Khảo sát sự biểu hiện các gen trên con đường sinh tổng hợp lovastatin trên nấm chi Pleurotus
MỤC LỤC
1 TỔNG QUAN VỀ CHI NẤM PLEUROTUS 1.1 Đặt điểm chung của chi nấm Pleurotus
Thành phần dinh dưỡng của một vài loài nấm thuộc chi Pleurotus Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Pleurotus có chứa hàm lượng
Pleurotus có hàm lượng acid folic đặc biệt cao, là chất dinh dưỡng không thể tự sản xuất trong cơ thể mà phải được cung cấp qua chế độ ăn (Raman và cs., 2021). Protein trong chi nấm Pleurotus có chất lượng vượt trội vì trong các loài như Pleurotus ostreatus, Pleurotus eryngii, Pleurotus sajor-caju chứa các protein hoàn chỉnh với sự phân bố tốt của các acid amin thiết yếu cũng như các acid amin không thiết yếu (Khan và cs., 2012). Nhiều thí nghiệm đã chứng minh rằng polysaccharid có trong chi Pleurotus có nhiều hoạt tính sinh học bao gồm chống khối u, chống oxy hóa (Zhang và cs., 2020).
Lovastatin (Monacolin K hay Mevinolin) được sử dụng để điều trị tăng cholesterol trong máu, phòng ngừa bệnh tim mạch bằng cách ức chế cạnh tranh (3S)- hydroxy-3 methylglutaryl Coenzyme A reductase (HMG-CoA reductase), ngăn cản HMG - CoA chuyển hóa thành mevalonat (tiền thân của cholesterol). Cụm gene Lovastatin chứa 18 gene tham gia vào quá trình chuyển hóa, nhưng 5 gene trong số này là LovA, LovB, LovC, LovD và LovF đã được xác định là cần thiết cho sự hình thành Lovastatin. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra một số ứng dụng quan trọng của Lovastatin bao gồm kháng khuẩn, kháng viêm, điều trị các loại ung thư, các bệnh về xương và ngăn ngừa các rối loạn thần kinh (Barrios-González và cs., 2010).
Ứng dụng của chi nấm Pleurotus trong y học
Chiết xuất polysaccharide từ sợi nấm và thể quả của Pleurotus pulmonarius điều chỉnh giảm sự bám dính của các dòng tế bào ung thư ruột kết (HT29, HCT116), can thiệp trực tiếp vào sự tiến triển và di căn của ung thư. Trong nấm Pleurotus florida có chứa hàm lượng lớn tổng phenolic và tổng flavonoid, có chức năng bắt các gốc tự do, làm chậm quá trình lão hoá cơ thể, bảo vệ chức năng của gan, ngăn ngừa một số bệnh tai biến (Trần Thị Văn Thi và cs., 2016). Chiết xuất nấm Pleurotus ostreatus từ nước và ethanol có tác dụng chống oxy hóa mạnh, thể hiện thông qua sự ức chế quá trình peroxy hóa lipid và hình thành malondialdehyde trong hệ thống liposome phosphatidylcholine (Filipek và cs., 1992).
Do có chứa hoạt tính chống oxy hóa nên chiết xuất từ các loại nấm Pleurotus đã được ứng dụng để sản xuất các loại thực phẩm chức năng có tác dụng chống lão hóa (Lê Thanh Hải và cs., 2013), chống oxy hóa lipid và biến màu cơ thịt cá trong quá trình bảo quản lạnh (Bao và cs., 2009). Một số loài cũng cho thấy hoạt tính kháng virus như: một loại laccase tinh chế từ Pleurotus ostreatus có khả năng ức chế sự xâm nhập của virus viêm gan C vào tế bào máu ngoại vi và tế bào gan HepG2 (Fakharany và cs., 2010; Khan và cs., 2012). Hàm lượng chất xơ cao được cho là nguyên nhân gây ra các hoạt động hạ lipid máu của các loài nấm thuộc chi Pleurotus, vì chất xơ ảnh hưởng đến sự gia tăng bài tiết cholesterol, acid mật hoặc các lipid khác.
2 CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP LOVASTATIN
Một protein 10 kDa, được chỉ định là eryngin đã được phân lập từ Pleurotus eryngii, cho thấy sự ức chế phát triển của sợi nấm ở Fusarium oxysporum và Mycosphaerella arachidicola (Khan và cs., 2012). Pleurotus ostreatus giúp phòng ngừa bệnh tim mạch vành do hàm lượng chất xơ, sterol, protein và các nguyên tố vi lượng cao (Bobek và cs., 1994). Diketide synthase là một enzyme được mã hóa bởi LovF, gồm có bảy miền xúc tác là: KS (ketosynthase), MAT (malonyl-CoA:ACP acyltransferase ), DH (dehydratase), MT (methyltransferase), ER (enoylreductase), KR (ketoreductase) và ACP (acyl carrier protein).
Miền protein mang acyl (ACP) của LovF có vai trò chuyển nhóm α-methylbutyrate đến LovD, và sau đó đến Monacolin J (Hutchinson và cs, 2000). Sự tương tác giữa LovD và LovF đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển diketide từ LovF sang LovD một cách nhanh chóng, đảm bảo quá trình sinh tổng hợp Lovastatin diễn ra hiệu quả (Xie và cs., 2006). Ngoài ra, chỉ có R-Smethylbutyryl- ACP được thiết kế riêng hoàn toàn mới có thể truy cập được bởi LovD (nghĩa là không có chất trung gian acyl nào được chuyển giao) ( Barrios-González và cs., 2009).
1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Các dụng cụ được sử dụng trong quá trình nghiên cứu chính bao gồm: kẹp lấy mẫu, chày, đèn cồn, eppendorf, micropipet, đầu túyp, ống đong, erlen, beaker,.
2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp khai thác dữ liệu
Phương pháp đánh giá mồi
Sau khi thu nhận thông tin và trình tự các cặp mồi, tiến hành kiểm tra các thông số vật lý và độ bắt cặp đặt hiệu của mồi bằng phần mềm IDT analyzer và chương trình BLAST của NCBI. Sử dụng phần mềm Annhyb 4.964 để kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi và trình tự đích. Sau khi đánh giá các thông số vật lý của mồi và xác định đã đạt tiêu chuẩn, tiếp tục thực hiện quá trình đánh giá kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm BLAST trên NCBI để kiểm tra mức độ tương đồng và tính phổ quát của mồi.
Thu nhận trình tự FASTA của gene trên ngân hàng Genbank của NCBI, tiến hành sắp giống cột, kiểm tra kích thước sản phẩm. So sánh kết quả dự kiến với kết quả của các bài báo đã công bố về gene đã chọn.
Phương pháp thực nghiệm
Phản ứng chuyển đổi RNA thành cDNA được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit. Quy trình Real – time PCR được xác định bằng cách sử dụng thuốc nhuộm SYBR green. Khi SYBR green được thêm vào mẫu sẽ bám lên tất cả DNA mạch đôi và phát tín hiệu.
Tuy nhiên, SYBR green có thể bám vào bất kỳ DNA mạch đôi nào, bám vào các trình tự không đặc hiệu vì thế cần phân tích melt curve. Chỉ số A230 cho thấy mẫu RNA có khả năng bị nhiễm tạp chất (carbonhydrate hoặc phenol).
1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO
Kết quả khảo sát gene LovD cho thấy cặp mồi LovD-F/LovD-R đạt yêu cầu để khuếch đại vùng gene LovD của chi nấm Pleurotus: chiều dài 2 mạch là 21 nucleotide nằm trong khoảng 18-28 bp. Kết quả khảo sát gene LovF cho thấy thấy cặp mồi LovF-F/LovF-R đạt yêu cầu để khuếch đại vùng gene LovF của chi nấm Pleurotus: chiều dài mồi LovF-F là 19 và mồi LovF-R là 20 nucleotide nằm trong khoảng 18-28 bp. Nếu mồi quá ngắn sẽ làm giảm độ đặc hiệu, mồi quá dài sẽ tăng khả năng xuất hiện các cấu trúc thứ cấp.
Vì thế, cần phải kiểm tra độ bền vững của các liên kết trong các cấu trúc thứ cấp, được tính toán thông qua giá trị ∆G (sự biến đổi năng lượng tự do). 𝑚𝑜𝑙𝑒-1) thì liên kết trên sẽ kém bền vững và không ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng PCR. Kết quả Annhyb cho thấy kích thước và vị trí bắt cặp của cặp mồi LovD- F/LovD-R lên trên trình tự loài thuộc chi đại diện là Pleurotus với với mã số truy cập là XM_036772010. Kết quả Annhyb cho thấy kích thước và vị trí bắt cặp của cặp mồi LovF- F/LovF-R lên trên trình tự loài thuộc chi đại diện là Pleurotus với với mã số truy cập là XM_036772119.
2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Dựa vào đồ thị khuếch đại Real-time PCR, kết quả cho thấy gene LovD trên hai mẫu nấm đều dương tính và chứng âm có kết quả âm tính. Trong kỹ thuật này, thuốc nhuộm sử dụng để khuếch đại và thu nhận tín hiệu là SYBR green nên tiếp tục thực hiện phân tích kết quả melting cuver để tránh khả năng do SYBR green phát tín hiệu do mồi tự băt cặp với nhau ở cuối chu kỳ phản ứng. Kết hợp giữa biểu đồ khuếch đại, biểu đồ phân tích đường cong nóng chảy (melting curve) chứng minh rằng có sự hiện diện và biểu hiện của gene mục tiêu LovD trên mẫu nấm thực nghiệm thuộc chi Pleurotus.
Sau khi tiến hành khuếch đại trình tự vùng gene LovF bằng phương pháp Realtime PCR, kết hợp giữa quan sát biểu đồ và điện di sản phẩm. Kết quả Blast cho thấy trình tự gene thu nhận được có sự tương đồng cao với trình tự gene của loài Pleurotus ostreatus với điểm số tương đồng cao trên 90%. Kết quả này chứng minh rằng trình tự thu nhận được dựa trên sản phẩm thu nhận được là trình tự gene LovD trên loài nấm thuộc chi Pleurotus.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
Nguyễn Thị Bích Thùy, Ngô Xuân Nghiễn, Nguyễn Thế Thắng, Trần Đông Anh, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Văn Giang, Trần Thị Đào (2016), Đánh giá sinh trưởng và năng suất của nấm sò vua. Nguyễn Thị Bích Hằng và Ngô Thị Hồng Vân (2015), Nghiên cứu nhân giống và trồng nấm bào ngư vàng (Pleurotus citronopileatus) tại thành phố Đà Nẵng, Tạp chí khoa học xã hội, nhân văn và giáo dục. Trần Thị Văn Thi, Lê Lâm Sơn, Lê Trung Hiếu, Nguyễn Minh Nhung (2016), Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa và một số thành phần hóa học của nấm sò trắng (Pleurotus florida).
Preventing discoloration and lipid oxidation in dark muscle of yellowtail by feeding an extract prepared from mushroom (Flammulina velutipes) cultured medium. Mechanism of hypocholesterolemic effect of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) in rats: reduction of cholesterol absorption and increase of plasma cholesterol removal. Evaluation of Pleurotus ostreatus and Pleurotus sajor-caju nutritional characteristics when cultivated in different lignocellulosic wastes.