Nghiên cứu xây dựng quy trình và đánh giá sự có mặt của nấm mốc và vi khuẩn hiếu khí trong không khí môi trường lao động

Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - VŨ DUY THANH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ CÓ MẶT CỦA NẤM MỐC VÀ VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG KHƠNG KHÍ MƠI TRƢỜNG LAO ĐỘNG Chun ngành: Vi sinh vật học Hà Nội - 2014 K16 1Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh MỞ ĐẦU Trong không khí, ngồi bụi thành phần cịn có vi sinh vật vi khuẩn, nấm mốc, thành phần có liên quan mật thiết với nồng độ bụi, bụi hữu nhiều số lượng vi sinh vật nhiều, vi sinh vật khơng khí gồm nhiều loại khác cầu khuẩn gây bệnh, trực khuẩn lao, trực khuẩn bạch hầu tạp khuẩn khác, quan trắc vi sinh vật khơng khí cách để dự phịng định hướng nguy tiểm ẩn gây ô nhiễm sinh học không khí Điều kiện ngoại cảnh điều kiện thời tiết có ảnh hưởng nhiều tới tình trạng số lượng vi sinh vật khơng khí, khí hậu Việt Nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới ấm ẩm, nước Việt Nam có vùng khác khí hậu miền Bắc thuộc vùng khí hậu nhiệt đới ấm ẩm, vùng khí hậu khu vực miền Trung thuộc vùng nhiệt đới gió mùa, vùng khí hậu vùng phía nam thuộc vùng khí hậu nhiệt đới Xavan (có hai mùa rõ rệt mùa khơ mùa mưa), đa dạng mà vùng Việt Nam có phân bố số lượng vi sinh vật khơng khí khác nhiều Tùy theo mùa có phát triển loại vi khuẩn hay vi nấm gây bệnh phát triển nhanh gây bệnh dịch hàng loạt Mùa hè khu vực miền Bắc nắng nóng, kèm theo ẩm cao tạo môi trường thuận lợi cho vi sinh vật gây bệnh phát triển, tác nhân gây bệnh viêm phổi, cảm cúm nhiều bệnh khác Hiện khoa học công nghệ sinh học, khoa học y học tiên tiến tìm nguồn gốc tác nhân gây bệnh người, động vật loài vi sinh vật gây lên, chúng có mặt khắp nơi trái đất, thể động vật thực vật, người hay phận cấp độ nhỏ Chúng phát tán lây nhiễm thông qua đất, nước, mơi trường khơng khí đường phát tán nhanh lây nhiễm bệnh cho vùng rộng lớn nhanh chóng thành phần khơng khí có mật độ vi sinh gây dịch bệnh Việt Nam nước cơng nghiệp hóa, hàng năm với số lượng cơng ty nước ngồi đặt Việt Nam, tận dụng nguồn nhân lực rẻ đây, mật độ công nhân làm việc dây chuyền sản xuất công ty số lượng lớn, nguy lây truyền bệnh dịch cao, nước ta chưa có nhiều hành lang pháp lý, điều kiện để phịng ngừa kiểm sốt rủi đó, việc kiểm sốt đo kiểm mơi trường lao động cơng ty chưa có chuẩn mực cấp quốc gia, chưa có phương pháp có độ xác, độ tin cậy cao sử dụng quan trắc môi trường lao động Việt Nam, nghiên cứu xây dựng quy trình đánh giá yếu tố K16 2Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh gây ô nhiễm việc cần thiết, nhằm xây dựng sở liệu diễn biến môi trường, nhằm cảnh báo nguy gây nhiễm yếu tố sinh học Nghiên cứu quy trình kỹ thuật phân tích vi sinh vật khơng khí cần thiết, chưa có quy trình kỹ thuật thức chứng minh độ xác phổ biến cách thống phịng thí nghiệm Việt Nam, hay chứng minh tính xác quy trình kỹ thuật cách quy trình phân tích vi sinh vật khơng khí Trên sở lý luận khoa học ý nghĩa thực tiễn trình bày trên, chúng tơi thực đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình đánh giá có mặt nấm mốc vi khuẩn hiếu khí khơng khí mơi trường lao động”, với mục tiêu nội dung sau đây: Mục tiêu đề tài luận văn: - Đánh giá tổng vi khuẩn hiếu khí tổng nấm mơi trường khơng khí lao động - Có quy trình phân tích tổng vi khuẩn hiếu khí tổng nấm khơng khí mơi trường lao động Nội dung nghiên cứu: - Khảo sát chọn lựa môi trường nghiên cứu khảo sát lấy mẫu khơng khí - Quan trắc mơi trường khơng khí lao động - Đánh giá ô nhiễm chất lượng môi trường khơng khí sở sản xuất thực phẩm - Xây dựng quy trình phân tích nấm mốc vi khuẩn hiếu khí khơng khí mơi trường lao động Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài: - Đề tài góp phần bổ sung sở lý luận việc nghiên cứu có mặt nấm vi khuẩn hiếu khí khơng khí mơi trường lao động - Đưa quy trình phân tích tổng vi khuẩn hiếu khí tổng nấm khơng khí mơi trường lao động K16 3Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT TRONG KHƠNG KHÍ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.1.1 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật khơng khí giới Thế giới quan tâm nhiều đến tồn phát tán vi sinh vật không khí, mơi trường khơng khí khơng phải mơi trường dinh dưỡng, vi sinh vật sinh trưởng được, khơng mà mơi trường khơng khí không ô nhiễm Sự tồn phân tán vi sinh vật khơng khí hiểm họa tiềm tàng gây loại bệnh, có bệnh hiểm nghèo, tạo đà bùng phát dịch bệnh Viện Nghiên cứu quốc gia sức khỏe an toàn lao động Mỹ (NIOSH) đưa phương pháp lấy mẫu bioaerosol cho vùng không khí nhà (indoor air) từ năm 1998 (Method NIOSH) Quan trắc vi khuẩn nấm mốc không khí khơng đánh giá chất lượng mơi trường khơng khí khu vực mà cịn phát sớm nguồn gốc có nguy nhiễm bệnh, nhằm phịng chống gây bệnh vi sinh vật gây nguy ngộ độc thực phẩm phát tán vi khuẩn, nấm nấm mốc khơng khí [28] 1.1.2 Tình hình nghiên cứuvi sinh vật khơng khí Việt Nam Việt Nam chưa có nhiều người quan tâm đến ảnh hưởng vi sinh không khí, chưa nhìn thấy ảnh hưởng đến môi trường cộng đồng Năm 2003 Từ Hải Bằng ứng dụng kỹ thuật đặt đĩa thạch lấy mẫu khơng khí đánh giá chất lượng khơng khí mặt sinh học phịng thí nghiệm vi sinh kết so sánh hai mùa đông mùa hè, tiêu đánh giá trung bình mật độ khơng khí TVKHK 2,6.103 CFU/m3khơng khí cao mùa hè nhiều 5,13.102 CFU/m3 khơng khí, tổng số nấm tương tự 5,2.102CFU/m3 vào mùa nóng mùa lạnh 4,62.102CFU/m3 [1] Năm 2009 Nguyễn Quốc Tuấn có nghiên cứu đánh giá chất lượng phòng mổ 13 bệnh viện quanh thành phố Hồ Chí Minh, kết cho thấytỷ lệ phòng mổ, phòng hồi sức đạt mức C theo tiêu chuẩn EU GMP 1997 WHO 2002 6,1%; đạt mức D 21,2%, tỷ lệ đạt theo tiêu chuẩn K16 4Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh phịng phẫu thuật Merck 2009 (10 ÷ 200 CFU/m3) 21,2% Số lượng vi sinh không khí 13 bệnh viện Thành phố Hồ Chí Minh phần lớn tập trung khoảng từ 2.102 ÷ 5.102 CFU/m3 chiếm 70% (23/33 phòng) [9] Năm 2010 Trịnh Quỳnh Mai có nghiên cứu so sánh hai phương pháp lấy mẫu thiết bị lấy mẫu đạt đĩa thạch kết quảdùng thiết bị lấy mẫu có độ đồng so với phương pháp đặt đĩa thạch [6] Năm 2011 có nhiều nghiên cứu khảo sát mức độ nhiễm nấm mơi trường khơng khí phịng khơng máy lạnh, dược liệu bán thành phố Hồ Chí Minh, mức nhiễm vượt qua mức giới hạn cho phép tiêu chuẩn WHO [36] 1.2 SỰ TỒN TẠI CỦA VI SINH VẬT TRONG KHƠNG KHÍ Mơi trường khơng khí khơng phải làm mơi trường có thành phần dinh dưỡng, vi sinh vật không sinh trưởng không khí, vi sinh vật chúng bám vào hạt bụi lơ lửng bay khơng khí, tìm thấy nhiều loại vi sinh vật khác tồn khơng khí Qua nhiều người có quy định chung tên gọi Bioaerosol Bioaerosol hiểu bao gồm hạt bụi sinh học lơ lửng khơng khí có vi khuẩn nấm, hạt phấn hay bào tử khác 1.2.1 Vi khuẩn khơng khí Vi khuẩn khơng tồn độc lập mơi trường khơng khí vi khuẩn sinh vật nhỏ khơng thể tự phát tán di chuyển khơng khí thường bám vào hạt bụi lơ lửng không khí hay dạng hạt khác di chuyển lơ lửng khơng khí, phát tán vi khuẩn khơng khí gián tiếp nhờ vật chủ khác bay lơ lửng khơng khí, di chuyển từ nơi đến nơi khác nhờ tác động gió, bão, chuyển động khơng khí đưa đẩy hạt bụi khơng khí Vi khuẩn khơng sinh trưởng khơng khí nhà khoa học tìm thấy nguy tiềm ẩn rủi có nguồn gốc từ khơng khí Nhưng số lồi vi khuẩn tồn vài đến vài tháng môi trường khơng khí được, vi khuẩn lao chẳng hạn tồn mơi K16 5Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh trường tự nhiên khoảng ÷ tháng, chúng bám vào hạt bụi lơ lửng khơng khí 1.2.1.1 Bacillus khơng khí Vi khuẩn Bacillus bao gồm loại vi khuẩn hình que, Gram (+), hiếu khí thuộc họ Bacillaceae, chúng có mặt khắp nơi, nơi có điều kiện khắc nghiệt Điều kiện sống gay go chúng tạo bảo tử gần hình cầu để tự tồn dạng giống ngủ đông Đa số chủng vi khuẩn vô hại, có hai lồi xem quan trọng B anthracis B cereus thường gây ngộ độc thực phẩm, B anthracis gây bệnh than chết người sử dụng làm vũ khí sinh học nhiên chưa có nghiên cứu cơng bố tìm thấy khơng khí, B subtilis chủng xuất nhiều, chúng có khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh khác E.coli, ruột người chúng vi sinh có ích giúp cải thiện hệ thống tiêu hóa Ngộ độc thực phẩm gây vi khuẩn B cereus dẫn đến tiêu chảy độc tố thành phần tạo chủng vi khuẩn đục thủng giết chết tế bào Độc tố bao gồm ba protein (3 thành phần) hiếm, số enterotoxin khơng tán huyết, gọi Nhe Độc cho độc tố gây ngộ độc thực phẩm B cereus sản sinh Nó tìm thấy tất chủng B cereus gây ngộ độc thực phẩm gần tất chủng B cereus khác, ba protein độc tố Nhe gọi NheA, NheB NheC 1.2.1.2 Staphycoccus không khí Staphylococcus lọai cầu khuẩn, bao gồm giống hiếu khí (Micrococcus, Planococcus Deinococcus), giống kị khí tuỳ nghi (Staphylococcus, Stomacoccus, Streptococcus, Leuconostos, Pediococcus, Aerococcus Gemella) giống kị khí (Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Coprococcus Sarcina) Họ Micrococcaceae gồm bốn giống: Micrococcus, Stomacoccus, Planococcus Staphylococcus Những đặc tính khác cầu khuẩn Gram (+) gồm: xếpcủa tế bào, hiếu khí bắt buộc, kị khí tuỳ nghi hay vi hiếu khí, kị kí bắt buộc, phản ứngcatalaza, diện cytochrom, sản phẩm lên men từ trình kị K16 6Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh khí,peptidoglycan, axit teichoic thành tế bào vi khuẩn (Scott E.M cs, 2000) Staphylococcus tụ cầu có khả gây bệnh lớn cho người động vật Trên phương diện gây bệnh tụ cầu khuẩn chia làm hai nhóm chính: có men coalugaza xuất mơi trường thạch máu có màu vàng gọi tụ cầu vàng khơng có men coagulaza xuất mơi trường thạch máu có màu trắng ngà gọi tụ cầu trắng Chúng tác nhân gây nhiều loại bệnh chúng bám cư trú phân thể da, khoang miệng, gây viêm phổi cấp tính bị hít phải Trong thực phẩm vi khuẩn cần 1,0 x 102CFU/g thức ăn đủ để bị ngộ độc, vi khuẩn nguy hiểm chúng xuất mơi trường khơng khí Khi bị nhiễm trùng da, mô tế bào, áp xe vi khuẩn S aureus mổ chúng tạo thành mủ có màu vàng, đặc, khơng Chúng cịn gây nhiều loại viêm nhiễm khác phận thể chúng theo tuyến dịch hay vết thương hở[10]; [36] 1.2.2 Nấm nấm mốc khơng khí Giới nấm (Fungi) nhóm sinh vật đơn ngành thuộc dạng tế bào nhân thực, Cơ thể đơn bào đa bào dạng sợi, có thành kitin (trừ số có thành xenluloza), khơng có lục lạp, Sống dị dưỡng hoại sinh, ký sinh cộng sinh, sinh sản chủ yếu bào tử, bào tử thường khơng có lơng có roi Nấm phát triển điều kiện có sẵn chất hữu nhiệt độ từ 25 ÷ 30oC, Ở 0oC nấm khơng phát triển được, nhiệt độ 100oC giết chết nhiều loại nấm, hệ thống phân loại giới RH, (Whittaker the five kingdom system) nấm thuộc giới riêng rẽ gọi giới nấm, Theo Elizabeth Tootyll (1984) nấm mốc có khoảng 5.100 giống 50.000 lồi mơ tả, ước tính có đến 250.000 lồi nấm có mặt trái đất Nấm có nhiều lồi có lồi có lợi có lồi có hại, cịn tùy vào diện đâu, điều kiện chất Chúng tạo chất ngoại độc tố nội độc tố gây hại cho môi trường xung K16 7Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh quanh Nấm có dạng điển hình gồm nấm men nấm sợi, chúng khác nhiều đặc điểm sinh học Nấm men (Yeast) sinh vật đơn bào, sinh sản nảy mầm chồi phân cắt Hình dạng cấu trúc nấm thể đơn bào có hình trứng (thường nấm men), đa số có hình sợi, sợi có ngăn vách (đa bào) hay khơng có ngăn vách (đơn bào) Sợi nấm thường ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác tùy theo lồi, Đường kính sợi nấm thường từ ữ àm, cú di n 10 àm, chí đến mm, Chiều dài sợi nấm tới vài chục cm, sợi nấm phát triển theo chiều dài theo kiểu tăng trưởng Liên quan đến gây bệnh nấm thông qua phương thức là: ký sinh, gây bệnh với tượng dị ứng, gây bệnh ăn phải thực phẩm nhiễm nấm độc tố chúng, gây bệnh ăn phải nấm độc Nhiều loài phổ biến thuộc chi Aspergillus Penicillium chúng phân bố rộng rãi trái đất nhiều loại chất tự nhiên, chúng có mặt khắp nơi trái đất Theo E Kister, M Morelet (2000) ước tính số lồi biết chi Penicillium khoảng 233 loài, chi Aspergillus khoảng 185 loài Một số lượng lớn phát lợi ích mang lại có nhiều như, chúng tham gia q trình sản xuất cơng nghiệp kháng sinh, công nghệ lên men, nhiều ứng dụng khác có lợi cho người mơi trường cộng đồng Bên cạnh có nhiều lồi có hại, chất độc nấm tạo gọi chung mycotoxin gây ảnh hưởng tới sức khỏe người vấn đề dị tật bẩm sinh, não, gan, thận[4]; [5]; [9]; [11]; 1.2.2.1 Aspergillus khơng khí Nấm Aspergillus giống có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn ngang phát triển chủ yếu bề mặt chất, tế bào chất có nhiều nhân nhân di chuyển qua lại tế bào với lỗ nhỏ vách ngăn Khuẩn ty hình thành cọng mang túi bào tử Aspergillus Chúng sinh sản vơ tính hình thành cọng bào tử từ tế bào chân với túi có cuống (vehicle), thể bình bào tử đính (conidia) K16 8Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh 1.2.2.2 Penicillium khơng khí Giống Penicillium có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn tế bào với lỗ nhỏ để phần tử tế bào chất thông thường Cọng bào tử phân nhánh với thể bình cấp 1, và tận đính bào tử trần dễ dàng phát tán khơng khí, đặc biệt đính bào tử có màu xanh lục đặc trưng cho giống Penicillium 1.2.2.3 Một số lồi nấm khác khơng khí Một số lồi nấm khác thuộc giống Rhizopus, Mucor, Candida gây bệnh người, Microsporum gây bệnh chó, A fumigatus gây bệnh chim; Saprolegnia Achlya gây bệnh nấm ký sinh cá Những loài nấm gây bệnh trồng Phytophthora, Fusarium, Cercospora[18] 1.3 ẢNH HƢỞNG CỦA VI SINH VẬT TRONG KHƠNG KHÍ TỚI SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG 1.3.1 Ảnh hƣởng vi khuẩn đến môi trƣờng sức khỏe cộng đồng Vi khuẩn hiếu khí vi khuẩn mọc sống có xuất oxy Vi khuẩn hiếu khí bao gồm nhiều lồi, có loại gây dị ứng, gây bệnh truyền nhiễm, gây độc, nhóm vi sinh vật tồn số lượng lớn môi trường hiểm họa tiềm ẩn bùng phát dịch bệnh lúc nào, gặp điều kiện môi trường sống thuận lợi vi sinh vật gây bệnh bùng phát thành ổ dịch khơng kiểm sốt kịp thời trở thành đại dịch, bệnh gặp phổ biến viêm phổi cấp, lao, tả lỵ, thương hàn bệnh thường gặp nhất, ngồi cịn nhiều bệnh khác gặp người mẫn cảm, hay địa người phù hợp với điều kiện sinh trưởng phát triển loại vi sinh vật gây bệnh này, lây truyền bệnh truyền nhiễm gây vi sinh vật thông qua đường khơng khí khó kiểm sốt, phát tán khơng gian rộng lớn Trong khơng khí có nhiều loại vi khuẩn có lồi có lợi, có khơng loài gây hại cho sức khỏe sinh vật, động vật người Vi K16 9Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh khuẩn chủ yếu gây bệnh nhiễm trùng khác tốc độ gây bệnh nhanh gây tử vong khơng kịp thời điều trị hơ hấp cấp tính (S aureus, S epidermidis) hay C trachomatis gây bệnh mắt hột, Mycoplasma pneumoniae gây bệnh viêm phổi Những lồi gây dịch tả (Vibrio cholera) Cịn nhiều loại bệnh khác, nguyên nhân gây vi khuẩn[10]; [13]; [14]; [15]; [19]; [24] 1.3.2 Ảnh hƣởng nấm đến môi trƣờng sức khỏe cộng đồng , hình thành nấm chuyển hóa chất dinh dưỡng có thức ăn nguyên liệu Sự hình thành nấm mốc độc tố chúng cịn đồng, lúc thu hoạch, bảo quản trình chế biến thức ăn cho vật nuôi Như vậy, không nơi giới khỏi nấm mốc độc tố từ chúng, tác hại chúng vô to lớn suất vật nuôi sức khỏe người Các loại độc tố sinh từ loại nấm mốc điển hình như: Aflatoxin: Aflatoxin nhiễm nhiều khô dầu phộng, khô dầu dừa, bắp, cám, tấm… A flavus A.parasiticus sinh ra, độc tố gây tổn thương gan, thận, mật , làm giảm khả tiết sữa, đẻ trứng sức đề kháng gia súc, gia cầm Theo Tổ chức bệnh ung thư Quốc tế aflatoxin xếp vào danh sách tác nhân gây ung thư cho người Ochatoxin A: A ochraceus sinh ra, nguyên liệu dễ nhiễm độc tố cám gạo, lúa mì, bột mì, bắp, đậu nành, cà phê Dư lượng ochratoxin tìm thấy thịt heo thịt gia cầm Độc tố gây hại đến gan thận động vật Với nồng độ lớn 1ppm làm giảm sản lượng trứng gà đẻ, nồng độ lớn 5ppm gây nên tổn thương gan ruột Tương tự aflatoxin, độc tố gây nên giảm sức đề kháng tác nhân gây ung thư người Citrinin: Độc tố sinh nấm P citricum có nhiều gạo để mốc, độc tố gây hại cho thận, gây hoại tử nhiễm trùng làm tổn hại đến chất lượng quầy thịt K16 10Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh a/ b/ Hình 3.25 Thu mẫu sở sản xuất thức ăn chăn nuôi a/ Kho nguyên liệu; b/ Khu vực nghiền ngô a/ b/ c/ d/ Hình 3.26 Hình thái khuẩn lạc tế bào nhóm vi khuẩn nấm mốc đại diện a; b: Chủng Bacillussp.HN16; c, d: Chủng Aspergillussp.HN18 Kết quan trắc vi sinh vật sở sản xuất thức ăn Hà Nội thể bảng 3.26 Kết thể kết trung bình lần lấy mẫu lặp lại vị trí Bảng 3.26 Số lượng vi sinh vật thu mơi trường khơng khí sở Proconco Hà Nội Số lượng vi sinh vật (CFU/m3) thu Vị trí thu mẫu A flavus A niger A parasiticus Aspergillus sp Penicillium sp B subtilis Staphylococcus sp K1 9,2.101 1,6.102 6,5.101 9,0.101 6,3.101 7,5.101 1,3.101 K2 9,5.101 1,4.102 8,5.101 6,0.101 6,7.101 7,2.101 1,7.101 K3 3,3.102 3,4.102 1,9.102 2,0.102 1,5.102 1,8.102 2,0.101 K4 3,2.102 3,7.102 1,8.102 2,2.102 1,3.102 1,8.102 3,2.101 K5 3,2.102 3,5.102 1,8.102 2,1.102 1,4.102 1,8.102 3,0.101 K6 1,5.102 1,3.102 9,0.101 1,0.102 6,2.101 7,7.101 2,3.101 K7 3,2.102 4,7.102 2,1.102 2,0.102 1,7.102 1,8.102 3,3.101 K8 3,3.102 4,8.102 1,9.102 2,4.102 1,7.102 1,7.102 4,0.101 K9 3,3.102 4,6.102 2,0.102 2,5.102 1,7.102 1,8.102 3,5.101 K16 64Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh Kết nghiên cứuđã thực việc phân lập riêng rẽcác chi khác tổng nấm cóAspergillus, Penicilliumvà tổng vi khuẩn có mơi trường khơng khí Cơng ty Proconco Hà Nội, môi trường lao động Công ty tìm thấy nhiều chi nấm Aspergillus sp., Penicillium sp vi khuẩn thuộc chi Bacillus sp., có xuất số vi khuẩn khác tạm thời định danh thuộc loại Staphylococcus sp (bảng 3.26) Bảng 3.27 Số lượng vi sinh vật thu môi trường không khí sở Proconco Hưng Yên Vị trí thu mẫu Số lượng vi sinh vật (CFU/m3) thu A flavus A niger A parasiticus Aspergillus sp Penicillium sp B subtilis Staphylococcus sp K1 8,7.101 1,1.102 8,0.101 8,7.101 5,8.101 8,5.101 1,7.101 K2 8,3.101 1,0.102 8,0.101 8,8.101 7,3.101 1,0.102 3,0.101 K3 3,3.102 3,6.102 2,0.102 2,1.102 1,5.102 1,7.102 2,3.101 K4 1,7.102 3,3.102 1,8.102 2,0.102 1,6.102 1,8.102 2,3.101 K5 1,4.102 4,0.102 1,9.102 2,3.102 1,6.102 1,7.102 3,3.101 K6 9,7.102 1,7.102 9,3.101 1,3.102 9,0.101 8,3.101 4,5.101 K7 2,7.102 4,7.102 2,0.102 2,1.102 1,7.102 1,9.102 6,5.101 K8 3,2.102 4,4.102 2,0.102 2,4.102 1,7.102 1,9.102 7,2.101 K9 3,2.102 4,6.102 2,1.102 2,5.102 1,7.102 1,8.102 5,8.101 Tương tự Công ty Proconco Hưng Yên thực vị trí giống nhaukết thể bảng 3.27 Kết phân loại cụ thể loài nấm mốc tổng vi khuẩn hiếu khí mơi trường khơng khí có nhiều lồi nấm mốc có nguy gây ngộ độc thực phẩm A niger, A flavus, A parasiticus, Penicillium sp Vi khuẩn hiếu khí xuất loài B subtilis Staphylococcus sp cho thấy đa dạng vi sinh vật khơng khí mơi trương lao động, có nguy co gây hại đến người lao động lớn Tương tự hai Công ty trên, Công ty Proconco Hải Phòng thực ngày thứ ba, khoảng thời gian điều kiện thời tiết khu vực gần nóng độ ẩm dao động mức cao 80% điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Kết quan trắc mơi trường khơng khí định danh số khuẩn lạc đặc trưng thể cụ thể bảng 3.28 K16 65Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh Bảng 3.28 Số lượng vi sinh vật thu mơi trường khơng khí sở Proconco Hải Phịng Vị trí thu mẫu Số lượng vi sinh vật (CFU/m3) thu A flavus A niger A parasiticus Aspergillus sp Penicillium sp B subtilis Staphylococcus sp K1 1,0.102 1,2.102 5,3.101 9,2.101 7,5.101 8,5.101 2,0.101 K2 9,7.101 1,0.102 7,5.101 9,5.101 6,8.101 1,0.102 1,7.101 K3 3,2.102 3,5.102 2,0.102 2,1.102 1,6.102 1,8.102 2,3.101 K4 2,2.102 4,5.102 1,8.102 2,3.102 1,6.102 1,8.102 2,2.101 K5 3,0.102 4,4.102 1,9.102 2,4.102 1,7.102 1,7.102 3,3.101 K6 1,2.102 1,6.102 9,7.101 1,3.102 8,3.101 1,0.102 3,5.101 K7 3,1.102 4,7.102 2,0.102 2,4.102 1,7.102 1,9.102 4,7.101 K8 3,0.102 4,8.102 2,0.102 2,5.102 1,5.102 1,8.102 6,2.101 K9 3,0.102 4,7.102 2,0.102 2,5.102 1,7.102 1,8.102 5,7.101 Kết nghiên cứu thực nghiệm quan trắc mật độ vi sinh vật có mơi trường khơng khí cao, cụ thể tổng số nấm dao động từ 5,0.102 ÷ 2,1.103 CFU/m3 khơng khí tổng vi khuẩn hiếu khí dao động từ 1,2.102 ÷ 1,0.103CFU/m3, khiso sánh tiêu chuẩn OSHA tất vị trí sản xuất vượt tiêu chuẩn khoảng 2,1 lần, quan trắc vị trí phịng ban quản lý có mật độ tổng vi sinh vật khơng khí cao khơng đạt tiêu chuẩn cho phép.Dựa vào quy định giới hạn cho phép bảng 3.28so sánh gần 9/9 vị trí quan trắc có số lượng vi sinh vật cao giới hạn cho phép Mơi trường khơng khí khu vực sản xuất sơ chế, nghiền ngô, khu vực nạp liệu có mật độ vi sinh vật lớn, cịn vị trí phịng ban quản lý có lượng vi sinh vật thấp hơn.Với đặc thù công ty sản xuất thức ăn gia súc, nguyên liệu hầu hết ngơ, sắn, lạc, đậu tương, nguồn cư trú nhiều loài nấmkhác nhau.Khi định danh xác định chi nấmAspergillussp., Penicilliumsp … xác định chi vi khuẩn Bacillus sp., Staphylococcus sp.có mơi trường khơng khí Kết nghiên cứu sơ định dạng loại vi sinh vật có mơi trường khơng khí,cụ thể với chi Aspergillus xác định nhóm lồi A flavus, A niger, A paraciticus, đóA niger có tỷ lệ cao Các vị trí nghiền ngơcó mật độ chi Aspergillus cao, sở Hà Nội A.flavus 3,3.102 CFU/m3, A.niger 3,4.102 CFU/m3, A paraciticus1,9.102CFU/m3 sở Hưng Yên A.flavus 3,2.102 CFU/m3, A.niger 3,6.102 CFU/m3, A paraciticus 2,0.102CFU/m3 sở Hải Phòng:A flavus 3,2.102CFU/m3, A.niger 3,5.102CFU/m3, A K16 66Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh paraciticus 2,0.102CFU/m3 Đây ba nhóm lồi có tỷ lệ sinh độc tố aflatoxin nhiều, nguy gây ngộ độc thực phẩm cao Trong khơng khí bị hít phải, tiếp xúc thường xun có nguy bị bệnh nấm aspergillosis (gây da, mắt, tai, họng phổi)[10], [36].Với kết quan trắc nấm khơng khí so sánh giới hạn cảnh báo WHO, Robertson (Mỹ); (Canada 1993)[36] Cho thấy nhóm lồi vị trí mật độcác loàinấm Aspergillus cao tiêu chuẩn cho phép từ 3,9 ÷ 7,3 lần Tương tự vị trí khác sơ chế ngơ, nạp liệu phối trộn xác định mật độ nấm vi khuẩn mức cao Cao nhóm lồi A niger, cụ thể sở tạiHà Nộivị trí sơ chế ngơ là: 4,8.102 CFU/m3, nạp liệu 4,7.102 CFU/m3, khu vực phối trộn 4,6.102 CFU/m3, tương tự vị trí mật độ lồi nấm A flavus cao khu vực sơ chế ngô 3,3.102 CFU/m3, phối trộn 3,3.102 CFU/m3, nạp liệu 3,2.102 CFU/m3 lồi nấm có khả sinh độc tố aflatoxin lớn Tương tự sở Hà Nội Hưng n Hải Phịng vị trí cao như: sở Hưng Yên vị trí sơ chế ngơ A.niger 4,4.102 CFU/m3, A flavus 3,2.102 CFU/m3 A parasiticus 2,1.102 CFU/m3, nạp liệu: A.niger 4,7.102 CFU/m3, A flavus 3,0.102 CFU/m3, A parasiticus 2,0.102 CFU/m3 Hai vị trí người lao động tiếp xúc nhiều, nguyên liệu ngô sơ chế nồng độ bụi, bụi sinh học cao, theo số liệu khám sức khỏe hàng năm công ty công nhân khu vực tỷ lệ bị viêm họng bị ho nhiều nhất, kết quan trắc vi sinh vật vị trí mật độ cao so với khu vực khác công ty, mật độ cao giới hạn cho phép WHO nhiều lần, lớn số mật độ nấm mốc A niger cao 9,6 lần so với giới hạn cho phép [10], [36], cảnh báo người lao động làm việc khu vực cần có phương tiện bảo hộ lao động cá nhân, đảm bảo vệ sinh môi trường giảm thiểu phát sinh bụi, bụi sinh học, giảm thiểu yếu tố có nguy gây hại cho người lao động Ngồi cịn có loại nấm khác Penicilliumsp.và loài khác Aspergillussp., nhiên mật độ khơng cao nhóm loài Với mật độ nấm Penicillium sp dao động từ 5,8.101 ÷ 1,7.102CFU/m3khơng khí cao, nhiều lồi nấm Penicillium sp có lợi cho mơi trường khơng lồi có hại Tham khảo từ quy định hướng dẫn OSHA 3304-04N, 2006 (Occupationl Safety and Health Administration) hướng dẫn WHO (Dampnees and mold indoor air quality)[36] chất lượng khơng khí nhà ẩm ướt nấm mốc, người lao động tiếp xúc sớm với nhiều loài nấm, vi khuẩn hiếu khí có khơng khí có nguy cao mắc bệnh hen suyễn phổi K16 67Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh 3.4.2 Phân loại vi sinh vật khơng khíbằng phƣơng pháp sinh học phân tử 3.4.2.1 Xác định trình tự 16S rARN nhóm vi khuẩn hiếu khí đại diện Hiện nay, bên cạnh phương pháp phân loại vi sinh vật truyền thống, nhà khoa học sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phân loại dựa trình tự gen Tiến hành xác định trình tự 16S rARN chủng vi khuẩn HN16 đại diện cho nhóm Bacillus 28S rARN chủng nấm mốc HN18 đại diện cho nhóm Aspergillus có số lượng lớn nghiên cứu * Phân lập đoạn gen mã hoá 16S rARN từ ADN genom chủng vi khuẩn HN16:Tách chiết ADN tổng số bước khởi đầu để tiến hành thí nghiệm Hình 3.27trình bày kết điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ chủng HN16trên agaroza 0,8 % Kết kiểm tra máy đo quang phổ cho thấy ADN tổng số tách chiết có độ tinh cao (A260/280 = 1,85 - 1,91), mẫu ADN sử dụng làm khn để thực phản ứng PCR MHN16 Hình 3.27.Điện di đồ sản phẩm PCR 1,5 kb chủng vi khuẩn HN16 (M: marker) Trong trình tiến hành phản ứng, nhiệt độ điều chỉnh bắt cặp đoạn mồi, nồng độ đoạn mồi, MgCl2, ADN genom khuôn để PCR xảy đặc hiệu Bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi 16S F 16S R thu gen mã hoá 16S rARN chủng vi khuẩn HN16 Kết điện di đồ hình cho thấy sản phẩm PCR thu băng đặc hiệu Kích thước phân tử vào khoảng 1,5 kb tương đương với tính tốn lý thuyết * Xác định trình tự gen 16S rARN chủng vi khuẩn HN16 Sản phẩm PCR sau tinh dùng trực tiếp để xác định trình tự nucleotit gen 16S rARN Sử dụng đoạn mồi gắn huỳnh quang hoá chất chuẩn, phân tích máy xác định trình tự ADN tự động, xử lí chương trình PC/GENE Truy cập ngân hàng gen để tìm lồi đăng ký có trình tự tương đồng Trình tự đoạn gen 16S rARN chủng HN16được thể hình 3.28 bảng 3.29 K16 68Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh Trình tự đoạn gen 16S rARN chủng HN16được thể hình 3.28 tgcgcaagct tagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat 61 gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 121 cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 181 tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 241 gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc 301 cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 361 gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 421 atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag 481 ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 541 gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 601 ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 661 acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 721 ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 781 cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 841 gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 901 agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 961 atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 1021 cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1081 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1141 cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1201 gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1261 aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1321 cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1381 ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac Hình 3.28.Trình tự nucleotit 16S rARN chủng vi khuẩn HN16 Bảng 3.29 Mức độ tương đồng gen 16S chủngvi khuẩn HN16với trình tự chủng GenBank Mã Thông tin chủng % tương đồng AY775778.1 Bacillus subtilis BFAS 100 HQ236379.1 Bacillus subtilis SL9-9 100 EU257436.1 Bacillus subtilis C8-4 99 AB501113.1 Bacillus subtilis A97 99 FJ528074.1 Bacillus sp BM2 99 Kết hình 3.28và bảng 3.29cho thấy chủng HN16 có độ tương đồng 100 % so với chủng Bacillus subtilis Vì vậy, chủng vi khuẩn HN16 ký hiệu Bacillus subtilis HN16 3.4.2.2 Xác định trình tự 28S rARN nhóm nấm mốc đại diện K16 69Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh Đối với nấm mốc sử dụng trình tự gen 28S rARN phổ biến nay,Gen có mặt tất tế bào, chứa vùng bảo thủ cao vùng biến đổi cho phép phân biệt loài khác giới nấm mốc dễ dàng.Hình 3.29trình bày kết điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số từ chủng HN18trên agaroza 0,8 % Kết kiểm tra máy đo quang phổ cho thấy ADN tổng số tách chiết có độ tinh cao (A260/280 = 1,85 - 1,91), mẫu ADN sử dụng làm khn để thực phản ứng PCR đặc hiệu M HN18 Hình 3.29.Điện di đồ sản phẩm PCR chủng nấm mốc HN18 (M: marker) 800 bp Trình tự gen 28S rARN chủng HN18 thể hình 3.30 tgacctcgga tcaggtaggg atacccgctg aacttaagca 61 gaaaccaacc gggattgcct cagtaacggc gagtgaagcg 121 gctggctcct tcggagtccg cattgtaatt tgcagaggat 181 ctaagtgccc tggaacgggc cgtcagagag ggtgagaatc 241 gtgcccgtgt aaagctcctt cgacgagtcg agttgtttgg 301 ggtaaatttc atctaaagct aaatactggc cggagaccga 361 cgaaagatga aaagcacttt gaaaagagag ttaaacagca 421 agcgcttgcg accagactcg cccgcggggt tcagccggca 481 cgtgggcggg ccagcgtcgg tttgggcggc cggtcaaagg 541 ccggggcacc ttatagccag gggtgcaatg cggccagcct 601 gcacggacgc tggcataatg gtcgtaaacg acccgtcttg 661 aacatctacg cgagtgttcg ggtgtcaaac ccgtgcgcgc 721 ggagccccct tgcggggcgc accatcgacc gatcctgatg 781 agagcgtagc tgtggggacc cgaaagatgg tgaactatgc tatcaataag gcaagagctc gctttgggtg ccgtcttggg gaatgcagct tagcgcacaa cgtgaaattg ttcgtgccgg cccctggaat ggaccgagga aaacacggac agtgaaagcg tcttcggatg ctgaataggg cggaggaaaa aaatttgaaa cggcccccgt cggggtgtcc ctaaatgggt gtagagtgat ttgaaaggga tgtacttccc gtagtgccct acgcgcttcg caaggagtct aacggaggtg gatttgagta cgaagccaga Hình 3.30.Trình tự nucleotit 28S rARN chủng nấm mốc HN18 Bảng 3.30.Mức độ tương đồng gen 28S rARN chủng nấm mốc HN18 với trình tự chủng GenBank Mã Thông tin chủng % tương đồng PRJNA19263 Aspergillus niger CBS 513.88 100 AM270052.1 Aspergillus niger contig An03c0100 100 FJ345354.1 Paecilomyces variotii ATCC 10865 99 JN642222.1 Penicillium solitum 20-01 99 Kết sau phân tích genở bảng 3.30 hình 3.30 cho thấy chủng nấm HN18thể mức độ tương đồng cao trình tự nucleotit đoạn gen 28S rARN K16 70Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh so với lồiA nigerlà 100% Như khẳngđịnh chủng HN18 thuộc loàiA niger, ký hiệu A niger HN18 3.5 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH NẤM MỐC VÀ VI KHUẨN HIẾU KHÍTRONG KHƠNG KHÍ MƠI TRƢỜNG LAO ĐỘNG Từ kết nghiên cứu trên, xây dựng quy trình phân tích nấm mốc vi khuẩn hiếu khí khơng khí mơi trường lao động Thu mẫu khơng khí Thiết bị thu mẫu: UIL Spin AIR Vận tốc: 100 l/ phút Nhiệt độ: phòng Vận chuyển mẫu mẫu Thiết bị kín, vơ trùng Nhiệt độ: oC Ni nấm mốc Môi trường: Sabouraund Nhiệt độ: 28 ± 0,5 oC Nhân ni đĩa thạch Thời gian: ÷ ngày Ni vi khuẩn hiếu khí Mơi trường: MacConkey; thạch máu Nhiệt độ: 37 ± 0,5 oC Nhân nuôi đĩa thạch Thời gian: ÷ ngày Xác định số lượng nấm Đếm khuẩn lạc đĩa thạch Petri Xác định vi khuẩn hiếu khí Đếm khuẩn lạc đĩa thạch Petri Nhận dạng loại chủng nấm Các đặc điểm điển hình Nhận dạng loại vi khuẩn Các đặc điểm điển hình Hình 3.31.Quy trình phân tích nấm mốc vi khuẩn hiếu khí khơng khí mơi trường lao động Mơ tả chi tiết quy trình phân tích nấm mốc vi khuẩn hiếu khí khơng khí mơi trường lao động: K16 71Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh Bước 1:Thu mẫu khơng khí: Thiết bị thu mẫu: UIL spin AIR Vận tốc: 100 l/ phút nhiệt độ: phòng Bước 2:Vận chuyển mẫu mẫu: thiết bị kín, vơ trùng; điều kiện nhiệt độ oC Bước 3:Nhân ni vi sinh vật khơng khí + Nuôi nấm mốc: Môi trường nuôi Sabouraud, nhân nuôi đĩa thạch, điều kiện nhiệt độ: 28 ± 0,5 oC, thời gian ÷ ngày + Ni vi khuẩn hiếu khí: Mơi trường ni MacConkey; thạch máu; nhân nuôi đĩa thạch, điều kiện nhiệt độ: 37 ± 0,5 oC, thời gian ÷ ngày Bước 4:Xác định số lượng tổng nấm vi khuẩn hiếu khí tổng số phương pháp đếm khuẩn lạc đĩa thạch Petri Bước 5: Nhận dạng chủng nấm mốc vi khuẩn hiếu khí đặc trưng khơng khí KẾT LUẬN K16 72Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh Đã khảo sát chọn môi trường nghiên cứu MacConkey thạch máu cho TVKHK, môi trường Sabouraud cho tổng nấm Dùng môi trường cứng để lấy mẫu trực tiếp thiết bị hút với tốc độ 100 lít/phút Đã khảo sátđánh giá chứng minh độ xác phương pháp xácđịnh độ lệch chuẩn độ tái lặp cho kết quả, phương pháp hút trực tiếp Sr 0,041 CV % 1,53 với lượng mẫu khơng khí lấy 100 lít mơi trường MacConkey Với mơi trường thạch máu cần phải lấy 200 lít khơng khí mẫu, cho độ xác tốt nhất, có Sr 0,120 Quan trắc nấm môi trường Sabouraud cho độ lệch chuẩn tốt lượng mẫu 50 ÷ 100 lít có Sr 0,036 0,048 CV %: 1,31 1,78 Đã xácđịnh độ khơng đảm bảođo quy trình phân tích TVKHK tổng nấm khơng khí phương pháp hút trực tiếp với thiết bị hút tốc độ 100 lít/phút TVNHK U % (4,25) tổng nấm U % (4,94) Đã quan trắc mơi trường mùa nóng mùa lạnh công ty sản xuất thứcăn gia súc, kết thu tổng nấm TVKHK số vị trí sản xuấtđã vượt tiêu chuẩn so sánh, điều kiện môi trường làm việc chưa đảm bảo cho người lao động Đã đánh giá chất lượng mơi trường khơng khí khu vực có người lao động làm việc Công ty Proconco sở Hà Nội, Hưng Yên Hải Phòng, thực quan trắc vị trí ngun liệu, phối trộn, đóng gói thành phẩm, kho vận, tổng số lượng mẫu quan trắc81 mẫu khơng khí Kết quan trắc xác định mật độ nấm mốc, vi khuẩn hiếu khí khơng khí dao động từ 1,2.102 ÷ 2,1.103 CFU/m3 khơng khí Các loại vi sinh vật xác định Bacillus sp., Penicillium sp., Aspergillus sp., Staphycoccus sp Cụ thể nghiên cứu xác định chủng B subtilis(1,95.102) chiếm 7,9 %, A flavus (3,37.102 CFU/m3) chiếm xấp xỉ 16 %, A niger(4,8.102 CFU/m3) chiếm 23 %, A parasiticus(2,0.102 CFU/m3) chiếm 10 %, Penicillium sp chiếm 8,5 % số vi sinh vật thu Đã xây dựng quy trình phân tích nấm mốc vi khuẩn hiếu khí khơng khí mơi trường lao động, dùng kỹ thuật lấy mẫu thiết bị hút trực tiếp dùng kỹ thuật sinh học phân tử để phân lập, định danh đến lồi vi sinh vật có mặt khơng khí mơi trường lao động TÀI LIỆU THAM KHẢO K16 73Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh Tài liệu tiếng Việt Từ Hải Bằng, Hoàng Thị Nghĩa, Đàm Thương Thương, Nguyễn Quỳnh Mai, (2003) "Bước đầu đánh giá chất lượng khơng khí mặt vi sinh phịng thí nghiệm vi sinh” Hội nghị khoa học quốc tế y học Lao động, Sức khỏe môi trường lần thứ (11/2003), Viện Y học lao động Vệ sinh môi trường Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập II, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đồn Xn Mượu (1978) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập III, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Lý Thị Thanh Hà, Phạm Đức Ngọc, Phạm Văn Ty (2007) Nghiên cứu nấm mốc phân giải chitin phân lập từ vườn quốc gia Tam Đảo Tạp chí Di truyền học ứng dụng, 2, 523-529 Nguyễn Thị Hà (2012) Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng Aspergillus protuberus sinh tổng hợp enzyme chitinase phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 22b, 26-35 Trịnh Quỳnh Mai, Nguyễn Thanh Thủy, Trần Quang Bình, Phan Trọng Lân, (2010) "So sánh kết phát vi sinh vật khơng khí phương pháp đặt đĩa thạch sử dụng máy hút mẫu khơng khí", Tạp chí Y học dự phịng, XX, 5(113), 106-110 NguyễnĐinh Nga (2012) Khảo sát mức độ nhiễm nấm mốc alflatoxin số dược liệu bánở quận - thành phố Hồ Chí Minh Nghiên cứu Y học Y học TP Hồ Chí Minh, 16(1), 93-96 Trần Cao Sơn (2010) “Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Đào Thiện, Trần Thanh Hịa, Nguyễn Thị Bích Thủy, Trần Thị Lan Hương (2012) Mơ hình hóa với loại nấm mốc Tạp chí Khoa học Phát triển 10(5), 792-797 K16 74Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh 10 Nguyễn Quốc Tuấn(2009) Đề tài "Khảo sát ô nhiễm vi sinh khơng khí phịng phẫu thuật, phịng hồi sức số bệnh viện thành phố hồ chí minh", Viện Vệ sinh - Y tế công cộng thành phố Hồ Chí Minh 11 Đỗ Thị Phương Xuân, Trần Thị Hạnh Tiên, Lê Thị Ngọc Huệ (2011) “Khảo sát độ nhiễm nấm mốc khơng khí phịng việc không dùng máy lạnh trường học quận Bình Thạnh, thành phố Hồ Chí Minh Nghiên cứu Y học - Y học TP Hồ Chí Minh, 15(1), 93 - 96 Tài liệu tiếng nƣớc 12 Ahmad Sayuti Zainal Abidin, A.M Leman, Nor MorhRazif Noraini, M.D Amir Abdullah (2013) “Comparative Study on Airbone Microbe in Different Phases of Building Commissioning for Indoor Air Quality Improvement” ARPN Journal of Science and technology, 3(6) 13 Bean T Chen, Gregory A Feather, Andrew Maynard and Carol Y Rao (2004), “Development of a Personal Sampler for Collecting Fungal Spores” Aerosol Science and Technology, 38,926-937 14 Biology Hazard (2012) Safety Institute of Australia Ltd 15 Dong-Uk Park, Jeong-Kwan Yeom, Won Jae Lee and Kyeong-Min Lee(2013) “Assessment of the Levels of Airborne Bacteria, Gram-Negative Bacteria, and Fungi in Hospital Lobbies” International Journal of Environmental Research and Public Health, 10, 541-555 16 ISO 8199:2005 (E) Water quality - General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture 17 Gina M Solomon,1,2 Mervi Hjelmroos-Koski,3 Miriam Rotkin-Ellman,1,4 and S Katharine Hammond (2006) “Airborne Mold and Endotoxin Concentrations in New Orleans, Louisiana, after Flooding, October through November 2005” Environmental Health Perspectives,114(9),1381-1386 18 Jim Deacon, (2000) “The microbial world Airborne Microorganisms Institute of Cell and Molecular Biology, the University of Edinburgh 19 Jyotshna Mandal and Helmut Brandl (2011) "Bioaerosols in Indoor Environment - A Review with Special Reference to Residential and Occupational Locations ", The Open Environmental & Biological Monitoring Journal, 4, 83-96 K16 75Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh 20 John G Holt, Noel R Krieg, Peter H A Sneath, James T Staley and Stanley T Wiliams (1986) Bergey’s manual of Systematic Bacteriology, 9th Edition, 21 Kathleen Hess-Kosa (2011) “Indoor Air Quality: The Latest Sampling and Analytical Methods CRC Press Taylor & Francis Group Second Edition © 2011 by Taylor & Francis Group, LLC 22 Ki Youn Kima, Han Jong Kob, Hyeon Tae Kimb, Chi Nyon Kimc, Yoon Shin Kima (2008) “Assessment of airborne bacteria and fungi in pig buildings in Korea” Biosystems engineering, 99, 565-572 23 K.Naga Madhan Mohan1, S.Ramprasad, Y.A.Maruthi (2014) “Microbiological air quality of indoors in primary and secondary schools of Visakhapatnam, India” International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences,3(8), 880-887 24 Laura Gjyli, Pirro Prifti, Lindita Mukli, Silvana Gjyli, Irida Ikonomi, Jerina Kolitari (2011) “Microbiological Contamination of Outdoor Air in Marine Durres’s Harbour, Albania World Academy of Science, Engineering and Technology ,76, 815-820 25 M.F Yassin; S Almouqate (2010) “Assessment of airborne bacteria and fungi in an indoor and outdoor environment Int J.Environ, Sci Tech,7(3), 535544 26 Mark P Buttner and Linda D Stetzenbach (1993) “Monitoring Airborne Fungal Spores in an Experimental Indoor Enviroment to Evalute sampling methods and the effects of Human Activity on Air Sampling Applied and Enviromental Microbiology, 219-226 27 Olivier Le Goff, Jean-Jacques Godon, Kim Milferstedt, Hélène Bacheley, JeanPhilippe Steyer,Nathalie Wéry (2012) “A new combination of microbial indicators for monitoring Environment, 61, 428 - 433 composting bioaerosols” Atmospheric 28 Paul A Jensen, PhD., PE, CIH and Millie P Schafer (1998) "Sampling and Characterization of bioaerosol" NIOSH Manual of Analytical Methods 29 K16 Pipat Luksamijarulkul MSc, Yuwadee Ratthanakhot MSc, Pisit Vatanasomboon MSc (2012) “Microbial Counts and Particulate Matter Levels in Indoor Air Samples Collected from a Child Home-Care Center in Bangkok, Thailand”J Med Assoc Thai, 95(Suppl.6), S161-S168 76Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh 30 Roger H Williams, Elaine Ward and H Alastair Mccartney (2001) “Methods for Integrated Air Sampling and DNA Analysis for Detection of Airborne Fungal Spores”Applied and Environmental Microbiology, 2453-2459 31 Sambrook J and Russell D.W (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 32 Stella Manchun Tsai, Chin S Yang, Michael S Crandall (2001) “Measurements of Airborne Fungal and Endotoxin Levels in Water-Damaged Buildings” IndoorAir Quality 33 Zhiguo Fang, Chanjuan Gong, Zhiyun Ouyang, Peng Liu, Li Sun, Xiaoyong Wang (2014) “Characteristic and Concentration Distribution of Culturable Airborne Bacteria inResidential Environments in Beijing, China” Aerosol and Air Quality Research, 14, 943-953 34 Verschuere L., Rombaut G., Sorgeloos P and Verstraete W (2000) Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture Microbiology & Molecular Biology Reviews, 64, 655-671 35 Wan-kuen Jo, Young-Jun Seo (2005) “Indoor and outdoor bioaerosol levels at recreationfacilities, elementary schools, and homes” Chemosphere 61, 15701579 36 WHO (2009) Who guidelines for indoor air quality: Dampness and mould, ISBN 978 92 890 4168 K16 77Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn Thạc sĩ sinh học Vũ Duy Thanh DANH MỤCCÔNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN 1.Vũ Duy Thanh, Lê Anh Thư, Nguyễn Thế Trang (2014) Nghiên cứu đánh giá có mặt nấm mốc vi khuẩn hiếu khí khơng khí sở sản xuất thức ăn gia súc Tạp chí Khoa họcĐHQGHN, Khoa học tự nhiên Công nghệ.Tập 30 Số 6S, trang 150 - 157 K16 78Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật ... nhiễm mặt sinh học khơng khí Vì vi? ??c ? ?Nghiên cứu xây dựng quy trình đánh giá có mặt nấm mốc vi khuẩn hiếu khí khơng khí mơi trường lao động? ?? nhiệm vụ cần thiết phục vụ quan trắc môi trường lao động. .. sở lý luận vi? ??c nghiên cứu có mặt nấm vi khuẩn hiếu khí khơng khí mơi trường lao động - Đưa quy trình phân tích tổng vi khuẩn hiếu khí tổng nấm khơng khí mơi trường lao động K16 3Vi? ??n Sinh thái... dựng quy trình đánh giá có mặt nấm mốc vi khuẩn hiếu khí khơng khí mơi trường lao động? ??, với mục tiêu nội dung sau đây: Mục tiêu đề tài luận văn: - Đánh giá tổng vi khuẩn hiếu khí tổng nấm mơi trường