Nghiên cứu khả năng sinh độc tố một số chủng nấm mốc sinh độc tố trong không khí môi trường lao động

Khoa Cồng Nghệ Sinh Học Triệu Thị Vân Anh DANH MỤC CHỮ VIÉT TẤT MTLĐ Môi trường lao động SA Sabourand Agar CAM Coconut Agar Medium PDA Potato Dextro Agar NCBI National Center for Biotechnology Information d Đường kính khuấn lạc ADM Aspergillus Differentiation Medium Base A fumigatus Aspergillus fumigatus A.flavus Aspergillus flavus A niger Aspergillus niger A aureus ifrWWTO học Mở Hà Nội A nidulans Aspergillus nidulans A versicoler Aspergillus versicolor A terreus Aspergillus terreus A keratitis Aspergillus keratitis KT Kích thước CFU Colony Forming Unit ACGIH American conference of Governmental industrial hygienists Khoa Cồng Nghệ Sinh Học Triệu Thị Vân Anh DANH MỤC CÁC BẢNG STT Báng Bàng Tên bàng Ket qua lay mẫu nam bang phương Trang 33 pháp chủ động Ket quà lấy mầu nấm phương Bàng 34 pháp thụ động Ngày quan sát 08/2/2017 cúa mẫu Bảng 37 VA-11 Ngày quan sát 10/2/2017 mẫu Bãng 38 VA-11 Bàng Ngày quan sát 14/2/2017 cúa mầu 39 VA-11 So sánh mẫu VA-11 môi trường Bàng TI sau 10 ngày nuôicấýl 40 học Mở Hà N 51 Bảng Ngày quan sát 7/2/2017 mẫu VA-16 41 Bảng Ngày quan sát 9/2/2017 cúa mẫu VA-16 42 Băng Ngày quan sát 10/2/2017 mẫu 43 VA-16 10 Bàng 10 Ngày quan sát 12/2/2017 cùa mẫu 44 VA-16 11 Bâng 11 So sánh mẫu VA-16 môi trường sau 10 ngày nuôi cấy 45 12 Bàng 12 Ket quan sát vi mầu VA-11 47 13 Bàng 13 Kết quan sát vi thề mầu VA-16 49 Khoa Cồng Nghệ Sinh Học Triệu Thị Vân Anh DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Hình Trang Sợi nấm cấu tạo vách tế bào nấm (theo Hình Samson vàctv, 1995) Một số hình dạng khuẩn lạc nấm (theo Samson Hình vàctv, 1995) Hình Các kiểu cuồng bào tử đính cúa Aspergillus 10 Hình Địa điểm lấy mẫu 32 Hình Cơ quan sinh sàn mầu VA-11 47 Cơ quan sinh sản cúa mẫu VA-16 kính Hình 48 40X Cơ quan sinh sàn cùa mẫu VA-16 kính 4X 48 Hình Hình Ket giãi trình tự gen VA-11 Th ỉ ì So sánh độ tươTig đồng cua đoạn gen mầu Hình VA-11 với Genbank 50 Ket quà giái trình tự gen VA-16 53 10 Hình 10 51 So sánh độ tương đồng đoạn gen mầu II Hình 11 54 VA-16 với Genbank Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Triệu Thị Vân Anh MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i DANH MỤC CÁC BÁNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv MỚ đầu’ 1.1 Tông quan nấm mốc 1.1.1 Đặc điềm hình thái cấu tạo 1.1.2 Đặc điêm sinh trường sinh sàn 1.1.3 Phân loại nấm mốc 11 1.1.4 VỊ trí, vai trị nấm mốc 13 1.2 Tống quan nấm mốc có khả sinh độc tố giới 14 1.2.1 Tinh hình nghiên cứu nấm mốc sinh độc tố 14 1.2.2 Phương pháp xác định nấm mốc sinh độc tố 16 1.3 Tinh hình nghiên cứu Việt Nam nấm mốc sinh độc tố có khơng khí mơi trường lao động 21 1.3.1 Tinh hình nghiên cứu nấm mốc sinh độc tố có khơng khí mơi trường lao động 21 1.3.2 Phương pháp xác định nấm mốc sinh độc tố 23 2.1 Đối tượng, phương pháp lấy mẫu nấm mốc khơng khí 25 2.2 Xác định đặc điếm sinh hộc ịCÙa nấntị^pốơsinh đỘỊCtọ^.Ị 29 2.2.1 Phương pháp qúan sát hình thai ( đại thể, vi thể) 29 3.1 Ket lấy mẫu nấm mốc có sinh độc tố có mặt khơng khí mơi trường lao động 32 3.1.1 Mật độ nấm mốc sinh độc tố có khơng khí MTLĐ xác định phương pháp chù động 32 3.1.2 Mật độ nấm mốc sinh độc tố có khơng khí MTLĐ xác định phương pháp thụ động .34 3.2 Kết đặc điếm sinh học chùng nấm mốc sinh độc tố có khơng khí MTLĐ mơi trường khác 35 3.2.1 Kết quà quan sát đại thề 36 3.2.2 Kết quansát vi thể 46 3.3 Mức độ nguy hại nấm mốc sinh độc tố phân lập 56 PHẦN 4: KỂT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ ’ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THẤM KHẢO 60 V Triệu Thị Vân Anh Khoa Cồng nghệ sinh học MĨ ĐÀU Tính cấp thiết Nấm Aspergillus spp chúng nấm lớn nhất, tồn khắp nơi hay gặp vùng khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới Nó có khoảng 100 lồi có khống 20-30 lồi gây bệnh cho người, thường gặp chủng A fumigatus, A.flavus, A niger như: A aureus, A.flavus gây viêm da; A niger gây viêm tai, phôi, dị ứng, hen; A nidulans, A versicolerr, A terreuss gây viêm da chân, tay, viêm quanh móng; A keratitis gây viêm giác mạc; đặc biệt A fuinigatus A.flavus hay gây viêm phổi.110] Nấm Aspergillus spp tồn đất, khơng khí, thực phẩm ngơ, lúa hay thức ăn ôi thiu Ớ nước ta, thời tiết nóng ẩm, mơi trường sinh hoạt điều kiện vệ sinh chưa cao nên bệnh nấm dễ phát triên Nam phát triền môi trường không cần ánh sáng mặt trời, môi trường nghèo chất dinh dưỡng, cần có nhiệt độ độ ấm thích hợp Nấm tồn tự nhiên, khắp nơi giới hầu hết người tiếp xúc với nấm tình trạng nhiễm nấm trờ nên gây bệnh phụ thuộc vào mức độ chất truyền nhiễm sức đè kháng cùa thế.[ 17] Nhóm Aspergillus spp nhóm có nhiều chúng loại nấm sinh độc tố bào tử phát tán khơng khí gặp điều kiện thuận lợi chúng sinh trướng phát triền loại chất, sán phẩm khác nhau, chế biến lương thực nguy bị nhiễm độc lố cao bị bào tử nam mốc xâm nhiễm Phạm vi ký chủ rộng, khả phát tán lớn nên việc phòng trừ nấm hại thường khó khăn Đặc biệt khơng khí khó kiếm sốt, chưa có nhiều nghiên cứu việc tiếp xúc với nấm mốc độc tố khơng khí, đưa giải pháp kiểm sốt chúng Khoa Cồng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh Loại nấm có chùng lây truyền cho người qua đường hơ hấp, lơ lửng khơng khí phát tán theo gió Nếu bị nấm Aspergillus spp nhiễm vào phồi khó nhận biết khơng có triệu chứng rõ rệt Chỉ tế bào nấm xâm lấn vào phế quàn bệnh nhân có phản xạ ho Phương thức gây bệnh Aspergillus spp có thề gây bệnh da sau tiến triển gây bệnh hệ thống ngược lại [ 181 Ngồi nam cịn gây bệnh hệ thần kinh: Khi nhiễm nấm bệnh nhân không điều trị ngay, thông qua hốc mặt hay hốc sọ, nấm xâm nhập vào bên gây viêm não, viêm tiều não Có khoảng (X) loại vi nấm gây bệnh cho người, đó: 20 loại gây bệnh nội tạng làm chết người 35 loại gây bệnh nội tạng nhẹ, bệnh da mô da, mạch bạch huyết, 45 loại gây bệnh da màng nhày Các vi nấm gây bệnh bàng nhiều yeu tố: men (vi nấm da), học (chốc đau), độc to (aflatoxin A flavus tiết ra), viêm (Cryptococcus neoformans) miễn dịch Một số bệnh vi nấm gây thường gặp chia làm nhóm chính: Nhóm bệnh vi nấm ngoại biên gây ra, nhóm bệnh vi nấm ngồi da, nhóm bệnh vi nấm nội tạng Các loại độc tố sinh từ loại nấm mốc điển hình như: -Aflatoxin: Aflatoxin tìm thấy nhiều khô dầu phộng, khô dầu dừa, bắp, cám, A flavus A parasiticus sinh ra, độc tố gây tổn thương gan, thận, mật, làm giám khả tiết sữa, đẻ trứng sức đề kháng gia súc, gia cầm Theo Tố chức bệnh ung thư Quốc tế aflatoxin xếp vào danh sách tác nhân gây ung thư cho người Aflatoxin chủ yếu loài vi nấm A flavus A parasiticus tạo Ngồi Aspergillus spp chúng cịn nguyên nhân gây bệnh cho động vật thực vật có cá người vật ni Khoa Cồng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh -Ochatoxin A: A ochraceus sinh ra, nguyên liệu dễ nhiễm độc tố cám gạo, lúa mì, bột mì, bắp, đậu nành, cà phê Độc tố gây hại đến gan thận động vật Tương tự aflatoxin, độc tố gây nên giám sức đề kháng tác nhân gây ung thư người -Citrinin: Độc tố sinh p citricum có nhiều gạo đế mốc, độc tố gây hại cho thận, gây hoại tử nhiễm trùng làm tồn hại den chất lượng quầy thịt -Tricothecenes (T2-toxin): F tricinotum sinh thường nhiễm nhiều bắp, gạo bị mốc Ánh hưởng độc tố làm giảm tính thèm ăn gia súc, kèm theo triệu chứng nôn mửa làm giảm suất cùa động vật nuôi Heo loài gia súc nhạy cảm với tricothecenes -F2 -Toxin (zearlenon): F roseum sinh ra, theo quan sát thấy nhiều bắp, lúa mạch, lúa mì Heo lồi động vật dễ quan sát, bị nhiễm độc âm hộ bị sưng đỏ, đơi núm vú sưng đỏ, dẫn tới sa trực tràng âm đạo, tử cung nở rộng có tượng thối hóa buồng trứng Trong số độc chất aflatoxin A flavus A parasiticus sinh có mức nguy lớn Aflatoxin bao gồm loại khác (Bl, B2, Gl, G2, MI M3), độc tính cao aflatoxin Bl Sự nguy hiểm chồ có nàng gây hại chi với liều lượng nhỏ, kg thức ăn chi cần nhiễm mg đù làm hỏng gan Độc chất lại bền vững với nhiệt, đem đun sơi 100 °C nồi bình thường nhiệt độ cao nồi áp suất, hay nhiệt độ từ máy ép đùn viên thức ăn gia súc aflatoxin khơng bị phân hũy Ngồi khà tạo số loại độc chất có số bệnh nguy tìm thấy nguyên nhân loại nấm gây Các aflatoxin cấu tạo gồm bon hợp chất thuộc nhóm furanocouramin, sàn phẩm trao đối chất tạo A flavus A parasiticus Hiện có Khoa Cồng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh 16 loại độc tố afalatoxin tìm thấy chế sinh độc tố phát ký hiệu B|, B2, G|, G2, M|, Mị, P| Qi Các aflatoxin B| G| biết đến nhiều nhất, aflatoxin B| có chứa vịng lacton aflatoxin GI có chứa vòng lacton Qua nghiên cứu phát nhiều Aspergillus có gần 7CX) lồi có 19 lồi gây bệnh cho người Những loài phân lập phỗ biến bao gồm: A fumigatus, A flavus, A niger, A terreus Trong đó, 90 % trường hợp nhiễm Aspergillus A Fumigatus Xuất phát từ vấn đề trên, đồng thời tham gia nghiên cứu đề tài cấp “Nghiên cứu phân lập định danh phương pháp sinh học phân tử số nấm mốc gây hại khơng khí mơi trường lao động” cùa Trạm quan trắc phân tích mơi trường lao động - Viện Nghiên cứu Khoa học kỹ thuật Bào Hộ lao động, đồng ý hướng dẫn cùa ThS Vũ Duy Thanh, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả sinh độc tố số chủng nấm mốc phân lập khơng khí mơi trường lao dộng" Mục tiêu nghiên cứu Xác định khã sinh độc tố cùa số nam mốc phân lập khơng khí mơi trường lao động Nội dung nghiên cứu - Mật độ nấm mốc có sinh độc tố có khơng khí mơi trường lao động sở chế biến nông sàn - Xác định độc tố nấm mốc phân lập khơng khí sinh Triệu Thị Vân Anh Khoa Cồng nghệ sinh học PHẦN 1: TÓNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm mốc 1.1.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái kích thước Nấm mốc số nấm thể đơn bào có hình trứng, đa số có hình sợi, sợi có ngăn vách (đa bào) hay khơng có ngăn vách (đơn bào) Sợi nấm thường ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác tùy lồi Đường kính cùa sợi nấm thường từ 3-5 pm, có đến 10 pm, chí đến mm Chiều dài sợi nam tới vài chục cm Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trường Các sợi nấm phân nhánh nhánh lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (Hình 1) Trên mơi trường đặc trưng số chất tự nhiên, bào tử nấm tế bào nấm đoạn sợi nấm có thố phát triển thành hệ sợi nấm có hình dạng định gọi khuẩn lạc nấm.(Hình 2) Nam mốc có dạng: khuân ty (hay sợi nam) bào tử [13] * Khuẩn ty (Hypha) hay sợi nấm: - Khuấn ty có cấu tạo dạng sợi phân nhánh, sợi sinh trưởng đinh Khuẩn ty sinh từ bào tử, tùy loại mà khuẩn ty có hình lị xo, xoan ốc, vợt, sừng hươu, lược - Sợi nam có loại: + Sợi nấm có vách ngăn: loại có phần lớn loại nấm mốc Sợi nấm chuỗi tế bào tạo nên Sợi nấm lớn lên tế bào không ngừng phân cắt, nên thề chúng có cấu tạo đa bào đơn nhân Ví dụ: Aspergillus, Penicillinum Khoa Cồng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh + Sợi nấm khơng có vách ngăn: loại có số lồi nấm mốc bậc thấp Toàn hệ sợi nấm coi tế bào phân nhánh gọi thể đa nhân Trong trình phát triển sợi nấm chi có nhân phân chia Te bào chất tăng lên khơng có màng ngăn nên thể chúng gọi thề đơn bào đa nhân Ví dụ,- Murco, Rhizupus - Khi nuôi cấy môi trường đặc, vào vị trí chức khuẩn ty chia làm loại khuần ty: + Khuẩn ty chất: khuẩn ty phát triền sâu vào mơi trường lấy thức ăn + Khuấn ty khí sinh: khuẩn ty phát triển bề mặt môi trường + Khuẩn ty sinh sàn: khuấn ty phát triến từ khuẩn ty khí sinh, đầu khuẩn ty phát triển đặc biệt chứa bào tứ *Bào tử: Bào tử quan sinh sàn yểu nấm mốc Khi nấm mốc trướng thành khuân ty sinh sản sinh bào tử Bào tử hình thành bang hình thức sinh sán vơ tính hay hữu tính Triệu Thị Vân Anh Khoa Cồng nghệ sinh học Hình 5: Co’ qua sinh sản mẫu VA-11 Bảng 12: Kết quan sát vi thể mẫu VA-11 Thông số đánh giá Cơ quan sinh sản Đầu Đặc điểm tầng cân đối, dày đặc, tầng Cuống Kích thước (pm) 52,13-160,65 X 10.71-107,1 Mọc từ mơi trường từ áẰíP học M fl|ậ(^-gỊ4,2 X 2,75-3,3 Thể bình Hình chai 9,9-13,2 X 1,65-2,2 Bào tử Elip 3,3-4.4 X 2,2-3,3 Từ bàng 14 cho thấy VA-11 có đặc điềm gần trùng hợp với mơ tả cùa nhà nghiên cứu trước Nguyễn Lân Dũng Đặng Vũ Hồng Miên, kết định danh sơ mẫu VA-11 Penicillium purpurogenum 47 Khoa Cồng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh *Đối với mầu A16: Do kích thước khuẩn lạc lớn dần đến có khả kích thước bào tử lớn, dễ quan sát vi soi trực tiếp kính hiến vi quang học Qua nghiên cứu, lựa chọn phương pháp cắt miếng thạch đật lamen lên miếng thạch vừa cấy đề quan sát vật kính 4x 40x Hình 6: CO' quan sinh sản mẫu VA-16 vật kính 40X Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội Hình 7: mẫu VA-16 vật kính 4X 48 Triệu Thị Vân Anh Khoa Cồng nghệ sinh học Báng 13: Kết quan sát vi thể mẫu VA-16 Thông sô đánh giá Cơ quan sinh sàn Đặc điểm Kích thước (pm) Hình cầu,tỏa tia xé Đầu 75-275 rách Cuống Khơng màu, xù xì 150-1125 x15-19 Bọng Dạng gần cầu đến chùy 21-45 X 27 -64 lớp hình tam giác ngược 8-15 X 4.5-5 Thể bình Lớp hình chai Thư \ Bào tử ÉtthA'dẩd ’hễầ^bWỉ,lèo^ảì mịn (xù xì) 7-11 X 4-5 Nội 4-5 Kết quà quan sát vi thể mầu Aspergillus VA-16 cho thấy đầu mọc từ chất, hình cầu, hình tịa tia, hình xé rách kích thước 75-275 |im, cuống khơng màu xù xì có kích thước 150-1125 X15-19 pm, bọng hình gần cầu đến chùy có kích thước 21-45 X 27 -64 pm, có loại bình lớp lớp 2, bào tử hình cầu có gai rõ có KT 4-5 pm Cho thấy có đặc điểm gần trùng hợp với mô tà cùa nhà nghiên cứu trước Nguyễn Lân Dũng Đặng Vũ Hồng Miên, kết quà định danh sơ mau Aspergillus VA-16 có thê Aspergillus flavus 49 Khoa Cồng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh 3.2.3 Kết sinh học phân tử Định danh phương pháp quan sát đại thề quan sát vi thể băn định danh chủng nấm Penicillium purpurogenum chùng nấm Aspergillus flavus có mật khơng khí MTLĐ sở che biến thức ăn gia súc Đố khẳng định xác chúng nấm mốc Penicillium purpurogenum chung nấm mốc Aspergillus flavus dùng phương pháp sinh học phân tứ có đọ xác cao Trong nghiên cứu thực giải trình tự gen cùa hai chủng nấm mốc VA-11 VA-16 phân lập khơng khí MTLĐ sở chế biến thức ăn gia súc Proconco Hài Phòng Ket quà giãi trình tự gen trình bày 3.2.3.1 Kết sinh học phân tử mẫu VA-11 Két giải trinh tự gen CCAGACGGGATTCTCACCCTCTATGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGACGGGGA CCGCACCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAACTCGGACCCCAAAGGGGCCAGATTT CAAATTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCGGTTGGTTTC TTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAACTCCTACCTGATCCGAG GTCAACCTTGTAAAAAGATGTGGTGGTGACCAACCCCCGCAGGTCCTTCCCGAGCG AGTGACAGAGCCCCATACGCTCGAGGACCAGACGGACGTCGCCGCTGCCTTTCGG GCAGGTCCCCAGGGGGACCACACCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAAT GACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAA GATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTC TTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTGACAATTTTCATATCA CTCAGACAGCCCATCTTCATCAGGGTTCACAGAGCGCCTCGGCGGGCGCGGGCCC GGGGACGGATGTCCCCCGGCGACCGGGTGGCCCCGGTGGGCCCGCCGAAGCAAC AGGTGTTGGAGACAAGGGTGGGAGGTTGGGCCGCGAGGGGCCCTCACTCGGTAAT GATCCTTCCGCAGGTTCA Hình 8: kết giải trình tự gen mẫu VA-11 50 Triệu Thị Vân Anh Khoa Cồng nghệ sinh học Penicillium purpureogenum genomic DNA sequence contains ITS1,5.8S rRNA gene, ITS2, 28S rRNA gene, strain DI16-125 Sequence ID: LT558947.1 Length: 1087Numberof Matches: Related Information Range 1: 33 to 776GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score 1375 bits(744) Query Expect Identities Gaps strand 0.0 744/744(100%) 0/744(0%) Plus/Minus CCAGACGGGATTCTCACCCTCTATGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGACGGGGACCGCA 60 I III I III I I III I I II I I III I III I Illi I III I Illi I III I III I I III I III I I I sbjct 776 CCAGACGGGATTCTCACCCTCTATGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGACGGGGACCGCA 717 Query 61 CCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAACTCGGACCCCAAAGGGGCCAGATTTCAAATTTGA 120 I III I I II I I I II I I II I I II I I II I I I II I I III I I II I I III I I II I I III I I II I I I Sbjct 716 CCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAACTCGGACCCCAAAGGGGCCAGATTTCAAATTTGA 657 Query 121 GCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCT 180 1111 lrhiir VIpri1 ViAn Wat ‘fine1 k'/inr Wa ’iklni1 11111111111 Sb jet 56 GCTCTTGíỉỒtc YOtỉÍGỈểâÌTKCạáAGÌỡỉaĩCCroGrrcGTTÍyrTTTCCTCCGCT 597 Query 181 TAĨTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAACTCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTGTAAAA 240 I III I III I I III I III I I II I I III I Illi I III I Illi I III I III I I III I III I I I Sbjct 596 TATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAACTCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTGTAAAA 537 Query 241 AGATGTGGTGGTGACCAACCCCCGCAGGTCCTTCCCGAGCGAGTGACAGAGCCCCATACG 300 I III I III I I III I III I I II I I III I Illi I III I Illi I III I III I I III I III I I I Sbjet 536 AGATGTGGTGGTGACCAACCCCCGCAGGTCCTTCCCGAGCGAGTGACAGAGCCCCATACG 477 Query 301 CTCGAGGACCAGACGGACGTCGCCGCTGCCTTTCGGGCAGGTCCCCAGGGGGACCACACC 360 I III I I II I I I II I I II I I II I I III I I II I I III I I II I I III I I II I I I II I I II I I I Sbjct 476 CTCGAGGACCAGACGGACGTCGCCGCTGCCTTTCGGGCAGGTCCCCAGGGGGACCACACC 417 Query 361 CAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAAT 420 I III I I II I I I II I I II I I II I I II I I I II I I III I I II I I III I I II I I III I I II I I I Sbjct 416 CAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAAT 357 Query 421 GCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACAT 480 I III I I II I I I II I I II I I II I I II I I I II I I II I I I II I I III I I II I I III I I II I I I 51 Triệu Thị Vân Anh Khoa Cồng nghệ sinh học Sbjct 356 GCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACAT 297 Query 481 TACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAA 540 I III I III II III I III II II II III I Illi I III HUI HIU III II III I III II I Sbjct 296 TACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAA 237 Query 541 AGTTTTGACAATTTTCATATCACTCAGACÃGCCCATCTTCATCAGGGTTCACAGAGCGCC 600 Hill HI I I Illi Illi I II Hill Hill I Illi Hill Illi Illi Illi Hill II sbjct 236 AGTTTTGACAATTTTCATATCACTCAGACAGCCCATCTTCATCAGGGTTCACAGAGCGCC 177 Query 601 TCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGACGGATGTCCCCCGGCGACCGGGTGGCCCCGGTGGGCCC 660 I I I I II I I II I I II I I II II I II I I I II I I I II I I II I I I II I II II II I I I I II I II II Sbjct 176 TCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGACGGATGTCCCCCGGCGACCGGGTGGCCCCGGTGGGCCC 117 Query 661 GCCGAAGCAACAGGTGTTGGAGACAAGGGTGGGAGGTTGGGCCGCGAGGGGCCCTCACTC 720 Illi HUH Illi HI I HI II III I Hill Illi Hill III Hill Hill Illi II Sbjct 116 GCCGAAGCAACAGGTGTTGGAGACAAGGGTGGGAGGTTGGGCCGCGAGGGGCCCTCACTC Query 721 GGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCA sbjct 56 GGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCA 57 744 ! 1'TlW w ww hoc Mo Hà Nội 33 Hình 9: So sánh độ tưoiĩg đồng đoạn gen mẫu VA-11 vói Genbank Ket định danh bang phương pháp sinh học phân tử cho thấy mẫu VA 11 có độ tương đồng 100% so với chùng nấm Kết hợp với so sánh đặc điềm hình thái khẳng định chúng nấm Penicillium purpurogenum Chủng nấm có khả sinh độc tố Rubrotoxin 52 Khoa Cồng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh 3.2.3.2 Kết sinh học phân tử mẫu VA-16 Két giái trinh tự gen CCATCCCAGACGGGATTCTCACCCTCTCTGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGACA GGGGCCGCACCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAATGCGGACCCCGAAGGAGCCA GCTTTCAAATTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCGGTTG GTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCC GAGGTCAACCTGGAAAAAGATTGATTTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTAC AGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTG CCTTTGGGGCCCGTCCCCCCCGGAGAGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGTG CTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGC GCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACACTAGTTAT CGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTT TTAACTGATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATCAGACAGAGTTCGTGGT GTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGCTGAGAGCCCCCGGCGGCCATGAATGGC GGGCCCGCCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGAGGTTGGGCTCGCT AGGAACCCTACACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTA CGACTTTTACTTCCTCTAAATGACCGGGTTTGACCAACTTTCCGGCCCTGGGGGGT CGTTGCCAACCCTCCTGGGCCAGTCCGAAGGCCTCACCG Hình 10: Kết giải trình tự gen cua mẫu VA-16 Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội 53 Triệu Thị Vân Anh Khoa Cồng nghệ sinh học Aspergillus flavus isolate F4 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1,5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: JF951750.1 Length: 956Number of Matches: Related Information Range 1: 78 to 953GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps strand 1618 bits(876) 0.0 876/876(100%) 0/876(0%) Plus/Plus Query CCATCCCAGACGGGATTCTCACCCTCTCTGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGACAGGGG 60 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbjct 953 CCATCCCAGACGGGATTCTCACCCTCTCTGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGACAGGGG 894 Query 61 CCGCACCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAATGCGGACCCCGAAGGAGCCAGCTTTCAAA 120 Sbjct 893 CCGCAeCCGAAGcfrCCrcTđeAAtrƠACA5ôrisCGGAeCCcbAAGGikCT:CAGCTTTCAAA 1111 lrWiir vipn 'ViẰn 834 Query 121 TTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTTCCT 180 ’Ann Wrt Wa'lklhii 11111 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Sbjct 833 TTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTTCCT 774 Query 181 CCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGA 240 I III I III I I III I III I I II I I III I Illi I III I Illi I III I III I I III I III I I I Sbjct 773 CCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGA 714 Query 241 AAAAGATTGATTTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCC 300 I III I III I I III I I II I I II I I III I III I I III I Illi I III I III I I III I I II I I I Sbjct 713 AAAAGATTGATTTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCC 654 Query 301 CATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTGGGGCCCGTcccccccGGAG 360 I III I III I I III I III I I II I I III I Illi I III I Illi I III I III I I III I III I I I Sbjct 653 CATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTGGGGCCCGTCCCCCCCGGAG 594 54 Triệu Thị Vân Anh Khoa Cồng nghệ sinh học Query 361 AGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGG 420 I I I II I I I II I I I I I I I II I I II I I II I I I II I I II I I I II I I II I I I II I I II I I I II I Sbjct 593 aggggacgacgacccaacacacaagccgtgcttgatgggcagcaatgacgctcggacagg 534 Query 421 CATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGGAA 480 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I II I I I I I I II I I I I I I I I I I I I II I I I I I I Sbjct 533 CATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGAĨGATTCACGGAA 474 Query 481 TTCTGCAATTCACACTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAG 540 I I I II I I I II I I II I I I II I I II I I II I I I II I I II I I III I I II I I I II I I II I I I II I Sbjct 473 TTCTGCAATTCACACTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAG 414 Query 541 ÃGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCGÃTACAATCAACTCAGACTTCACTAGATC 600 I I I II I I I II I I II I I I II I I II I I II I I I II I I II I I II I I I II I I I II I I II I I I II I Sbjct 413 AGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATC 354 Query 601 AGACAGAGTTCGTGGTGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGCTGAGAGCCCCCGGCGGCC 660 I I I II I I I I I I I II I I I II I I II I I II I I I II I I I I I I II I I I II I I I II I I II I I I II I Sbjct 353 AGACAGAGTTCGTGGTGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGCTGAGAGCCCCCGGCGGCC 294 Query 661 ATGAATGcHẳ^Aịề^AGlẩẤllÌầíỔỈTkéẰ&rMlQAtỊdớÌTCltaGGTTGGGCT 720 Sbjct 293 ATGAATGGCGGGCCCGCCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGAGGTTGGGCT 234 Query 721 CGCTAGGAACCCTACACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTT 780 I I I I II I I I II I I II I I I I I I I II I I II I I II I I I II I I I I II I II I I I II I I II I I I II I II III HUH III I III II II II III II II II III I III I Illi I III II III I Illi sbjct 233 CGCTAGGAACCCTACACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTT 174 Query 781 ACGACTTTTACTTCCTCTAAATGACCGGGTTTGACCAACTTTCCGGCCCTGGGGGGTCGT 840 I I Illi I Illi Illi I III I I II II III I I II I I III I III I Illi I III I I III I Illi Sbjct 173 ACGACTTTTACTTCCTCTAAATGACCGGGTTTGACCAACTTTCCGGCCCTGGGGGGTCGT Query 841 TGCCAACCCTCCTGGGCCAGTCCGAAGGCCTCACCG 114 876 I I I II I I I II I I II I I I II I I II I I II I I I II I I II Sbjct 113 TGCCAACCCTCCTGGGCCAGTCCGAAGGCCTCACCG 78 Hình 13: So sánh độ tuong đồng doạn gen mẫu VA-16 vói Genbank 55 Khoa Cồng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh Kết quà định danh phương pháp sinh học phân tử cho thấy mẫu VA-16 có độ tương đồng 100% so với chúng nấm Kei hợp với so sánh đặc điểm hình thái khăng định chủng nam Aspergillus Flavus Chủng nam có sinh độc to Aflatoxin 3.3 Mức độ nguy hại nấm mốc sinh độc tố phân lập Kct nghiên cứu phát hai chúng nấm mốc Aspergillus Flavus Penicillium purpurogenum sinh độc to Aflatoxin Rubrotoxin Theo khuyến cáo tổ chức WHO độc tố Aflatoxin xếp vào danh sách tác nhân gây ung thư cho người, tốn thương đến gan, thận, mật, làm giảm tiết sữa, đẻ trứng sức đề kháng gia súc, gia cam Aflatoxin gây viêm da, viêm phổi, gan thận, mật Đối với bệnh nhân suy giảm miễn dịch mắc bệnh AIDS thường hay bị A jlavus gây bệnh nấm da đầu Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội Rubrotoxin gây phá húy quan the có phơi nhiễm lâu dài với gan, thận; viêm phổi, hen xuyễn viêm dày Ngoài Rubrotoxin gây thiếu máu xuất huyết gà Qua nghiên cứu cho thấy khơng khí MTLĐ sở che biến thức ăn Proconco Hãi Phòng có chứa nấm mốc Aspergillus Flavus Penicillium purpurogenum Kiổm tra kết lấy mẫu cho biết tổng nấm Aspergillus Flavus khơng khí MTLĐ chi nhánh cơng ty cổ phan Việt Pháp sàn xuất thức ăn gia súc Proconco Hải Phịng 80 ± CFU/m’ khơng khí, tống nấm Penicillium purpurogenum 65 ± CFU/m’ không khí Tổng nấm 145 ± CFƯ/m3 khơng khí, số lớn gần gấp lần mức kiến nghị WHO tổng nấm nhà cho chủng loại ( 50 CFLỈ/m’ khơng khí) 114| Người lao động việc thường xun có nguy tiếp xúc với chủng nấm mốc gây hại nói chung hai chúng nấm 56 Khoa Cồng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh Aspergillus Flavus Penicillium purpurogenum nói riêng ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, sản phẩm trình sản xuất Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội 57 Khoa Cồng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội 58 Khoa Cồng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh PHẦN 4: KÉT LUẬN VÀ K1ÉN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã nghiên cứu lấy mầu nấm mốc khơng khí MTLĐ chi nhánh công ty cổ phần Việt Pháp sản xuất thức ăn gia súc Proconco Hài Phòng bang phương pháp chù động thụ động Ket quà xác định tống nấm có khơng khí vị trí 153 ± 19 CFU/nr' khơng khí vị trí 197+24 CFU/m3 khơng khí, vị trí 319 ± 24 CFƯ/m3 khơng khí Đã phân lập định danh nấm mốc Penicillium purpurogenum Aspergillus Flavus khơng khí MTLĐ sớ che biến lương thực Kết quà giải trình tự gen đoạn gen ITS khắng định hai chủng nấm Penicillium purpurogenum Aspergillus Fiavus với độ tương đồng so với Genbank 100% Đã đánh giá tổng nấm khơng khí MTLĐ sờ chế biến thức ăn gia súc li^tếợì: tóỉ?c¥A&!ị)lS$bfePfii^kẵ tố chức quốc tế ( Việt Nam chưa có quy chuẩn tổng nấm khơng khí MTLĐ ) Đã đánh giá tổng nấm khơng khí MTLĐ sở chế biến thức ăn gia súc vượt mức cho phép WHO 4.2 Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu có hạn khn khố luận văn thực định danh hết chúng nấm mốc có nguy sinh độc tố số chất hóa học khác khơng khí MTLĐ ảnh hưởng đen người lao động sán phẩm lương thực Kiến nghị đề tài tiếp tục nghiên cứu định danh chủng nấm mốc sinh độc tố số chất hóa học gây hại.Đánh giá so sánh chủng thu với tiêu chuấn WHO nước - tố chức quốc tế 59 Triệu Thị Vân Anh Khoa Cồng nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHÁO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bệnh nấm Aspergillosis - chuyên trang y học từ PGS Nguyền Ngọc Thụy Đại cương nấm vi nấm - VOER Đặng Vũ Hồng Miên (2015) “Hệ nấm mốc Việt Nam” NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Quốc Tuấn, 2009 Đe tài "Kháo sát nhiễm vi sình khơng khí phòng phẫu thuật, phòng hồi sức so bệnh viện thành phố hồ chí minh", Viện Vệ sinh - Y tế cơng cộng thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyền Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976) Một so phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập II, NXB Khoa học Kỹ thuật, ^^ijện yịện Đại họC ỊỊà Nội http://www.baomoi.com/bo-kit-phat-hien-nhanh-doc-to-nam-trongthuc-pham-se-duoc-san-xuat-so-luong-lon/c/4038188.epi Tiêu chuấn ngành y tế: Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus Flavus, Aspergillus Niger, Aspergillus Fumigatus thực phẩm -Nhóm TQTP 52, TCN-TQTP 0001:2003 Có hiệu lực từ ngày 25 tháng năm 2003 Vũ Duy Thanh, Lê Anh Thư, Nguyễn Thế Trang (2015) “Nghiên cứu đánh giá có mặt nấm vi khuẩn hiếu khí khơng khí sớ sán xuất thức ăn gia súc” Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học tự nhiên công nghệ Tập 6S, trang 150 - 157 Vũ Duy Thanh (2014) Đe tài “ Nghiên cứu xây dựng quy trình đánh giá có mặt nấm mốc vi khuân hiếu khí khơng khí mơi 60 Khoa Cồng nghệ sinh học Triệu Thị Vân Anh trường lao động", Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam-Viện sinh thái tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học 10 Lê Thị Thu Hằng (2009) ) “ Nghiên cứu phương pháp chấn đoán nấm bệnh Aspergillus flavus sinh độc to aflatoxin kỹ thuật PCR" Luận vãn thạc sỹ Học viện Nông nghiệp 11 Ngô Thị Mai - “Sự ô nhiễm vi sinh vật khơng khí, phương pháp kiêm tra tiêu chuẩn đánh giá” 12 Nấm mốc độc tố aflatoxin: ĐHQG TPHCM-Trường ĐH Bách khoa-Khoa Kỹ Thuật Hóa Học-BỘ mơn Cơng Nghệ Hóa Và Thực Phấm 13 Thư viện học liệu Mở Việt Nam Giống (chi ) Aspergillus TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14 Domenico Davolos, Biancamaria Pietrangeli DNA sequencing and phylogenetic analysis of allergen- encoding genes form airborne moulds and Yeast Prcvetion today -July-September 2007 Vol n3, p 23r35 15 James Clayton (1986) “Airborne aflatoxin and Aspergillus flavus/Parasiticus prevalence in Georgia corn processing facilities” University of Georgia 16 Sales Anthony c Takumi Yoshizawa (2006) Journal of the Science of Food and Agriculture,Volume 86 , Issue 15 pages 2534-2542 17 Masayuki Machida Katsuya Gomi (2010) Aspergillus: Molecular Biology and Genomics Nhà xuất bàn Caister Academic Press 18 Ronald p de Vries ■ Isabelle Benoit Gelbervà Mikael Rprdam Andersen (2016) Aspergillus and Penicillium in the Post-genomic Era Nhà xuất Caister Academic Press 61 ... dộng" Mục tiêu nghiên cứu Xác định khã sinh độc tố cùa số nam mốc phân lập khơng khí mơi trường lao động Nội dung nghiên cứu - Mật độ nấm mốc có sinh độc tố có khơng khí mơi trường lao động sở chế... //ưvn.y.l 10| 1.3 Tinh hình nghiên cứu ỏ’ Việt Nam nấm mốc sinh độc tố có khơng khí mơi trường lao động 1.3.1 Tinh hình nghiên cứu nấm mốc sinh độc tố có khơng khí mơi trưịng lao động Việt Nam chưa có... sinh độc tố 14 1.2.2 Phương pháp xác định nấm mốc sinh độc tố 16 1.3 Tinh hình nghiên cứu Việt Nam nấm mốc sinh độc tố có khơng khí mơi trường lao động 21 1.3.1 Tinh hình nghiên cứu