứ cấp
%GC nằm trong khoảng 40 – 60%, % GC quá cao sẽ làm vùng gene khó biến tính trong quá trình PCR Tránh lặp lại các base G hay C liên tiếp dài hơn 3 base Tại đầu 3’ của mồi, cần có base G hay C để tăng độ đặc hiệu cho việc bắt cặp
Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi nằm trong khoảng từ 50 o C đến 65 o C Cấu trúc thứ cấp gồm có:
(1) Hairpin dimer (các base tự bắt cặp trong cùng một oligonucleotide) (2) Self dimer (hai oligonucleotide giống nhau tự bắt cặp với nhau)
(3) Hetero dimer (các oligonucleotide khác nhau bắt cặp với nhau)
Cấu trúc thứ cấp càng bền vững thì mồi càng khó bắt cặp vào mạch gốc để thực hiện phản ứng PCR Vì thế, cần phải kiểm tra độ bền vững của các liên kết trong các cấu trúc thứ cấp, được tính toán thông qua giá trị ∆G (sự biến đổi năng lượng tự do) Mồi được đánh giá tốt khi ∆G >-9 (𝑘𝑐𝑎𝑙 𝑚𝑜𝑙𝑒 -1 ) thì liên kết trên sẽ kém bền vững và không ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng PCR
1.2 Kết quả kiểm tra cặp mồi LovD-F/LovD-R trên phần mềm Annhyb
Hình 3.1 Kết quả khảo sát Annhyb của cặp mồi LovD-F/LovD-R
Kết quả Annhyb cho thấy kích thước và vị trí bắt cặp của cặp mồi LovD- F/LovD-R lên trên trình tự loài thuộc chi đại diện là Pleurotus với với mã số truy cập là XM_036772010 Mồi xuôi LovD-F có điểm số bắt cặp là 57,14 %, mồi ngược LovD-R có điểm số bắt cặp là 39,52 % Mồi xuôi LovD-F bắt cặp bổ sung tại vị trí
188 – 208 và mồi ngược LovD-R bắt cặp bổ sung tại vị trí 271 – 292 Sản phẩm dự kiến cho gene LovD vào khoảng 104 bp
1.3 Kết quả kiểm tra cặp mồi LovD-F/LovD-R trên phần mềm BLAST
Hình 3.2 Kết quả khảo sát BLAST của cặp mồi LovD-F/LovD-R
Hình trên thể hiện kết quả BLAST của cặp mồi LovD, kết quả cho thấy cặp mồi LovD-F/LovD-R có mã số truy cập là XM_036772010 bắt cặp được một phần vùng trình tự của loài thuộc chi Pleurotus Do đó, cặp mồi LovD-F/LovD-R có thể khuếch đại được vùng transesterase với E- value là 113 Query cover là 19%, Max score là 22,9%, Total Score là 22,9% và Max ident là 100% Cặp mồi bắt cặp tại vùng trình tự gene LovD với điểm bắt cặp (score) là 22,9 bits
1.4 Kết quả kiểm tra cặp mồi LovF-F/LovF-R trên phần mềm Annhyb
Hình 3.3 Kết quả khảo sát Annhyb của cặp mồi LovF-F/LovF-R
Kết quả Annhyb cho thấy kích thước và vị trí bắt cặp của cặp mồi LovF- F/LovF-R lên trên trình tự loài thuộc chi đại diện là Pleurotus với với mã số truy cập là XM_036772119 Mồi xuôi LovF-F có điểm số bắt cặp là 51%, mồi ngược LovF-R có điểm số bắt cặp là 43,68% Mồi xuôi LovF-F bắt cặp bổ sung tại vị trí 377 – 396 và mồi ngược LovF-R bắt cặp bổ sung tại vị trí 591 - 611 Sản phẩm dự kiến cho gene
1.5 Kết quả kiểm tra cặp mồi LovF-F/LovF-R trên phần mềm BLAST
Hình 3.4 Kết quả khảo sát BLAST của cặp mồi LovF-F/LovF-R
Kết quả BLAST của cặp mồi LovD cho thấy cặp mồi LovF-F/LovF-R có mã truy cập XM_036772119 bắt cặp được một phần vùng trình tự của chi Pleurotus Cặp mồi này khuếch đại được vùng LDKS với các thông số: E-value = 14, Query cover = 33%, Max score = 24,7%, Total Score = 24,7%, Max ident = 100% Điểm bắt cặp (score) là 24,7 bits tại vùng trình tự gene LovF.
Các cặp mồi được khảo sát cho thấy các thông số vật lý và độ đặc hiệu đạt yêu cầu Chiều dài của các mồi đều nằm trong khoảng 18-28 bp, %GC nằm trong khoảng
40 – 60%, nhiệt độ nóng chảy của mồi nằm trong khoảng 49 o C đến 65 o C Các cặp
23 mồi bắt cặp được với trình tự mồi khảo sát trên phần mềm Blast cho thấy có thể khuếch đại được vùng trình tự tương ứng
2.1 Kết quả tách chiết RNA và chuyển đổi cDNA
Hai mẫu nấm thuộc chi Pleurotus được thu mua từ Aeon Mall, thành phố Thuận An, tỉnh Bình Dương được tiến hành tách chiết RNA theo phương pháp Trizol/Chloroform
Sau khi tách chiết, tiến hành kiểm tra mức độ tinh sạch của RNA bằng phương pháp hấp phụ quang phổ ở các bước sóng 260 nm, 230 nm và 280 nm Tỉ số trên 2,0 là đạt yêu cầu
Sau đó, tiến hành chuyển cDNA và kiểm tra độ tinh sạch của cDNA:
Mẫu cDNA sau khi pha loãng 50 lần bằng dd H2O, chuyển toàn bộ dung dịch vào cuvette và đo nồng độ ở các bước sóng 260 nm, 280 nm, 230 nm Độ tinh sạch của cDNA được xác định bằng tỉ số A260/A280 Tỉ số nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 là đạt yêu cầu
Tiến hành chuẩn nồng độ cDNA cho phản ứng RT-PCR là 200ng
Cụng thức: Số àl cDNA cần hỳt = 200𝑛𝑔
Bảng 3.2 Kết quả chuẩn nồng độ cDNA
Mẫu tỏch chiết Nồng độ cDNA Số àL cDNA cần hỳt cho 200ng
2.2 Kết quả khuếch đại trình tự gene LovD trên mẫu nấm thuộc chi
Kết quả đồ thị khuếch đại Real-time PCR cho thấy các mẫu nấm đều dương tính với gen LovD, trong khi mẫu chứng âm trả về kết quả âm tính Điều này chứng tỏ cả hai mẫu nấm đều có biểu hiện của gen LovD Dữ liệu về chu kỳ biểu hiện gen được trình bày chi tiết trong bảng bên dưới.
Bảng 3.3 Kết quả khuếch đại gene LovD
Hình 3.5 Kết quả khuếch đại gene LovD
TỔNG QUAN
Đặt điểm chung của chi nấm Pleurotus
Hình 1.1 Pleurotus florida (Nguyễn Như Ngọc và cs., 2017)
Hình 1.2 Pleurotus sajor-caju (Nguyễn Thị Ngọc Minh và cs., 2015)
Pleurotus (Jacq Fr.) P Kumm là một chi nấm thuộc họ Pleurotaceae, bộ Agaricales, lớp Hymenomycetes, ngành Eumycota (Nấm thật) Phần lớn chúng sống hoại sinh Phân bố phần lớn tại Châu Phi, Châu Âu và Châu Á với 207 loài đã được công nhận (Catalogue of Life, 2021), là loài được trồng phổ biến thứ ba trên thế giới (Iwona và cs., 2018)
Nhìn chung, các loài nấm thuộc chi Pleurotus đều có cấu tạo gồm : Mũ nấm, phiến nấm và cuống nấm Mũ nấm thường có hình quạt hoặc hình tròn, tai nấm kéo dài xuống cuống và thường có màu từ trắng đến xám (Vi Minh Thuận và cs., 2015)
Các loài nấm trong chi Pleurotus có chứa hàm lượng protein cao, có đủ 8 loại acid amin không thay thế, không có độc tố (Nguyễn Thị Bích Thùy và cs., 2015)
Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra chi Pleurotus có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý như lovastatin, polysaccharide, triterpenoid, carbohydrates, disaccharide (Trần Thị Vân Thi và cs.,2016) Đại diện cho chi Pleurotus là Pleurotus florida hay còn gọi là nấm sò trắng Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho biết loại nấm này có khả năng hoạt động chống oxy hóa, ức chế sự phát triển khối u, kháng viêm (Nuhu Alam và cs., 2008) Ngoài ra, một loài khác là Pleurotus sajor-caju còn được gọi là nấm sò xám cũng đã được xác định là giàu protein, vitamin, có tác dụng giúp tăng huyết áp thông qua các thành phần hoạt tính và đặc biệt là giảm cholesterol và chất béo trong máu (Alam và cs., 2008).
Phân loại khoa học của chi nấm Pleurotus
Thành phần dinh dưỡng của một vài loài nấm thuộc chi Pleurotus
Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Pleurotus có chứa hàm lượng hoạt tính sinh học dồi dào bao gồm: protein, vitamin (B12, B2, B1, ), chất khoáng
(Fe, Zn, Mg, ), carbohydrates, disaccharide cao, trehalose, hàm lượng chất béo thấp (Feeney và cs., 2014)
Trong nấm Pleurotus có chứa hầu hết các khoáng chất thiết yếu về mặt dinh dưỡng như: photpho, kali, canxi, sắt, kẽm,…(Raman và cs., 2021)
Vitamin là hợp chất luôn có mặt trong cuộc sống Trong nấm có các loại vitamin phong phú như B12, B2, B6, caroten, dưới dạng các hợp chất như thiamin, biotin, niacin
Nấm Pleurotus có hàm lượng axit folic đặc biệt cao, một chất dinh dưỡng thiết yếu mà cơ thể không thể tự tổng hợp được và phải bổ sung thông qua chế độ ăn uống (Raman et al., 2021) Do đó, việc tiêu thụ nấm Pleurotus là một cách tuyệt vời để đáp ứng nhu cầu axit folic của cơ thể, góp phần duy trì sức khỏe và ngăn ngừa các vấn đề sức khỏe liên quan đến thiếu hụt axit folic.
Các loài nấm thuộc chi Pleurotus cung cấp lượng protein dồi dào Hàm lượng protein trong nấm giao động từ 11 g đến 42 g trên 100 g quả khô Protein trong chi nấm Pleurotus có chất lượng vượt trội vì trong các loài như Pleurotus ostreatus, Pleurotus eryngii, Pleurotus sajor-caju chứa các protein hoàn chỉnh với sự phân bố tốt của các acid amin thiết yếu cũng như các acid amin không thiết yếu (Khan và cs., 2012)
Các loài nấm thuộc chi Pleurotus được xem là nguồn cung cấp carbonhydrate và chất xơ tốt Carbohydrate chủ yếu có trong những loại nấm này dưới dạng polysaccharide hoặc glycoprotein Polysaccharide phong phú nhất có trong các loài nấm thuộc chi Pleurotus là e chitin, α- and β-glucans, và các hemicelluloses Hàm lượng polysaccharide thường dao động từ 36 g đến 60 g trên 100 g quả khô (Khan và cs., 2008)
Polysaccharide có khả năng hoạt hóa miễn dịch tế bào, thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào lympho, kích hoạt tế bào lymphoB và lymphoT Nhiều thí nghiệm đã chứng minh rằng polysaccharid có trong chi Pleurotus có nhiều hoạt tính sinh học bao gồm chống khối u, chống oxy hóa (Zhang và cs., 2020)
Eryngeolysin chống tăng sinh các tế bào bạch cầu, kháng vi khuẩn Bacillus spp (Nguyễn Thị Bích Thùy và cs., 2019)
Lovastatin (Monacolin K hay Mevinolin) được sử dụng để điều trị tăng cholesterol trong máu, phòng ngừa bệnh tim mạch bằng cách ức chế cạnh tranh (3S)- hydroxy-3 methylglutaryl Coenzyme A reductase (HMG-CoA reductase), ngăn cản HMG - CoA chuyển hóa thành mevalonat (tiền thân của cholesterol) Cụm gene Lovastatin chứa 18 gene tham gia vào quá trình chuyển hóa, nhưng 5 gene trong số này là LovA, LovB, LovC, LovD và LovF đã được xác định là cần thiết cho sự hình thành Lovastatin Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra một số ứng dụng quan trọng của Lovastatin bao gồm kháng khuẩn, kháng viêm, điều trị các loại ung thư, các bệnh về xương và ngăn ngừa các rối loạn thần kinh (Barrios-González và cs., 2010)
Hình 1.3 Lovastatin (Gaber và cs., 2020)
Ứng dụng của chi nấm Pleurotus trong y học
Chi nấm Pleurotus cung cấp nhiều dinh dưỡng quý giá đồng thời chứa nhiều dược chất có lợi cho sức khỏe: điều hòa cholesterol, giảm rối loạn tiêu hóa, chống ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, bảo vệ gan và tăng cường miễn dịch (Lewinsohn và cs., 2000)
7 nấm này còn được phát hiện có đặt tính chống oxy hoá do có chứa các hợp chất phenolics, ergothioneine (ERGO) và selenium (Se) (Zhang và cs., 2020)
Các loại chiết xuất khác nhau từ quả thể của nấm Pleurotus đã được báo cáo là chất chống ung thư tiềm năng
Chiết xuất từ nước nóng của Pleurotus ostreatus đã cho thấy việc ức chế sự gia tăng của các tế bào ung thư vú ở người (Khan và cs., 2012)
Chiết xuất polysaccharide từ sợi nấm và thể quả nấm Pleurotus pulmonarius có tác dụng điều chỉnh giảm sự bám dính của tế bào ung thư ruột kết, can thiệp trực tiếp vào quá trình tiến triển và di căn của ung thư β-glucan có trong nấm Pleurotus citronopileatus là hoạt chất quan trọng với các tính năng sinh học như hỗ trợ điều trị khối u, chống nhiễm xạ, chữa lành vết thương, giảm các triệu chứng viêm mũi dị ứng và viêm khớp (Nguyễn Thị Bích Hằng và cộng sự, 2015).
Các phân đoạn polysaccharide chiết xuất từ Pleurotus sajor-caju làm giảm số lượng tế bào tân sinh có trong dịch cổ trướng của chuột (Khan và cs., 2012), giúp điều trị ung thư ruột kết (Patel và cs., 2012)
Eryngeolysin được phân lập từ Pleurotus eryngii ức chế sự phát triển của tế bào bệnh bạch cầu (Gregori và cs., 2007)
Các dạng oxy hoạt động (ROS) là những phân tử chứa oxy có tính oxy hóa cao và không bền, dễ dàng tấn công các thành phần tế bào như lipit, DNA, protein Chúng gây ra nhiều bệnh lý như ung thư, tim mạch, tiểu đường, và thúc đẩy quá trình lão hóa Trong khi đó, nấm Pleurotus florida chứa hàm lượng cao hợp chất phenolic và flavonoid có khả năng bắt các gốc tự do, làm chậm lão hóa, bảo vệ gan và phòng ngừa bệnh tật.
Chiết xuất nấm Pleurotus ostreatus từ nước và ethanol có tác dụng chống oxy hóa mạnh, thể hiện thông qua sự ức chế quá trình peroxy hóa lipid và hình thành malondialdehyde trong hệ thống liposome phosphatidylcholine (Filipek và cs., 1992)
Do có chứa hoạt tính chống oxy hóa nên chiết xuất từ các loại nấm Pleurotus đã được ứng dụng để sản xuất các loại thực phẩm chức năng có tác dụng chống lão hóa (Lê Thanh Hải và cs., 2013), chống oxy hóa lipid và biến màu cơ thịt cá trong quá trình bảo quản lạnh (Bao và cs., 2009)
Các thành phần hoạt tính có trong một số loài nấm thuộc chi Pleurotus cho thấy các hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus bị ức chế sự phát triển bởi RNase được tinh chế từ Pleurotus sajor-caju Một protein 10 kDa, được chỉ định là eryngin đã được phân lập từ Pleurotus eryngii, cho thấy sự ức chế phát triển của sợi nấm ở Fusarium oxysporum và Mycosphaerella arachidicola (Khan và cs., 2012)
Một số loài nấm còn biểu hiện hoạt tính kháng virus Điển hình, một loại laccase tinh chế từ nấm sò Pleurotus ostreatus đã chứng minh khả năng ức chế sự xâm nhập của virus viêm gan C vào các tế bào máu ngoại vi và tế bào gan HepG2 (Fakharany và cộng sự, 2010; Khan và cộng sự, 2012).
Giảm mức cholesterol cao trong máu đóng một vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa xơ vữa động mạch
Hàm lượng chất xơ cao được cho là nguyên nhân gây ra các hoạt động hạ lipid máu của các loài nấm thuộc chi Pleurotus, vì chất xơ ảnh hưởng đến sự gia tăng bài tiết cholesterol, acid mật hoặc các lipid khác
Pleurotus ostreatus giúp phòng ngừa bệnh tim mạch vành do hàm lượng chất xơ, sterol, protein và các nguyên tố vi lượng cao (Bobek và cs., 1994)
2 CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP LOVASTATIN
Các nghiên cứu gần đây cho thấy enzyme tổng hợp polyketide có tính khử cao (HR-PKS) tham gia vào quá trình tổng hợp Lovastatin, cụ thể là lovastatin nonaketide synthase (LovB) và the lovastatin diketide synthase (LovF) Chúng chịu trách nhiệm lắp ráp khung carbon của Lovastatin bằng cách sử dụng acetyl-CoA và malonyl-CoA Cụm gene hoàn chỉnh bao gồm 18 gene, tạo thành một cụm gen 64 kb, chứa các gene mã hóa cho enzyme LNKS và LDKS.
Diketide synthase là một enzyme được mã hóa bởi LovF, gồm có bảy miền xúc tác là: KS (ketosynthase), MAT (malonyl-CoA:ACP acyltransferase ), DH (dehydratase), MT (methyltransferase), ER (enoylreductase), KR (ketoreductase) và ACP (acyl carrier protein) Diketide synthase tham gia vào quá trình tổng hợp 2- methybutyryl –CoA (Mulder và cs., 2015) Miền protein mang acyl (ACP) của LovF có vai trò chuyển nhóm α-methylbutyrate đến LovD, và sau đó đến Monacolin J
Bước cuối cùng của con đường sinh tổng hợp Lovastatin được xúc tác bởi transferase mã hóa bởi gene LovD Transferase có nhiệm vụ kết nối 2-mehtylbutyryl với monacolin J để tạo ra dạng acid của lovastatin Sự tương tác giữa LovD và LovF đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển diketide từ LovF sang LovD một cách nhanh chóng, đảm bảo quá trình sinh tổng hợp Lovastatin diễn ra hiệu quả (Xie và cs., 2006) Ngoài ra, chỉ có R-Smethylbutyryl- ACP được thiết kế riêng hoàn toàn mới có thể truy cập được bởi LovD (nghĩa là không có chất trung gian acyl nào được chuyển giao) ( Barrios-González và cs., 2009)
Hình 1.4 Con đường sinh tổng hợp Lovastatin ở A terreus (Mulder và cs., 2015)
LNKS: Lovastatin nonketide synthase ER: Enoylreductase
Malonyl-CoA: ACP acyltransfer ase
PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ
Các phần mềm và trang web sử dụng
Ngân hàng cơ sở dữ liệu sinh học NCBI (national Center for Biotechnology Information) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) phần mềm dùng cho việc thu thập tìm kiếm dữ liệu thông tin Genbank: Dùng để tìm kiếm thông tin như trình tự nucleotide và protein, taxonomy, genome, cấu trúc protein, thông tin vùng domain và bài báo đã công bố trên Pubmed Pubmed: dùng để thu thập toàn bộ các công trình nghiên cứu đã được công bố khoa học về Y – Sinh trong MEDLINE
Phần mềm trực tuyến BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) trên NCBI: giúp tìm kiếm những trình tự tương đồng với các trình tự mục tiêu bằng cách các đoạn mồi khi đưa vào chương trình sẽ được so sánh với những trình tự được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu Genbank của NCBI
IDT analyzer (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer) giúp khảo sát các thông số quan trọng của mồi như: chiều dài của mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy của mồi và khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp (Hairpin-dimer, Self-dimer, Hetero-dimer)
Phần mềm Annhyb 4.946: là phần mềm dùng để kiểm tra độ đặc hiệu của mồi, đọc trình tự, tìm kiếm, sắp xếp trình tự
Phần mềm Chromas Lite 2.1.1: là phần mềm giúp đọc kết quả giải trình tự Phần mềm Bioedit: là phần mềm dùng để sắp xếp trình tự, so sánh và sắp giống cột các trình tự.
Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu sử dụng cho nghiên cứu bao gồm 2 mẫu nấm thuộc chi Pleurotus được thu mua tại Aeon Mall, thành phố Thuận An, tỉnh Bình Dương
Hình 2.1 Mẫu nấm thực nghiệm (X)
Các dụng cụ được sử dụng trong quá trình nghiên cứu chính bao gồm: kẹp lấy mẫu, chày, đèn cồn, eppendorf, micropipet, đầu túyp, ống đong, erlen, beaker,
Máy Vortex (Vortex ZX3, Velp Ý)
Máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức)
Tủ đông, cân kĩ thuật (Satorious, Đức)
Máy đo quang phổ (Scanning UV/VIS, Smart Spec, BioRad)
1.2.3 Hóa chất cần thiết cho quá trình tách chiết RNA
1.2.4 Hóa chất cần thiết cho quá trình Real-time PCR và điện di
Hình 2.2 Mẫu nấm thực nghiệm (T)
Primer reverse 10 μM dd H2O (đã hấp)
Hình 2.3 Quy trình nghiên cứu
Phương pháp khai thác dữ liệu
Tìm kiếm và thu thập dữ liệu từ các bài báo khoa học theo các nguồn dữ liệu khoa học trên Google Scholar, PUBMED có liên quan đến đề tài với các từ khoá:
Pleurotus, Lovastatin, với các thông tin:
- Tổng quan về chi Pleurotus
- Phương pháp định danh đã được thực hiện
- Trình tự vùng gene và các cặp mồi tương ứng
Phương pháp đánh giá mồi
Sau khi thu nhận thông tin và trình tự các cặp mồi, tiến hành kiểm tra các thông số vật lý và độ bắt cặp đặt hiệu của mồi bằng phần mềm IDT analyzer và chương trình BLAST của NCBI
Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi:
Sử dụng phần mềm Annhyb 4.964 để kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi và trình tự đích
Sau khi đánh giá các thông số vật lý của mồi và xác định đã đạt tiêu chuẩn, tiếp tục thực hiện quá trình đánh giá kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm BLAST trên NCBI để kiểm tra mức độ tương đồng và tính phổ quát của mồi
Thu nhận trình tự FASTA của gene trên ngân hàng Genbank của NCBI, tiến hành sắp giống cột, kiểm tra kích thước sản phẩm So sánh kết quả dự kiến với kết quả của các bài báo đã công bố về gene đã chọn.
Phương pháp thực nghiệm
2.3.1 Tách chiết RNA theo phương pháp Trizol/Chloroform
- Bước 1: Thu nhận mẫu mô và tách RNA bằng trizol
+ Dùng que cấy vòng (vô trùng) tiến hành lấy một phần tai nấm (khoảng 1,5g) vào trong trong ống eppendorf, sau đú tiến hành thờm 500 àl Trizol và 100 àl chloroform vào trong eppendorf chứa sẵn một phần tai nấm, sau đó tiến hành đem đi vortex
+ Tiến hành ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi
+ Thu dịch nổi, tiến hành bổ sung V àl Isopropanol lạnh
+ Tiến hành ly tâm mẫu ở 13000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 o C
+ Loại bỏ dịch nổi, thu phần kết tủa Bổ sung 1 ml ethanol 75%, lắc đều + Ly tâm mẫu ở 13000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 o C
+ Loại bỏ dịch nổi Phơi khô mẫu tự nhiên
2.3.2 Phản ứng chuyển đổi cDNA
Phản ứng chuyển đổi RNA thành cDNA được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit
2.3.3 Khuếch đại trình tự bằng phản ứng Real - time PCR
Sau khi thực hiện tách chiết RNA và chuyển đổi cDNA Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR
Quy trình Real – time PCR được xác định bằng cách sử dụng thuốc nhuộm SYBR green Khi SYBR green được thêm vào mẫu sẽ bám lên tất cả DNA mạch đôi và phát tín hiệu Tuy nhiên, SYBR green có thể bám vào bất kỳ DNA mạch đôi nào, bám vào các trình tự không đặc hiệu vì thế cần phân tích melt curve
Thành phần của một phản ứng Real-time PCR:
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng Real-time PCR
Forward Primer (10uM) 0,25 μl Reverse Primer (10uM) 0,25 μl cDNA n μl dd H2O m μl
Chu kỳ Real-time PCR (40X):
Hình 2.4 Chu trình nhiệt độ
2.3.4 Kiểm tra độ tinh sạch của RNA
Tiến hành đo OD ở các bước sóng 230 nm, 260 nm và 280 nm để xác định độ tinh sạch, nồng độ và các thông số có liên quan Tỉ số A260/A280 dùng để đánh giá độ tinh sạch của DNA Tỉ số A260/A280 trên 2,0 cho thấy RNA đã tách chiết được tinh sạch Trường hợp tỉ số nhỏ hơn 1,8 chứng tỏ mẫu còn nhiễm protein Chỉ số A230 cho thấy mẫu RNA có khả năng bị nhiễm tạp chất (carbonhydrate hoặc phenol)
- RNA sau khi tách chiết được pha loãng 50 lần bằng dd H2O
- Sau đó, chuyển toàn bộ dung dịch vào cuvette và đo nồng độ RNA ở các bước sóng 230 nm, 260 nm, 280 nm
- Độ tinh sạch của RNA được xác định bằng tỉ số A260/A280
- Tỉ số này lớn hơn 2,0 là đạt yêu cầu
PHẦN III : KẾT QUẢ NGHIÊN
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả khảo sát in silico gene LovD và gene LovF
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát insilico của gene LovD và gene LovF
Gene Kí hiệu Trình tự (5’-3’)
Kích thước sản phẩm khuếch đại
∆G (kcal/mol -1 ) Tài liệu tham khảo
Chú thích: Y là C hoặc T, W là A hoặc T, D là A hoặc G hoặc T, M là A hoặc C, R là A hoặc G, Tm là nhiệt độ nóng chảy của mồi, Hairpin dimer là cấu trúc kẹp tóc, Self dimer tự bắt cặp của mồi, Hetero dimer là mồi xuôi và mồi ngược bắt cặp với nhau
Kết quả khảo sát gene LovD cho thấy cặp mồi LovD-F/LovD-R đạt yêu cầu để khuếch đại vùng gene LovD của chi nấm Pleurotus: chiều dài 2 mạch là 21 nucleotide nằm trong khoảng 18-28 bp % GC của cặp mồi là 57,10% nằm trong khoảng 40-60
%, nhiệt độ nóng chảy của mồi là 56,70 o C nằm trong khoảng 50 o C đến 65 o C
Kết quả khảo sát gene LovF cho thấy thấy cặp mồi LovF-F/LovF-R đạt yêu cầu để khuếch đại vùng gene LovF của chi nấm Pleurotus: chiều dài mồi LovF-F là
19 và mồi LovF-R là 20 nucleotide nằm trong khoảng 18-28 bp % GC của mồi LovF-
F là 45% và LovF-R 42,1% nằm trong khoảng 40-60 %, nhiệt độ nóng chảy của mồi là LovF-F là 53,3 o C và mồi LovF-R là 49,8 o C xấp xỉ thuộc khoảng 50 o C đến 65 o C
Độ dài của mồi nằm trong khoảng 18-28 cặp bazơ (bp) Mồi quá ngắn sẽ làm giảm độ đặc hiệu, nghĩa là mồi sẽ bám vào nhiều vị trí trên khuôn mẫu hơn, dẫn đến tạo ra nhiều sản phẩm không mong muốn Ngược lại, mồi quá dài sẽ làm tăng khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp, chẳng hạn như vòng kẹp tóc hoặc tương tác giữa các cặp bazơ không chuẩn, điều này có thể cản trở quá trình gắn mồi vào khuôn mẫu.
%GC nằm trong khoảng 40 – 60%, % GC quá cao sẽ làm vùng gene khó biến tính trong quá trình PCR Tránh lặp lại các base G hay C liên tiếp dài hơn 3 base Tại đầu 3’ của mồi, cần có base G hay C để tăng độ đặc hiệu cho việc bắt cặp
Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi nằm trong khoảng từ 50 o C đến 65 o C Cấu trúc thứ cấp gồm có:
(1) Hairpin dimer (các base tự bắt cặp trong cùng một oligonucleotide) (2) Self dimer (hai oligonucleotide giống nhau tự bắt cặp với nhau)
(3) Hetero dimer (các oligonucleotide khác nhau bắt cặp với nhau)
Cấu trúc thứ cấp càng bền vững thì mồi càng khó bắt cặp vào mạch gốc để thực hiện phản ứng PCR Vì thế, cần phải kiểm tra độ bền vững của các liên kết trong các cấu trúc thứ cấp, được tính toán thông qua giá trị ∆G (sự biến đổi năng lượng tự do) Mồi được đánh giá tốt khi ∆G >-9 (𝑘𝑐𝑎𝑙 𝑚𝑜𝑙𝑒 -1 ) thì liên kết trên sẽ kém bền vững và không ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng PCR
Kết quả kiểm tra cặp mồi LovD-F/LovD-R trên phần mềm Annhyb
Hình 3.1 Kết quả khảo sát Annhyb của cặp mồi LovD-F/LovD-R
Kết quả Annhyb cho thấy kích thước và vị trí bắt cặp của cặp mồi LovD- F/LovD-R lên trên trình tự loài thuộc chi đại diện là Pleurotus với với mã số truy cập là XM_036772010 Mồi xuôi LovD-F có điểm số bắt cặp là 57,14 %, mồi ngược LovD-R có điểm số bắt cặp là 39,52 % Mồi xuôi LovD-F bắt cặp bổ sung tại vị trí
188 – 208 và mồi ngược LovD-R bắt cặp bổ sung tại vị trí 271 – 292 Sản phẩm dự kiến cho gene LovD vào khoảng 104 bp
Kết quả kiểm tra cặp mồi LovD-F/LovD-R trên phần mềm BLAST
Hình 3.2 Kết quả khảo sát BLAST của cặp mồi LovD-F/LovD-R
Kết quả BLAST cho thấy cặp mồi LovD-F/LovD-R (XM_036772010) bắt cặp được với một phần trình tự của loài thuộc chi Pleurotus, khuếch đại được vùng transesterase E-value là 113 và cặp mồi bắt cặp với vùng trình tự gen LovD với điểm bắt cặp là 22,9 bits Các thông số khác bao gồm Query cover 19%, Max score 22,9% và Max ident 100%.
Kết quả kiểm tra cặp mồi LovF-F/LovF-R trên phần mềm Annhyb
Hình 3.3 Kết quả khảo sát Annhyb của cặp mồi LovF-F/LovF-R
Kết quả Annhyb cho thấy kích thước và vị trí bắt cặp của cặp mồi LovF- F/LovF-R lên trên trình tự loài thuộc chi đại diện là Pleurotus với với mã số truy cập là XM_036772119 Mồi xuôi LovF-F có điểm số bắt cặp là 51%, mồi ngược LovF-R có điểm số bắt cặp là 43,68% Mồi xuôi LovF-F bắt cặp bổ sung tại vị trí 377 – 396 và mồi ngược LovF-R bắt cặp bổ sung tại vị trí 591 - 611 Sản phẩm dự kiến cho gene
Kết quả kiểm tra cặp mồi LovF-F/LovF-R trên phần mềm BLAST
Hình 3.4 Kết quả khảo sát BLAST của cặp mồi LovF-F/LovF-R
Hình trên thể hiện kết quả BLAST của cặp mồi LovD, kết quả cho thấy cặp mồi LovF-F/LovF-R có mã số truy cập là XM_036772119 bắt cặp được một phần vùng trình tự của loài thuộc chi Pleurotus Do đó, cặp mồi LovF-F/LovF-R có thể khuếch đại được vùng LDKS với E- value là 14 Query cover là 33%, Max score là 24,7%, Total Score là 24,7% và Max ident là 100% Cặp mồi bắt cặp tại vùng trình tự gene LovF với điểm bắt cặp (score) là 24,7 bits
Các cặp mồi được khảo sát cho thấy các thông số vật lý và độ đặc hiệu đạt yêu cầu Chiều dài của các mồi đều nằm trong khoảng 18-28 bp, %GC nằm trong khoảng
40 – 60%, nhiệt độ nóng chảy của mồi nằm trong khoảng 49 o C đến 65 o C Các cặp
23 mồi bắt cặp được với trình tự mồi khảo sát trên phần mềm Blast cho thấy có thể khuếch đại được vùng trình tự tương ứng
Kết quả tách chiết RNA và chuyển đổi cDNA
Hai mẫu nấm thuộc chi Pleurotus được thu mua từ Aeon Mall, thành phố Thuận An, tỉnh Bình Dương Từ các mẫu nấm này, RNA được tách chiết và tinh sạch bằng phương pháp Trizol/Chloroform.
Sau khi tách chiết, tiến hành kiểm tra mức độ tinh sạch của RNA bằng phương pháp hấp phụ quang phổ ở các bước sóng 260 nm, 230 nm và 280 nm Tỉ số trên 2,0 là đạt yêu cầu
Sau đó, tiến hành chuyển cDNA và kiểm tra độ tinh sạch của cDNA:
Mẫu cDNA sau khi pha loãng 50 lần bằng dd H2O, chuyển toàn bộ dung dịch vào cuvette và đo nồng độ ở các bước sóng 260 nm, 280 nm, 230 nm Độ tinh sạch của cDNA được xác định bằng tỉ số A260/A280 Tỉ số nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 là đạt yêu cầu
Tiến hành chuẩn nồng độ cDNA cho phản ứng RT-PCR là 200ng
Cụng thức: Số àl cDNA cần hỳt = 200𝑛𝑔
Bảng 3.2 Kết quả chuẩn nồng độ cDNA
Mẫu tỏch chiết Nồng độ cDNA Số àL cDNA cần hỳt cho 200ng
2.2 Kết quả khuếch đại trình tự gene LovD trên mẫu nấm thuộc chi
Dựa vào đồ thị khuếch đại Real-time PCR, kết quả cho thấy gene LovD trên hai mẫu nấm đều dương tính và chứng âm có kết quả âm tính Kết quả cho thấy hai mẫu nấm trên đều có sự biểu hiện của gene LovD và có dữ liệu chu kỳ được trình bày trong bảng sau:
Bảng 3.3 Kết quả khuếch đại gene LovD
Hình 3.5 Kết quả khuếch đại gene LovD
Trong kỹ thuật real-time PCR sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green để khuếch đại và thu nhận tín hiệu, việc phân tích kết quả melting curve sau khi phản ứng khuếch đại hoàn thành là rất cần thiết Bởi thuốc nhuộm SYBR Green có khả năng phát tín hiệu huỳnh quang khi bắt cặp với bất kỳ phân tử DNA mạch đôi nào, kể cả các sản phẩm tự bắt cặp của mồi Do đó, phân tích melting curve giúp xác định được sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, tránh tình trạng báo kết quả dương tính giả do sự tự bắt cặp của mồi.
Kết quả kiểm tra melting curve cho thấy có hai đỉnh nhiệt độ đại diện tương ứng cho hai mẫu thực nghiệm
Mẫu T cho giá trị Tm1 là 76,55 và Tm2 là 63,59; mẫu X cho giá trị Tm1 là 79,64 cho thấy nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm Mẫu âm không bị nhiễm
Cả hai mẫu đều có giá trị Ct nên kết luận được mẫu T và X khuếch đại thành công và đặc hiệu cho gene LovD
Kết hợp giữa biểu đồ khuếch đại, biểu đồ phân tích đường cong nóng chảy (melting curve) chứng minh rằng có sự hiện diện và biểu hiện của gene mục tiêu
LovD trên mẫu nấm thực nghiệm thuộc chi Pleurotus
Hình 3.6 Biểu đồ phân tích đường cong nóng chảy của gene LovD
2.3 Kết quả khuếch đại trình tự gene LovF trên mẫu nấm thuộc chi
Sau khi tiến hành khuếch đại trình tự vùng gene LovF bằng phương pháp
Realtime PCR, kết hợp giữa quan sát biểu đồ và điện di sản phẩm Chưa ghi nhận được kết quả khuếch đại trình tự gene LovF
2.4 Kết quả giải trình tự
Trình tự gene LovD sau khi được khuếch đại được đem giải trình tự tại công ty Nam Khoa Kết quả giải trình tự được thể hiện trong hình sau:
Hình 3.7 Kết quả so sánh 2 mạch trình tự của gene LovD
Hình 3.8 Kết quả giải trình tự mạch F của gene LovD
Hình 3.9 Kết quả giải trình tự mạch R của gene LovD
Hình 3.10 Kết quả Blast giải trình tự của gene LovD
Kết quả Blast cho thấy trình tự gene thu nhận được có sự tương đồng cao với trình tự gene của loài Pleurotus ostreatus với điểm số tương đồng cao trên 90% Kết quả này chứng minh rằng trình tự thu nhận được dựa trên sản phẩm thu nhận được là trình tự gene LovD trên loài nấm thuộc chi Pleurotus
Trình tự gene LovF chưa ghi nhận được kết quả khuếch đại Vì thế chưa tiến hành giải trình tự.
