Một số loài nấm mốc, trong điều kiện thuận lợi, đã sản sinh ra độc tố, độc nhất là aflatoxin nhiễm vào lương thực thực phẩm gây nguy hiểm cho người và động vật.. Thêm vào đó, khí hậu Việ
TOÅNG QUAN 2 TOÅNG QUAN
Naám Moác
Nấm mốc là loài vi sinh vật có những đặc điểm sau:
◣ Không có diệp lục tố
◣ Sống ký sinh trên động vật, thực vật hoặc hoại sinh trên chất hữu cơ từ xác động vật, thực vật
◣ Thành phần cấu tạo gồm các nguyên tố như: C, H, O, N, S, P … là chủ yeáu
◣ Cấu trúc dinh dưỡng: hệ thống sợi mảnh, phân nhánh, màng tế bào có chaát chitin
◣ Sinh sản: bằng bào tử, rất đa dạng, số lượng rất lớn
◣ Nơi sống: khắp nơi (đất, nước, không khí, sinh vật, sản phẩm từ sinh vật, kể cả con người
Xét về điều kiện sinh sống, nấm mốc cần chất sinh dưỡng hữu cơ để sinh trưởng và phát triển Nhiệt độ và độ ẩm ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của nấm mốc Do 90 – 95 % cơ thể nấm mốc là nước, chất khô chỉ 5 – 10 % nên độ ẩm môi trường là nhân tố quan trọng đối với sự sinh trưởng của nấm mốc Tùy loài nấm mốc mà yêu cầu về độ ẩm khác nhau:
◣ Loài ưa khô: bào tử nẩy mầm ở < 80 % của độ ẩm tương đối, sinh trưởng tốt nhất ở < 95 % HR (*) (ví dụ: Aspergillus repens, A restrictus,
◣ Loài ưa ẩm vừa: bào tử nẩy mầm ở 80 – 90 % HR, sinh trưởng tốt nhất ở 95 – 100 % HR (ví dụ: Alternaria tenuissima, Cladosporium cladosporioides, Penicillium cyclopium)
◣ Loài ưa ẩm cao: bào tử nẩy mầm ở > 90 % HR, sinh trưởng tốt nhất ở
100 % HR (vớ duù: Epicoccum nigrum, Mucor circinelloides, Trichothecium roseum)
(*) HR: humidité relative – độ ẩm tương đối
Nhiệt độ có vai trò chủ yếu trong sự sinh trưởng của sợi nấm Hầu hết nấm mốc phát triển trong khoảng 15 – 30ºC và sinh trưởng tốt nhất trong khoảng 25 –
30ºC Tuy nhiên, một số loài lại sinh trưởng ngoài khoảng nhiệt độ trên, ví dụ:
Cladosporium herbarum mọc chậm và rõ rệt ở -6ºC trên thịt ướp lạnh; Aspergillus flavus ở 35ºC; Aspergillus fumigatus chịu được ở 50ºC; Humicola lanuginosa ở
Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến việc sinh bào tử nấm mốc Ví dụ: Aspergillus thuộc nhóm glaucus, nhiệt độ tối ưu cho việc sản sinh bào tử biến đổi tuỳ theo loại bào tử được hình thành: dạng thể quả đòi hỏi nhiệt độ rất chặt chẽ, tương ứng với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu (từ 18 – 27ºC), còn dạng bào tử đính thì phát triển tốt ngay cả ở nhiệt độ thấp (10ºC) hoặc nhiệt độ cao (33ºC)
Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến hình thái của cơ quan sinh bào tử Ví dụ:
Aspergillus giganteus (một loài thuộc nhóm clavatus), ở 20ºC loài này sinh cuống bào tử đính cao đến 10 cm nhưng ở 30ºC thì cao không quá 1 cm
2.2.2.2 Độ ẩm: Độ ẩm ảnh hưởng lớn trên nấm mốc Thể hiện ở sự sinh trưởng của hệ sợi nấm, sự sinh sản bào tử, và sự nẩy mầm của bào tử Vai trò của độ ẩm trong sự phát triển của nấm mốc đặc biệt rõ rệt ở những nấm phá hoại ngũ cốc tồn kho Dưới đây là độ ẩm tương đối một số loài nấm mốc
Bảng 2.2: Độ ẩm tương đối tối thiểu cần cho sự nẩy mầm bào tử, sự sinh trưởng và sự sinh sản bào tử của một số nấm mốc
Loài nấm Độ ẩm tương đối %
Nẩy mầm Sinh trưởng Sinh bào tử
96 2.2.2.3 Yếu tố dinh dưỡng và các yếu tố khác:
2.2.2.3.1 Cơ chất: yêu cầu về dinh dưỡng khác nhau với mỗi loài, trên một cơ chất nhất định chỉ gặp những loài phát triển phù hợp với cơ chất đó
2.2.2.3.2 pH: khoảng từ 4 đến 8 là phạm vi mà đa số các loài nấm mốc phát triển Một số chịu được cơ chất có pH acid hơn, hoặc kiềm hơn
2.2.2.3.3 Lượng Oxy: lượng Oxy dành cho nấm hô hấp là một nhân tố quan trọng cho sự phát triển, phần lớn nấm mốc đều ưa khí, có loại ưa khí nhiều, có loại ưa vừa
2.2.3 Đặc điểm sinh học vài loài nấm đáng chú ý:
Gioáng : Aspergillus Loài : Aspergillus flavus Link (= Monilia flava Pers.)
Aspergillus là một nhóm lớn có hơn 100 loài được xếp thành 18 nhóm loài theo khoá phân loại thông dụng của Raper và Fennell (1965)
Loài Aspergillus flavus có khuẩn lạc màu vàng hơi lục, ít nhiều vón cục, đường kính 3 – 5 cm (sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek) Cuống sinh bào tử (conidiophores) trong suốt, bề mặt thô, xù xì, chiều dài dưới 1 mm Thể bọng (vesicles) hình cầu hay gần cầu, đường kính 10 – 65 um Thể bình (sterigmata) thường có hai tầng hoặc một tầng hoặc đôi khi cả hai kiểu cùng có mặt trên cùng một bọng Các đính bào tử (conidia) có kích thước khá lớn (đường kính 5 – 7 um), hình cầu, màu vàng nâu đến hơi lục, vách trơn láng hoặc hơi nhám Hạch nấm (sclerotia) thường có màu nâu đỏ cho đến đen
▪ Hiếu khí; pH: 3,9 – 9,1 (tối ưu: 5,5); giải nhiệt độ phát triển: 6 –
54ºC (tối ưu: 30 – 35ºC ); ẩm độ HR: 80 – 98 % (tối ưu: 90 – 98 %) Phát triển tốt khi môi trường có saccarose (30 – 200 g/l) và nitrat (3 – 6 g/l)
▪ Nồng độ O2: gia tăng sự sinh trưởng
▪ Nồng độ CO2: ức chế sự sinh trưởng
▪ Môi trường phân lập: PDA (Potato Dextroza Agar)
▪ Môi trường định danh: Czapek
Aspergillus flavus phân bố ở khắp nơi (trong đất và trên nông sản), đặc biệt thích hợp trên hạt và hạt có dầu Đậu phộng, bắp, hạt bông vải là các nông sản thường bị A flavus tấn công Một số loài ít bị nhiễm: lúa mì, gạo, cùi dừa, cám, hạt kê Đặc biệt phát triển nhiều trên đậu tương (Moss, 1991)
Nhiệt độ 30 – 35ºC thích hợp cho đa số Aspergillus nên chúng thường chiếm vai trò chủ yếu trên nông sản của các nước nhiệt đới (Kozakiewicz, 1994)
▪ Giải nhiệt độ phát triển: 8 – 37ºC, (tối ưu: 24 – 31ºC )
▪ Độ ẩm môi trường (HR): 77 – 99 % (tối ưu: 95 – 99 %)
▪ Nồng độ O2: gia tăng sự sinh trưởng
▪ Nồng độ CO2: ức chế sự sinh trưởng
▪ Ưa nhiệt độ cao: 18 – 55ºC, (tối ưu: 40 – 42ºC)
2.2.4 Hậu quả của việc nhiễm nấm mốc làm hư hỏng thực phẩm: [6.1.6]
Theo tổ chức Nông nghiệp và Lương thực thực phẩm của Liên hiệp quốc (F.A.O), hằng năm, 25% tổng sản lượng lương thực trên thế giới bị hư hao trong đó phân nửa là do nhiễm mốc
Nấm mốc gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi Cây trồng, gia súc và gia cầm có thể là kí chủ cho nhiều loài nấm Các bào tử của nấm phát tán chủ yếu do gió và hơi nước trong không khí tiếp xúc với hạt ngoài đồng, trên đường vận chuyển hay trong các kho chứa Sự lây nhiễm và điều kiện thuận lợi để nấm phát triển mạnh là độ ẩm, nhiệt độ, oxy và các yếu tố khác như côn trùng, chuột, người và độ mẫn cảm của các loại hạt
Nấm mốc phát triển mạnh mẽ trên thức ăn đôi khi làm xấu mã, ví dụ nấm
Cladosporium làm đen lại, các chế phẩm bột sống có màu xanh lam do Monilia albo-violacea hoặc màu da cam do bụi bào tử Neurospora sitophila Mùi của thực phẩm hư hỏng thường khi đã đủ làm cho chúng trở thành không thể ăn được nữa
2.2.4.2 Biến đổi giá trị dinh dưỡng:
Gạo bị nhiễm Fusarium chlamydosporium bị biến đổi chất lượng và số lượng axit amin do nấm đã sử dụng Cỏ khô bị mốc thường ít vitamin A hơn cỏ khô không bị mốc, mộ số chất do nấm mốc sản ra có thể có tính chống vitamin
Sự phân huỷ chất béo ở nhiều loại hạt và ở lạc hoặc cùi dừa có thể do những loại nấm phân huỷ chất béo, đặc biệt là các Aspergillus flavus, A fumigatus , A awamori, A niger, Syncephalastrum racemosum và ở mức độ thấp hơn, A nidulans,
A tamarii, A sulfureus, A chevalieri, Penillium steckii, Paecilomyces varioti Chính những loài mốc đó làm cho dầu có mùi hôi, chủ yếu do các phản ứng thủy phân; chúng làm hư hỏng mỡ đã xử lý hoặc nhủ tương hóa (ví dụ chất béo trong dầu mỡ thực vật) do oxi hóa hoặc tách nhóm cacboxyl, gây ra mùi hôi xeton
2.2.4.3 Biến đổi tính chất hương vị nhận cảm:
Các loài Aspergillus làm cho cà phê bị chát đắng rất khó chịu
Các loài Aspergillus glaucus, A tamarii và Penicillium citrinum làm cho dầu lạc bị hôi.
Độc Tố Nấm Mốc Và Bệnh Độc Tố Nấm
2.3.1 Độc tố nấm mốc (mycotoxin):
Theo Claude Moreau, (1974), độc tố nấm là những độc tố do nấm sản ra ở trong hạt nguyên liệu hay trong thức ăn chăn nuôi khi độ ẩm trong hạt vượt quá 14 – 15 %, nhiệt độ trên 80 ºF tương đương 27ºC và độ ẩm không khí cao trên 62 % trong cả ngày và đêm
Về mặt hoá học, mycotoxin là những chất có nguồn gốc sinh vật, có trọng lượng phân tử lớn, cấu tạo chủ yếu gồm các protein, có khả năng gây độc và kháng nguyên Theo Turner và Aldridge (1983), mycotoxin là những chất chuyển hoá thứ cấp Sự chuyển hoá thứ cấp bao gồm những con đường sinh hoá học mà sản phẩm cuối cùng không có vai trò rõ rệt đối với sinh học của sinh vật Trái với sự chuyển hoá sơ cấp, xảy ra tương tự ở toàn thể các cơ thể sống nói chung, sự chuyển hoá thứ cấp phụ thuộc loài nấm về mặt định tính và phụ thuộc chủng nấm về mặt định lượng So với các sinh vật khác sự chuyển hoá này rất phát triển ở nấm mốc và đưa tới một tập hợp rộng lớn các phân tử, trong đó có một số độc với những sinh vật khác như vi khuẩn (chất kháng sinh) và động vật ( độc tố nấm)
Thuật ngữ “loài nấm sinh độc tố” nói chung có nghĩa là một loài nấm mà trong loài đó có 1 số chủng có thể sản sinh, ít nhất trong những điều kiện nào đó, một hoặc nhiều chất chuyển hoá độc đối với động vật (Le Bars, 1987)
2.3.2 Độc tố được sinh ra từ một số loài nấm mốc: [6.1.6; 6.3]
Theo Claude Moreau, thông thường, cùng một một độc tố có thể được tổng hợp bởi nhiều loài, có khi thuộc những giống (genus) khác nhau: aflatoxin do A flavus, A parasiticus, A tamarii, A niger, A ostianus, A ruber, A wentii, A versicolor, Penicillium citrinum, P variabile, P frequentans, P puberalum; axit xiclopiazonic do A flavus, P cyclopium và P camemberti; patulin do Byssochlamys nivea và nhiều loài Aspergillus, Penicillium khác Hơn nữa, cùng một chủng nấm có thể đồng thời sản ra nhiều độc tố: ochratoxin, xitrinin do P viridicatum; ochratoxin, axit penixillic do A ochraceus; các aflatoxin, axit xiclopiazonic do A flavus; aflatoxin, axitpenixilic, axit puberulic do P puberulum
Hậu quả trực tiếp của nhiễm mycotoxin đối với con người và gia súc gồm những vấn đề sau:
◣ Làm giảm sự tăng trưởng, suy giảm hệ thống miễn dịch và giảm sức đề kháng đối với bệnh truyền nhiễm
◣ Nhiễm độc hàm lượng mycotoxin cao có thể bị ngộ độc cấp tính và gây nên cái chết
◣ Làm giảm sản lượng sữa
Khi bị nhiễm mycotoxin với một lượng nhỏ trong thời gian dài thì chúng gây nên bệnh mãn tính, trong đó có cả sự hình thành các khối u (CAST, 1989)
Bảng 2.3: Các độc tố nấm chính và các thực phẩm trung gian (Le Bars, 1982) Độc tố nấm Tên nấm mốc Tên thực phẩm Điều kiện thuận lợi Các aflatoxin * A flavus
A parasiticus Lạc, bông, ngũ cốc, hạt có dầu, quả khô
- Haáp hôi trong kho Zearalenon * Fusarium spp Ngô, kê - Khí hậu ôn đới
Fusarium spp Ngô, ngũ cốc - Khí hậu ôn đới đến lạnh, trước và sau thu hoạch
- Trước khi nhập kho Các fumonizin F moniliforme Ngô - Khí hậu ôn đới đến nóng, trước và sau thu hoạch, trước khi nhập kho
A ochraceus Penicillium spp Đại mạch, yến mạch, lúa mạch đen, cà phê …
- Khí hậu lạnh và ẩm
- Khieỏm khuyeỏt veà kợ khí, bieán chaát thaáy baèng mắt thường
Ecgovalin ** Neotyphodium coenophialum Cỏ đuôi trâu - Hạt giống bị nhiễm, bãi chăn thả cũ
Lolitreme ** N lolii Cỏ lùng - Hạt giống bị nhiễm Các alkaloit của cỏ cựa gà
Claviceps purpurea, paspali Cây học lúa
- Mùa xuân mát mẻ, bãi chăn thả quảng canh
* : Đôi khi bắt đầu nhiễm ở ngoài đồng ruộng
** : Lây nhiễm ở ngoài đồng ruộng
2.3.2.1 Aflatoxin: là sản phẩm của quá trình trao đổi thứ cấp của loài Aspergillus flavus, loài này là nấm mốc sống ký sinh, phát triển mạnh ớ vùng nhiệât đới Bốn loại aflatoxin được thừa nhận là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 (Phân biệt ký tự B, G trên cơ sở B1, B2 phát màu huỳnh quang xanh tím (Blue) và G1, G2 có màu lục (Green) khi chiếu tia cực tím lên bản tách sắc ký lớp mỏng trong suốt)
Milk) trong sữa của động vật vắt sữa khi chúng ăn phải thức ăn bị hỏng có chứa AFB1 (Smith, 1997) Độc tố aflatoxin rất bền với nhiệt, khi đem lạc mốc rang lên, mặc dù nhiệt độ rất cao, các bào tử của mốc bị tiêu diệt, nhưng độc tố của chúng vẫn không bị hoá hủy hoàn toàn Người ta đã nghiên cứu thấy rang lạc ở 150ºC trong 30 phút thì tỷ suất aflatoxin B1 giảm trung bình 80 % và aflatoxin B2 giảm 60 %, như vậy, lạc mốc dù được rang ở nhiệt độ cao ăn vẫn nguy hiểm Độc tố aflatoxin rất độc hại, chỉ cần 100 ppb (hàm lượng tính bằng phần nghìn tỉ mg trong 1 kg thức ăn chăn nuôi hỗn hợp) là gây tử vong cho vật nuôi Một lượng nhỏ 20 ppb có thể gây ung thư gan Aflatoxin kìm hãm chức năng của hệ thống miễn dịch, làm gia súc mẫm cảm với các bệnh do vi khuẩn, virus hay bệnh truyền nhiễm Những ảnh hưởng này rất âm thầm nên khó nhận biết
Lần đầu tiên, chúng ta phát hiện ra loài nấm mốc có độc tố aflatoxin gây hại trên diện rộng cho đàn vịt anh đào do TP HCM nhập về vào năm 1983, đã có trên 2.000 con bị chết do ăn bánh dầu đậu phộng có chứa nấm mốc sinh ra độc tố trên Năm 1990, tại Cty Gia cầm Thành phố, đàn gà đẻ nhập từ Pháp cũng ăn phải bánh dầu đậu phộng có chứa độc tố aflatoxin từ đó gây chết phôi gà
Nhiều nước đã qui định giới hạn aflatoxin nhiễm trong lương thực thực phẩm ở mức 2 – 20 mcg/kg Tổ chức tiêu chuẩn hoá thực phẩm thế giới (Codex) quy định là 10 mcg/kg Tại nước ta, Quyết định 867/QĐ-BYT/ngày 4/4/1998 của Bộ Y tế quy định như sau:
Bảng 2.4: Giới hạn độc tố vi nấm (mycotoxin) trong thực phẩm Độc tố nấm mốc Sản phẩm Giới hạn nhiễm tối đa cho pheùp mcg/kg (ppb)
Aflatoxin tổng số hoặc B1 Thức ăn 10
Aflatoxin tổng số hoặc B1 Thức ăn gia súc 10 – 20
Các loại độc tố khác Thức ăn 35
2.3.2.2 Ochratoxin: được sinh ra bởi các chủng Aspergillus ochraceus, Penicillium viridicatum và P verrucosum Ochratoxin A gây tổn thương gan và thận Độc tố này chủ yếu gây độc mãn tính hơn là cấp tính, nó biểu hiện rõ hơn cả vào thời tiết khí hậu ẩm ướt và lạnh ở vùng trồng ngũ cốc (Blaney và William, 1991)
Hàm lượng đáng kể độc tố này thường được thấy ở nhiệt độ thấp là 4ºC (Osweiler, 1992)
Lúa mạch độ ẩm cao (thu hoạch năm 1987) là nguyên nhân gây ra sự nhiễm độc tố Ochratoxin A với nồng độ cao trên 2 mg/ml máu trong 35 % mẫu lấy trong đợt khảo sát lợn giết thịt của 535 đàn lợn tại Thụy Điển (theo Holmberg và cộng sự, 1990) Ơû các đợt nhiễm độc tố chúng đều có sự khác nhau mang tính chất vụ mùa, ví dụ: đã tìm thấy sự có mặt của độc tố chiếm 1,4 đến 28,4 % mẫu ngũ cốc được lấy và kiểm tra tại Anh trong những năm khác nhau (Lacey, 1990)
Theo Osweiler năm 1992 thì liều gây chết gia súc trong vòng 5 đến 6 ngày là 1 mg/kg thể trọng Cũng như theo Harvey và cộng sự năm 1994 thì lợn choai ăn khẩu phần có chứa 2,5 ppm độc tố thì độ tăng trọng giảm Nếu khẩu phần ăn bị nhiễm mức độ thấp 0,2 ppm và ăn trong vài tuần thì có thể gây tổn thương thận
2.3.2.3 Độc tố từ Fusarium: độc tố thuộc loài này là loại nấm trên cánh đồng Chúng đều là tác nhân gây bệnh đối với hạt ngũ cốc ở các nước có nhiệt độ trung bình cao, gây nên các bệnh như: bệnh tàn lụi ngọn của lúa mì và lúa mạch, làm mục bông ngô Loài của Fusarium và độc tố mà chúng sinh ra được chia ra trong bảng sau:
Bảng 2.5: Các loài Fusarium và độc tố do chúng sinh ra
Bảng này gồm có độc tố: tricothecene, zearalenon, monilifomi, fumonisin Tricothexen được chia nhỏ thành 2 nhóm:
◣ Nhóm A gồm: T- 2toxin, HT - 2toxin, neosolaniol và
◣ Nhóm B gồm: vomitoxin (Deoxynivalenol/DON) và nivalenol
2.3.2.4 Zearalenon: Trong tất cả các mycotoxin sinh ra trong thức ăn, zearalenon ảnh hưởng nghiêm trọng nhất tới sinh sản của lợn nái Theo Vanyi và cộng sự năm 1994, đối với lợn nái mang thai thì zearalenon làm tăng khả năng sẩy thai và tăng tỉ lệ lợn con chết sau khi sinh Những con lợn con sinh ra mà sống sót thì có sức sống yếu, hai chân soạng rộng hoặc là âm hộ bị sưng lên Goihl năm
1990 đã khuyến cáo rằng nếu khẩu phần ăn của gia súc chứa 5 ppm zearalenon thì nó dường như không gây ảnh hưởng tới sinh sản của lợn nái, nhưng nếu khẩu phần ăn của lợn nái chứa 10 ppm thì nó sẽ làm tăng thời gian từ cai sữa đến động dục của lợn nái, giảm số lứa đẻ và nó làm tăng sự nhiễm bệnh không mang thai của lợn nái
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật Liệu Nghiên Cứu
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu, thời điểm và địa điểm lấy mẫu:
◣ Đối tượng nghiên cứu gồm hai loại: nguyên liệu và thức ăn hỗn hợp
◣ Thời gian lấy mẫu trong tháng 7/ 2004 (Mùa mưa)
◣ Nấm mốc khảo sát được lấy từ 6 mẫu nguyên liệu và 6 mẫu thức ăn hỗn hợp có các thương hiệu và địa điểm tóm tắt trong bảng sau:
Ký hiệu Loại mẫu và tên thương hiệu Địa điểm lấy mẫu
TNCG Nguyên liệu (NL) cám gạo tư nhaân
Chợ Gạo, huyện Chợ Gạo
MTCG NL cám gạo hiệu Master Xã Mỹ Yên, huyện Bến Lức
MTBBD NL bột bánh dầu hiệu Master như trên
TNBBD NL bột bánh dầu tư nhân Nhà máy ép dầu dừa Vĩnh Xương
TNB NL bắp tư nhân Chợ Gạo, huyện Chợ Gạo
MTĐN NL đậu nành hiệu Master Chợ Gạo, huyện Chợ Gạo
BMH Thức ăn hỗn hợp (TAHH) cho heo hieọu Bỡnh Minh
Hợp tác xã chế biến Thức ăn Bình Minh Quốc lộ 51, xã Tân Mỹ Chánh, Tp Mỹ Tho, Tiền Giang BMG TAHH cho gà hiệu Bình Minh như trên
HGH TAHH cho heo hiệu Hi-gro Thị trấn Chợ Gạo
HGG TAHH cho gà hiệu Hi-gro như trên
MTH TAHH cho heo hiệu Master Xã Hoà Định, huyện Chợ Gạo MTG TAHH cho gà hiệu Master như trên
3.1.2 Vật liệu, hoá chất và dụng cụ dùng trong phân lập và định danh:
3.1.2.1 Các môi trường chính dùng trong quá trình phân lập, làm thuần, giữ giống và định danh nấm mốc bao gồm:
3.1.2.1.1 Môi trường Czapek: là môi trường tổng hợp (đa phần là các chất hóa học mà thành phần của chúng được xác định và định lượng một cách chính xác) dùng để giữ giống và định danh nấm mốc thuộc giống Aspergillus và Penicillium
Saét sulfat (FeSO4.7H2O) 0,01 g Đường saccaroza 30,0 g
Chuẩn bị môi trường: cân khối lượng các hoá chất, đường và agar ➔ hoà tan hỗn hợp trong nước cất ➔ đun sôi và khuấy đều hỗn hợp cho tan hoàn toàn
Môi truờng sau khi được đổ vào các ống nghiệm, bình tam giác sẽ khử trùng ướt bằng nồi hấp ở 121 ºC, 1 atm trong 30 phút
3.1.2.1.2 Môi trường PDA (Potato Dextroza Agar): là môi trường thiên nhiên (thành phần môi trường là các sản phẩm tự nhiên, thành phần hoá học của loại môi trường này không xác định chính xác do tính chất không ổn định của sản phẩm tự nhiên) dùng để phân lập, giữ giống và định danh các loài nấm mốc thuộc giống Fusarium và các loài nấm mốc ngoài giống Aspergillus và Penicillium
Khoai taây 200,0 g Đường dextroza (hay d – glucose) 20,0 g
Chuẩn bị môi trường: khoai tây gọt vỏ ➔ cắt lát mỏng ➔ ngâm trong nước khoảng 1 giờ để loại bớt tinh bột, các chất mủ trong khoai làm đục môi trường ➔ đun khoai với 1 lít nước trong 30 phút ➔ lọc dung dịch qua phểu ➔ đun dịch lọc với agar và đường ➔ khuấy đều hỗn hợp cho tan hoàn toàn
Môi truờng sau khi được đổ vào các ống nghiệm, bình tam giác sẽ khử trùng ướt bằng nồi hấp ở 121 ºC, 1 atm trong 30 phút
3.1.2.1.3 Môi trường CCA (Coconut Cream Agar): là môi trường dùng để khảo sát định tính khả năng sinh độc tố của các loài nấm mốc thuộc nhóm
Chuẩn bị môi trường: cân 12g agar ➔ nấu aga với 400 ml nước cất cho tan
➔ đổ thạch vào becher chứa 400 ml nước cốt dừa sao cho đủ 800 ml
Môi truờng sau khi được đổ vào các bình tam giác sẽ khử trùng ướt bằng nồi hấp ở 121 ºC, 1 atm trong 20 phút
3.1.2.1.4 Thuốc nhuộm tiêu bản xem kính hiển vi:
Lactophenol xanh cotton: thuốc nhuộm nấm mốc để làm tiêu bản giọt ép
3.1.2.2 Dụng cụ và thiết bị trong quá trình thực hiện:
◣ Dụng cụ: que cấy (que trang, que cấy đầu nhọn, đầu tròn, kim mũi mác); pipet 1 ml; lam; lamen; bình tam giác 250 ml; ống nghiệm; đĩa petri; bông mỡ
◣ Các dụng cụ trước khi dùng phải được khử trùng khô bằng cách sấy ở nhiệt độ 160 ºC trong 2 giờ, hoặc 180 ºC trong 30 phút
◣ Thiết bị: kính hiển vi; tủ sấy; nồi hấp vô trùng ở áp suất cao (autoclave); tủ cấy vô trùng; cân phân tích; máy chụp hình.
Nội Dung Và Phương Pháp Nghiên Cứu
3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài: Đề tài được tiến hành thực hiện từ tháng 6/2004 đến tháng 11/2004 tại phòng Vi nấm thuộc phòng Sinh hoá, Công ty Giám Định và Khử Trùng Hàng Hoá Xuất Nhập Khẩu (FCC)
3.2.2 Phương pháp phân lập nấm mốc:
Các mẫu nguyên liệu và thức ăn hỗn hợp sau khi mua về được gói trong bao nhựa dày, bảo quản trong tủ đông để kìm hãm sự phát triển nấm mốc, vi sinh vật có hại trong thời gian chờ phân lập Khi bắt đầu quá trình phân lập, cân mỗi mẫu và gói trong giấy vô trùng như sau:
▪ Mẫu dạng bột: 5 g/gói (Cân 1 gói) và 0,5 g/gói (Cân 2 gói)
▪ Mẫu dạng viên: 5 g/gói (Cân 1 gói) và 1 g/gói (Cân 2 gói)
Dùng môi trường PDA có bổ sung thêm kháng sinh cloramphenicol nhằm ức chế sự phát triển của nấm men và vi khuẩn (Ký hiệu môi trường là PDA + C)
3.2.2.3 Phương pháp phân lập: Để phân lập nấm mốc ta thực hiện đồng thời hai phương pháp: Rải trực tiếp và Pha loãng
▪ Rải trực tiếp: Rải 0,5 g mẫu dạng bột (hay 1 g mẫu dạng viên) trực tiếp lên đĩa petri chứa môi trường PDA + C
▪ Pha loãng: Cho 5 g mẫu bột hay viên vào bình bình tam giác chứa 45 ml nước cất vô trùng ➔ lắc đều, khi đó mẫu được pha loãng 10 -1 lần, ta tiến hành song song:
➔ dùng pipet 1ml vô trùng hút 0,5 ml từ dịch pha loãng 10 -1 vào đĩa petri chứa môi trường PDA + C ➔ dùng que trang trang đều dịch khắp mặt thạch
➔ dùng pipet vô trùng hút 1 ml từ dịch pha loãng 10 -1 hoà vào ống nghiệm chứa
9 ml nước cất vô trùng ➔ lắc đều, khi đó mẫu được pha loãng 10 -2 lần ➔ dùng pipet 1ml vô trùng hút 0,5 ml dịch pha loãng 10 -2 vào đĩa petri chứa môi trường PDA + C ➔ dùng que trang trang đều dịch khắp mặt thạch ➔ gói các đĩa petri chứa mẫu phân lập trong túi nhựa và để ở nhiệt độ 25 ± 2ºC
- Các mẫu trước khi cân phải được trộn đều
- Mỗi nồng độ pha loãng đều làm trên 2 đĩa petri nhằm đạt được độ chính xác cao, (nghĩa là cứ 1 mẫu ta có 6 đĩa)
- Các thao tác phân lập đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng có đèn sáng, quạt hút và dưới ngọn lửa đèn cồn
- Trước và sau khi phân lập mẫu cần thiết phải đảm bảo vệ sinh xung quanh nôi caáy baèng coàn 96º
Sau 2 đến 3 ngày, quan sát các đĩa petri ghi nhận sự phát triển khác biệt ban đầu của nấm mốc bao gồm: hình dạng, màu sắc Sau đó tách riêng từng loại nấm mốc ra cấy trong ống nghiệm hoặc cấy ria nhiều lần trên các đĩa petri nếu chúng nằm sát nhau, đồng thời cũng lấy tiêu bản trực tiếp cho từng loại nấm mốc đã cấy
Sau khi chủng đã phân lập thuần sẽ được lấy tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi và so sánh với tiêu bản trực tiếp, sau khi xác định đúng với chủng đã thấy ban đầu trên, ta kết luận giống đã phân lập thuần trên đúng là giống nhiễm trên maãu phaân tích
Tiến hành cấy và giữ các giống thật thuần vào ống nghiệm chứa môi trường thích hợp (giống Aspergillus và Penicillium thì cấy vào môi trường Czapek, giống Fusarium và các loài nấm mốc khác thì cấy vào môi trường PDA) Các ống giống nấm mốc đã thuần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5ºC để hạn chế sự phát triển của chúng và để phân loại dần
Sơ Đồ Tóm Tắt Phương Pháp Phân Lập Và Định Danh Nấm Mốc:
Rải trực tiếp Pha loãng
Tách phân lập Tách phân lập ẹũnh danh Maãu
45 ml nước caát voâ truứng
9ml nước caát voâ truứng
Sơ Đồ Tóm Tắt Phương Pháp Phân Lập:
Phương pháp pha loãng Phương pháp rải trực tiếp ỦÕ ở nhiệt độ 25 ± 2ºC ỦÕ ở nhiệt độ 25 ± 2ºC Trải đều mẫu trên petri
5 g mẫu 0,5 g mẫu dạng bột (hay
3.2.3 Phương pháp định danh nấm mốc: Để định danh, ta tiến hành cấy các chủng nấm mốc đã làm thuần từ ống giống sang đĩa petri có chứa môi trường theo cách như sau:
▪ Giống Aspergillus và Penicillium thì cấy 3 chấm trên môi trường Czapek
▪ Giống Fusarium và các loài nấm mốc khác thì cấy 1 chấm trên môi trường PDA Điều kiện về nhiệt độ nuôi cấy giống là 25 ± 1ºC, ánh sáng sử dụng là ánh sáng thường trong phòng, không bật đèn ban đêm
Caỏy moói gioỏng qua 2 ủúa petri: Đĩa 1: dùng để quan sát đại thể: quan sát sự phát triển chung của khuẩn lạc nấm mốc trên hộp petri từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 10 Đối với những loài phát triển chậm và có cơ quan sinh sản hữu tính, thời gian theo dõi và quan sát kéo dài hơn, có thể đến một tháng Quan sát và ghi nhận những đặc điểm sau:
◣ Tốc độ phát triển (nhanh, trung bình, chậm) ➔ đo đường kính của vòng khuẩn lạc sau 3 đến 10 ngày cấy
◣ Màu sắc và sự thay đổi màu sắc của mặt phải và mặt trái khuẩn lạc
So màu theo bảng màu chuẩn trong cuốn “Color Standard And Color Nomenclature” cuûa Ridgway, 1912
◣ Dạng khuẩn lạc (dạng bột, bông, nhung, tơ …)
◣ Tạo sắc tố ra môi trường
◣ Tạo các giọt tiết trên bề mặt khuẩn lạc Đĩa 2: dùng để quan sát cấu trúc vi thể: sau 2 – 4 ngày theo dõi sự sinh trưởng của nấm mốc, nếu thấy khuẩn lạc có màu (có bào tử) và đường kính khuẩn lạc khoảng 0,5 – 1 cm thì ➔ dùng kim mũi mác vô trùng cắt một bên khuẩn lạc, miếng cắt hình chữ nhật có kích thước (2 – 3) x (1 – 1,5) cm (mục đích là ria dần các bào tử nấm mốc theo vết cắt, tạo sự dễ dàng cho việc quan sát và đo kích thước) ➔ bứng miếng cắt khỏi đĩa petri ➔ sau 2 – 3 ngày tiếp theo, quan sát sợi nấm mọc từ vết cắt:
◣ Quan sát sự sắp xếp và hình thái của cơ quan sinh sản (đầu, chổi …), đo kích thước và vẽ hình sợi nấm, cuống mang bào tử, dạng đầu ở vật kính 4X, 10X
◣ Quan sát dưới kính ở vị trí vết cắt xem cơ quan sinh sản mọc từ đâu (từ môi trường hay hệ sợi khí sinh)
➔ Đồng thời lấy một ít cơ quan sinh sản và sợi nấm từ miếng cắt để làm tiêu bản giọt ép trên lam với thuốc nhuộm màu lactophenol xanh cotton để quan sát cấu trúc vi thể của nấm mốc ở vật kính 40X, 100X Ghi nhận các đặc điểm và kích thước của sợi nấm, cơ quan sinh sản vô tính và hữu tính (nếu có) theo các yêu cầu có trong bảng mô tả các loài nấm mốc
➔ Đối với một số loài nấm mốc khó quan sát cấu trúc sinh sản trên vết cắt miếng thạch, thì tiến hành cấy trên lam dưới lamen Dùng miếng lam vô trùng đặt
➔ cắt một miếng môi trường thạch hình chữ nhật có kích thước 7 x 7 x 2 mm và đặt vào giữa miếng lam trên ➔ cấy giống nấm mốc vào 4 góc của miếng thạch ➔ đậy lamen vô trùng lên miếng thạch vừa cấy, để đĩa petri này ở nhiệt độ 25 ± 1ºC ➔ sau 5 – 7 ngày, quan sát trực tiếp sợi nấm và cơ quan sinh sản của nấm mốc mọc trên miếng thạch và dưới lamen bằng kính hiển vi ở vật kính 10X, 40X Ưu điểm của phương pháp này là có thể quan sát được cấu trúc sinh sản một cách nguyên vẹn của nấm mốc Ngoài ra, có thể lấy miếng lamen có gắn sợi nấm và cơ quan sinh sản ra khỏi đĩa petri và đặt trên lam có thuốc nhuộm để quan sát ở vật kính 40X, 100X
- Tất cả các kích thước đo đếm được đều lấy khoảng 10 số liệu cho mỗi loại hình thể mô tả, lấy số liệu trung bình
- Các thao tác cấy đinh danh đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng có đèn sáng, quạt hút và dưới ngọn lửa đèn cồn
- Trước và sau khi cấy cần thiết phải đảm bảo vệ sinh xung quanh nới caáy baèng coàn 96º
