Tình hình nhiễm nấm mốc trong một số dược liệu dạng quả đang lưu hành ở quận 5 - Tp. Hồ Chí Minh

NTTU-NCKH-04 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH BÁO CÁO TÔNG KẾT ĐÈ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP co SỞ NĂM 2020 - 2021 Tên đề tài: Tình hình nhiềm nấm mốc số dược liệu dạng lưu hành quận - Tp Hồ Chí Minh Số hợp đồng: Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Quang Hạnh Thư Đơn vị công tác: Khoa Kỳ thuật xét nghiệm y học Thời gian thực hiện: 01/2021 - 09/2021 TP Hồ Chỉ Minh, ngày 20 thảng 08 năm 2021 MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT iii DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH iv TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cứu .V MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU I VÁN ĐÈ DƯỢC LIỆU NHIỀM NÁM II CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN Nghiên cứu nước Nghiên cứu nước III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu XÁC ĐỊNH MÚC ĐỘ NHIÊM NÁM DƯỢC LIỆU CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 13 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN cứu 13 NỘI DUNG NGHIÊN CÚƯ 13 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 13 3.1 Xác định độ ẩm phương pháp sấy khô 13 3.2 Phương pháp trải đếm đìa thạch .14 3.3 Định danh nấm mốc phương pháp hình thái học 15 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THAO LUẬN 18 THU MUA DƯỢC LIỆU 18 ĐỘ ẤM CỦA DƯỢC LIỆU 19 MỨC ĐỘ NHIỄM VI NẤM CỦA DƯỢC LIỆU 22 XÁC ĐỊNH VI NẤM NHIỄM TRONG DƯỢC LIỆU 24 MỘT SỐ ĐỀ XUẤT VÈ CHẾ BIÉN - BAO QUẢN - sử DỤNG DƯỢC LIỆU HIỆU QUẢ 28 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 1 KÉT LUẬN 30 KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHAO V PHỤ LỤC 1: (Sản phẩm đăng kí) vii PHỤ LỤC 2: (Thuyết minh đề cương) xiii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỪ VIẾT TẤT AFPA Aspergillus flavus and parasiticus Agar CCA Coconut Cream Agar CDA Czapek Dox Agar CFU Colony Form Units CYA Czapek Yeast extract Agar DĐVN V Dược dien Việt Nam V ELISA Enzyme - linked immunosorbent assay GDP Good Distribution Practices GYA Glucose Yeast extract Agar GSP Good Storage Practices HPLC High Performance Liquid Chromatography MPN Most Probable Number PCA Potato Carrot Agar (Thạch cà rot khoai tây( PDA Potato Dextrose Agar (Thạch khoai tây đường) SDA Sabouraud Dextrose Agar TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh DANH MỤC CÁC BẢNG BIẺU, sơ ĐỒ, HÌNH ẢNH Trang Bảng 2.1 Giới hạn độ ẩm loại dược liệu theoDĐVN V 12 Bảng 3.1 Ghi nhận thông tin cửa hàng khảo sát 16 Bảng 3.2 Độ ẩm mẫu dược liệu khảo sát 17 Bảng 3.3 Phân loại mức độ nhiễm vi nấm dược liệu 18 Bảng 3.4 Mức độ nhiễm vi nấm dược liệu 19 Bảng 3.5 Phân bố chi nấm dược liệu 20 Bảng 3.6 Các chi nấm cụ the nhiễm mầu dược liệu khảo sát 21 Hình 2.1 Mơ hình phương pháp đếm trải đĩa thạch 13 Hình 2.2 Quy trình tinh định danh hình thái nấm mốc 14 TÓM TÁT KÉT QUẢ NGHIÊN cúu STT Kết đạt Công việc thực Thu mua dược liệu Thu mua 58 mẫu cùa loại dược liệu dạng thường dùng gồm mầu câu kỷ tử, mầu hắc kỷ tử, mẫu ngũ vị từ, mẫu đại táo, mẫu táo mèo, mẫu nhàu, mầu long nhãn mầu sơn thù Xác định độ âm Xác định 20 mẩu dược liệu vượt giới dược liệu hạn độ ẩm theo quy định cùa DĐVN V Xác định mức độ Xác định 21 mẫu dược liệu có mức độ nhiễm vi nấm dược nhiễm vi nấm vượt 500 CFU/g liệu Định danh vi nấm Xác định 35 mẫu nhiễm nấm men, 38 mẫu dược liệu nhiễm nấm mốc, có 25 mẫu nhiễm đồng thời nấm men nấm mốc Nấm men xuất nhiều dược liệu dạng quả, mọng/cơm dày khó phơi sấy khơ hồn tồn Các chi nấm mốc phổ biến gồm Aspergillus, Penicillium, Mucor/ Rhizopus sô chi nấm sợi màu STT Sản phẩm đăng ký Sản phẩm đạt Bài báo tạp chí khoa học có số ISSN Đã gửi cho Tạp chí khoa học cơng nghệ NTTU Thời gian thực hiện: 01/2021 - 09/2021 Thời gian nộp báo cáo: 08/2021 MỞ ĐẦU Dược liệu người dân Việt Nam sử dụng nhiều đời việc phòng điều trị bệnh Nhưng dược liệu lại môi trường cung cấp dinh dưỡng thuận lợi cho vi nấm dễ dàng phát triển, đặc biệt điều kiện khí hậu nóng ẩm Việt Nam - khu vực miền Nam Việt Nam Đe có nguồn dược liệu an tồn sử dụng, cần kiếm sốt tốt trình trồng trọt, thu hái, chế biến, bảo quản sử dụng dược liệu Hiện nay, người dân có xu hướng tin dùng dược liệu đe bồi dưỡng sức khỏe sắc đẹp (gà vịt tiềm thuốc bắc, chè dưỡng nhan, trà hoa cúc ) phòng/điều trị dạng bệnh mạn tính Do đó, việc khảo sát tình hình nhiễm nấm dược liệu số sở bán lẻ dược liệu điều cần thiết Các tiêu liên quan đến vi nấm gồm mức độ nhiễm nấm hệ nấm mốc dược liệu Các nghiên cứu tiến hành đánh giá thêm độ ấm cùa mầu yếu tố ảnh hưởng nhiều đến chất lượng dược liệu, ảnh hưởng đến mức độ nhiễm nấm Thường dược liệu từ quả, mọng, có độ ẩm cao phận dùng khác hạt, lá, thân, rễ nên nguy nhiễm nấm sè cao Do đó, cần lưu ý việc chế biến, bảo quản dược liệu từ đe đảm bảo chất lượng nguồn dược liệu Định danh nấm mốc dược liệu chù yếu phương pháp hình thái học để xác định đến tên Chi Các chi nấm phổ biến Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor/Rhizopus sp có đặc điểm khóm nấm đặc điểm hiển vi điển hình, dễ dàng quan sát phân biệt Nuôi cấy vi nấm môi trường thông thường PDA, CZA, AFPA đe quan sát màu sắc hình thái khóm nấm; mơi trường CCA, GYA đánh giá khả sinh độc tố vi nấm dựa vào sắc tố vàng cam khóm nấm tiết phát huỳnh quang quanh khóm nấm điều kiện ƯV 365 nm để có thêm thơng tin định danh Đe quan sát hiển vi, xé sợi nấm lam kính ni cấy vi nấm trực tiếp lam sử dụng phương pháp cờ băng keo đe lấy cấu trúc sợi nấm nhuộm thuốc nhuộm Lactophenol cotton blue (LPCB) để soi kính Dựa vào sở trên, nghiên cứu chọn loại dược liệu dạng thường sử dụng từ sở bán lẻ quận - TP.HCM để khảo sát tình hình nhiễm vi nấm, gồm: (1) câu kỷ tử, (2) hắc kỷ tử, (3) ngũ vị tử, (4) long nhãn, (5) đại táo, (6) táo mèo, (7) sơn thù, (8) nhàu Các phương pháp lựa chọn gồm xác định độ nhiễm vi nấm phương pháp trải đếm, xác định độ ẩm phương pháp sấy khô định danh nấm mốc phương pháp hình thái phương pháp nhiều tác giả/nhóm tác giả lựa chọn hướng dần tài liệu quan/tổ chức/tác giả uy tín CHƯƠNG TĨNG QUAN TÀI LIỆU I VẤN ĐỀ DƯỢC LIỆU NHIỄM NẤM Nhiễm vi sinh vật (vi khuẩn, vi nấm ) điều tránh khỏi trình chế biến bảo quản dược liệu Các vi sinh vật từ mơi trường ngoại cảnh (đất trồng, nước rửa, khơng khí ) từ tay người lao động rơi vào dược liệu trình thu hoạch, cắt nhỏ, phơi sấy, đóng gói Thơng thường, dược liệu chế biến đạt yêu cầu tác nhân tồn lượng nhỏ sản phẩm không sinh sôi nên không gây hại cho người sử dụng Khi dược liệu chế biến bảo quản không cách có the làm vi khuấn, vi nấm sinh sôi gây thẩm mỹ gây hại cho người sử dụng Đa phần dược liệu thông thường phơi sấy đe làm khô nhằm dễ dàng bảo quản thời gian kéo dài, vậy, phơi sấy dược liệu trực tiếp đất cát, khơng có vật che chắn đoi với dược liệu chất có hàm lượng nước, đường cao thời gian phơi sấy kéo dài - điều kiện mà bụi bấn vi sinh vật xâm nhập làm hư hại dược liệu, số sở bán lẻ, dược liệu trưng bày mà khơng có dụng cụ che chắn, bảo vệ, sử dụng tay trần đe bốc thuốc dần đến tình trạng nhiễm bụi bấn, vi sinh vật từ ngoại cảnh tay người bán Thậm chí, tâm lý tiếc rẻ, số trường hợp xử lý lại dược liệu bị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm cách rửa sạch, cắt gọt chồ hư, phơi sấy lại để bán sử dụng Ngoài ra, để tăng thời gian hiệu bảo quản, dược liệu ướp chất bảo quản nồng độ cao, nhuộm đe tăng cảm quan, xông lưu huỳnh dư lượng thuốc bảo vệ thực vật q trình ni trồng dược liệu Do đó, tình trạng lạm dụng sử dụng hóa chất khơng phù hợp gây biến chất dược liệu nên gây hại cho người sử dụng Bên cạnh đó, số nấm mốc có khả tiết độc tố aflatoxin Aspergillus flavus A.parasiticus sản xuất có the gây nhiễm độc dược liệu nguyên nhân gây ton thương gan gia tăng tỉ lệ ung thư gan O châu Á nói chung Việt Nam nói riêng, dược liệu hay vị thuốc đông y sử dụng từ lâu đời với mục đích bồi dường the, phòng điều trị bệnh Gần đây, việc sử dụng dược liệu đời sống ngày phổ biến gia tăng Người dân bổ sung dược liệu vào ăn hàng ngày nhằm bồi dưỡng sức khỏe sắc đẹp Các dạng dược liệu đóng gói trao đổi bn bán dề dàng dạng thực phẩm dạng loại trà uống (như hoa cúc, hắc kỉ tử), chè dường nhan, gà vịt tiềm thuốc bắc Vì vậy, vấn đề việc sử dụng dược liệu an toàn hiệu quan tâm nhiều hơn, đồng thời chất lượng dược liệu tiêu chuẩn hóa theo hướng dần Dược điển Việt Nam V, tiêu chuẩn quốc gia Các quy trình chế biến, bảo quản ảnh hưởng nhiều đến chất lượng dược liệu, tiêu vi sinh vật nói chung tiêu vi nấm nói riêng Đặc biệt, khí hậu Việt Nam, đặc biệt miền nam Việt Nam thường nóng ẩm điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển gây hư hại, nhiễm độc dược liệu Đặc biệt, dược liệu có phận dùng quả, dạng mọng hàm lượng đường cao thường có độ ẩm cao phận khác hạt, lá, thân, rề thời gian phơi sấy kéo dài Đây yếu tố khiến dược liệu dạng dễ nhiễm vi nấm hơn, trình chế biến, bảo quản lưu trừ khơng đảm bảo Do đó, việc xác định mức độ nhiễm vi nấm dược liệu, dược liệu dạng quả, cần thiết đe đảm bảo an tồn sử dụng góp phần đánh giá công tác bảo quản, chế biến dược liệu II CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN Nghiên cứu ngồi nước Trên giới, có số nghiên cứu mức nhiễm nấm dược liệu, loại thuốc, gia vị đặc trưng cho khu vực, quốc gia Nhóm nghiên cứu Adriana Bugno cộng (2006) tiến hành xác định mức độ nhiễm nấm cùa 65 mầu dược liệu gia vị Sao Paulo, Brazil phương pháp đếm trải môi trường Sabouraud Dextrose Agar (SDA) bo sung cloramphenicol với dung dịch pha loãng dung dịch đệm - pepton Ket cho thấy 54,9% mầu thử vượt tiêu tổng số vi nấm theo quy định Dược điển Mỹ - không 200 cfu/g Dược liệu từ thân lá, phần mặt đất có độ nhiễm nấm cao dược liệu từ hoa, rễ rễ giả, vỏ thân hạt Định danh dựa vào hình thái mơi trường thạch PDA (potato dextrose agar) định tính khả sinh aflatoxin môi trường CAM (coconut agar medium) cho thấy vi nấm phổ biến Aspergillus sp Penicillium sp [1] Tương tự vậy, năm 2017, Lucia Keter cộng tiến hành khảo sát mức độ nhiễm vi nấm sinh độc tố sản phẩm thuốc từ dược liệu theo hướng dẫn Dược dien Mỹ WHO Phương pháp đem pháp thường dùng ELISA, HPLC sử dụng cột sắc kí lực miễn dịch, LC-MS/MS Đây phương pháp đại, độ nhạy cao giá thành cao gây hạn chế tiến hành với số lượng mầu thử lớn Do đó, điều kiện hạn chế, số nghiên cứu ly trích vi nấm từ dược liệu đe định tính khả sinh aflatoxin môi trường CCA, GYA giúp góp phần đánh giá nguy nhiễm aflatoxin dược liệu Tài liệu tham khảo (Tên cơng trình, tác giá, nơi năm công bố, nêu danh mục trích dần để luận giải cho cần thiết nghiên cứu đề tài, liệt kê danh mục cơng trình nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tài trích dan đánh giả tong quan) [1] A Bugno, ABA Almodovar, TC Pereira et al (2006) Occurrence of toxigenic fungi in herbal drugs Brazillian Journal of Microbiology, 37, 47-51 [2] L Keter, R Too, N Mwikwabe et al (2017) Risk of fungi associated with aflatoxin and fumonisin in medicinal herbal products in the Kenyan market The sicentific World Journal, Vol 2017, 1-7 [3] p Singh, B Serivastava, A Kumar, NK Dubey (2008) Fungal contaimination of raw meterials of some herbal drugs and recommendation of Cinnamomum camphora oil as herbal fungitoxicant Microb Ecol, 56, 555-560 [4] H Chandra, p Kumari, s Yadav (2019) Evaluation of aflatoxin contamination in crude medicinal plants used for the preparation of herbal medicine Oriental Pharmacy and Experimental Medicine, 19, 137-143 [5] FC Freire, z Kozakiewicz, RR Paterson (2000) Mycoflora and mycotoxins in Brazilian black pepper, white pepper and Brazil nuts Mycopathologia, 149, 13 - 19 [6] AE Elshafie, TA Al-Rashdi, SN Al-Bahry and cs Bakheit (2002) Fungi and aflatoxin associated with spices in the Sultanate of Oman Mycopathologia, 155, 155 160 [7] ỌA Mandeel (2005) Fungal contamination of some imported spices Mycopathologia, 159, 291-298 [8] NA Siddque, M Mujeeb, s Ahmad et al (2013) Determination of aflatoxin in medicinal plants by high-performance liquid chromatography-Tandem Mass Spectrometry JPharm Pharm Sci, 16 (2), 321-330 [9] Lin MT, Dianese JC (1976) A coconut - agar medium for rapid detection of aflatoxin produciton of Aspergillus spp Phytopathology, 66, 1466-1469 [10] Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Thị Kiều Khanh, Văn Phố (2012) Khảo sát mức độ nhiễm nấm mốc aflatoxin số dược liệu bán Quận - Tp Hồ Chí Minh Tạp chí Yhọc TP.HCM, 16(1), 93-96 [11] Vũ Thị Hương, Đào Thị Hương, Nguyễn Thùy Châu (2011) Đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc độc to aflatoxin B1 so nông sản giai đoạn bảo quản Việt Nam Tạp Nông nghiệp&Phát triến nông thôn, 21, 13-21 [12] Đặng Vũ Hồng Miên, Châu Ngọc Hải, Lâm Thanh Hiền, Từ Thị Hường (2011) Hệ nấm mốc hàm lượng ochratoxin A cà phê nhân (Coffea robusta') Việt Nam Tạp Sinh học, 33(3), 68-73 [13] Vũ Duy Thanh (2017) Nghiên cứu rủi ro người lao động tiếp xúc nấm mốc sinh độc tố không khí mơi trường lao động sở chế biến gạo Tạp hoạt động KHCN An toàn — Sức khỏe Môi trường lao động, 2017(4), 31-38 [14] ND Quan, NT Phuong, HA Tuan et al (2019) Determination of aflatoxin herbal medicines by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LCMS/MS) Journal of Medicinal Materials, 24(5), 308-314 [15] Bộ Y tế (2017) Dược điển Việt Nam V Nhà xuất Y học [16] Trần Linh Thước (2007) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹphẩm Nhà xuất Giáo dục, 65-66 10 Nội dung nghiên cứu khoa học, triển khai thực nghiệm phưong án thực Đối tượng nghiên cứu: Một số dược liệu bán TP.HCM Nội dung nghiên cứu: Tình hình nhiễm nấm dược liệu Phan A: Tổng quan, thuyết minh đề tài Dược liệu người dân Việt Nam sử dụng nhiều đời việc phòng điều trị bệnh Nhưng dược liệu lại môi trường cung cấp dinh dường thuận lợi cho vi nấm dễ dàng phát triển, đặc biệt điều kiện khí hậu nóng ấm Việt Nam - khu vực miền Nam Việt Nam Đe có nguồn dược liệu an tồn sử dụng, cần kiểm sốt tốt trình trồng trọt, thu hái, chế biến, bảo quản sử dụng dược liệu Hiện nay, người dân có xu hướng tin dùng dược liệu để bồi dường sức khỏe sắc đẹp (gà vịt tiềm thuốc bắc, chè dường nhan, trà hoa cúc ) phòng/điều trị dạng bệnh mạn tính Do đó, việc khảo sát tình hình nhiễm nấm dược liệu số sở bán lẻ dược liệu điều cần thiết Các tiêu liên quan đến vi nấm gồm mức độ nhiễm nấm hệ nấm mốc dược liệu Các nghiên cứu tiến hành đánh giá thêm độ ấm cùa mầu yếu tố ảnh hưởng nhiều đến chất lượng dược liệu, ảnh hưởng đến mức độ nhiễm nấm Thường dược liệu từ quả, mọng, sè có độ ẩm cao phận dùng khác hạt, lá, thân, rễ nên nguy nhiễm nấm cao Do đó, cần lưu ý việc chế biến, bảo quản dược liệu từ đe đảm bảo chất lượng nguồn dược liệu Định danh nấm mốc dược liệu chù yếu phương pháp hình thái học đe xác định đến tên Chi Các chi nấm phổ biến Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor/Rhizopus sp có đặc điểm khóm nấm đặc điểm hiển vi điển hình, dễ dàng quan sát phân biệt Nuôi cấy vi nấm môi trường thông thường PDA, CZA, AFPA đế quan sát màu sắc hỉnh thái cùa khóm nấm; mơi trường CCA, GYA đánh giá khả sinh độc tố vi nấm dựa vào sắc tố vàng cam khóm nấm tiết phát huỳnh quang quanh khóm nấm điều kiện uv 365 nm đe có thêm thơng tin định danh Đe quan sát hiển vi, có the xé sợi nấm lam kính ni cấy vi nấm trực tiếp lam sử dụng phương pháp cờ băng keo đe lấy cấu trúc sợi nấm nhuộm thuốc nhuộm Lactophenol cotton blue (LPCB) đe soi kính Dựa vào sở trên, nghiên cứu chọn loại dược liệu dạng thường sử dụng từ sở bán lẻ quận - TP.HCM để khảo sát tình hình nhiễm vi nấm, gồm: (1) câu kỉ tử, (2) hắc kỉ tử, (3) ngũ vị tử, (4) nhãn nhục, (5) đại táo, (6) táo mèo, (7) sơn thù, (8) nhàu Các phương pháp lựa chọn gồm xác định độ nhiễm vi nấm phương pháp trải đếm, xác định độ ẩm phương pháp sấy khô định danh nấm mốc phương pháp hình thái phương pháp nhiều tác giả/nhóm tác giả lựa chọn hướng dần tài liệu quan/tổ chức/tác giả uy tín Phần B: Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Thu mua dược liệu a b c Mục đích: - Thu mua dược liệu từ cửa hàng quận - TP.HCM Phương pháp nghiên cứu: - Lựa chọn dược liệu có phận dùng dạng - mọng phơi/sấy khô - Lựa chọn cửa hàng bán lẻ dược liệu chợ thuốc đông y quận - TP.HCM Sản phẩm dự kiến: - Danh mục dược liệu d Thời gian thực hiện: tháng (tháng 1/2021) Các công việc thực (Cần nêu rõ hoạt động bố trí thí nghiêm, tiêu khảo sát đảnh giả) - Dựa vào danh mục dược liệu liệt kê chuyên luận Dược liệu Dược điển Việt Nam V, lựa chọn loại dược liệu có phận dùng gồm: (1) Câu kỉ tử, (2) hắc kỉ tử, (3) câu kỉ tử, (4) nhãn nhục, (5) đại táo, (6) táo mèo, (7) sơn thù, (8) nhàu - Nhóm nghiên cứu tới trực tiếp cửa hàng để thu mua dược liệu trên, đồng thời, quan sát cách bảo quản, đóng gói cùa cửa hàng Yêu cầu cửa hàng đóng gói kín túi nilong với khối lượng 100g Nội dung 2: Xác định độ ấm dược liệu a Mục đích: - Xác định độ ấm dược liệu Phương pháp nghiên cứu: - Xác định độ ẩm dược liệu phương pháp sấy khô theo Dược dien Việt Nam V c Sản phẩm dự kiến: - Danh mục dược liệu đạt không đạt độ ẩm quy định theo Dược điển Việt Nam V d Thời gian thực hiện: tháng (tháng 1/2021) e Các công việc thực (Cần nêu rõ hoạt động bo trí thỉ nghiệm, tiêu kháo sát đảnh giá) - Xác định độ ấm dược liệu phương pháp sấy khô b ■ Cân - 10 g dược liệu, làm nhỏ dược liệu thành mảnh không mm ■ Dàn mỏng dược liệu vật chứa, chiều dày lớp mẫu thử không mm ■ Sấy đến khối lượng không đối, tức chênh lệch khối lượng sau sấy thêm Ih so với lần sấy trước khơng q mg Nhiệt độ sấy theo quy định chuyên luận riêng Bảng Khối lượng cân, điều kiện sấy yêu cầu độ ẩm dược liệu Khối lượng cân Điều kiện sấy Câu kỷ tử 2g 80°C/5h Không 13% Hắc kỷ tử 2g 80°C/5h Không 13% Ngũ vị tử X X Không 13% 1g 100°C/4h Không 15% Đại táo X X Không 13% Táo mèo X X Sơn thù 2g 105°C/5h Không 16% Nhàu g 105°C/4h Không 12% Dược • liệu • Nhãn nhục Yêu cầu X Nội dung 3: Xác định mức độ nhiễm vi nấm dược liệu a Mục đích: - Xác định mức độ nhiễm vi nấm dược liệu b Phương pháp nghiên cứu: - Xác định giới hạn nhiễm vi nấm dược liệu theo phương pháp trải đếm đìa thạch hướng dẫn phụ lục 13.6 cùa Dược điển Việt Nam V Sản phẩm dự kiến: - Danh mục dược liệu đạt không đạt giới hạn nhiễm vi nấm theo tiêu chuẩn c d quy định phụ lục 13.6 Dược điển Việt Nam V Thời gian thực hiện: tháng (từ tháng 2/2021 đến tháng 3/2021) e Các công việc thực (Cần nêu rõ hoạt động bổ trí thỉ nghiệm, tiêu kháo sát đảnh giá) - Dược liệu lắc trộn kì với dung dịch đệm natri clorid - pepton pH7 15 phút, sau tiếp tục pha loãng nhiều lần với hệ số pha loãng 10 lần SDA - chloramphenicol (50mg/L) SDA - chloramphenicol (50mg/L) Hình MƠ hình phương pháp đếm trải đìa thạch ■ Cân 10g dược liệu, lắc trộn kĩ với 90 ml dung dịch đệm natri clorid - pepton pH dung dịch ■ Hút ml dung dịch vào ống nghiệm chứa ml dung dịch đệm natri clorid pepton pH dung dịch ■ Hút ml dung dịch vào ống nghiệm chứa ml dung dịch đệm natri clorid - pepton pH dung dịch Tiếp tục đe đạt độ pha loãng phù hợp - Hút 0,1 ml dung dịch pha loãng vào đĩa thạch SDA bổ sung cloramphenicol (50 mg/L), dùng que trang trải mặt thạch Thực với đĩa mồi nồng độ - ủ đìa 20 - 25°c theo dõi 5-7 ngày Chọn đĩa nồng độ pha loãng định mà nồng độ đó, số khuấn lạc thu cao nhỏ 50 de dem tong số nấm Tính giá trình trung bình tính số CFƯ/lg dược liệu Cơng thức tính: CFU vi nấm/ Ig dược liệu = £Ci X 10/(n.d) với Cị - số khuẩn lạc đếm đìa thạch nồng độ pha lỗng chọn n - số đìa thạch nồng độ pha loãng chọn d - hệ số pha loãng - Thực tương tự với chứng âm dung dịch pha loãng dung dịch đệm natri clorid - pepton pH Các đĩa trải chứng âm khơng có vi nấm phát triến Nội dung 4: Định danh nấm mốc a Mục đích: - Định danh nấm mốc b Phương pháp nghiên cứu: - Định danh nấm mốc dược liệu phương pháp hình thái học Sản phẩm dự kiến: - Danh mục nấm mốc ly trích từ dược liệu Thời gian thực hiện: tháng (từ tháng 4/2021 đến tháng 9/2021) c d e Các công việc thực (Cần nêu rõ hoạt động bo trí thỉ nghiệm, tiêu kháo sát đảnh giá) - Tinh chủng ■ Thu khuẩn ty nấm mốc từ đìa SDA trải đếm chuyển khuẩn ty sang môi trường PDA bo sung cloramphenicol (50 mg/L), cấy chuyền nhiều lần đe tinh chủng ■ Chủng tinh lưu giữ dung dịch glycerol 20% 20 - 25°c - Định danh vi nấm phương pháp hình thái học: ni cấy vi nấm so môi trường điều kiện 20 - 25°c theo dõi phát triển vi nấm ngày Ghi nhận đặc điếm khóm nấm tốc độ tăng trưởng, bề mặt khóm, màu khóm, sắc tố, chất tiết Đe quan sát hiến vi, vi nấm xẻ sợi nuôi cấy trực tiếp lam dùng phương pháp cờ băng dính de lấy sợi nấm, sau nhuộm với thuốc nhuộm Lactophenol cotton blue (LPCB) Quan sát hiến vi ghi nhận đặc điểm sợi nấm (có/khơng có màu, có/khơng có vách ngăn, có sợi nấm đặc biệt/rễ giả không ), bào tử cấu trúc mang bào tử đặc trưng, cấu tử đặc biệt (tế bào Hull, the ) Định danh sơ vi nấm đến tên Chi phương pháp hình thái học dựa theo khóa phân loại G.s.de Hoog cs., TS Đặng Võ Hồng Miên Nghiên cứu lựa chọn số môi trường thông dụng gồm: - Môi trường PDA - Môi thường PC A (potato carrot agar) CYA (Czapek yeast extract agar) de thúc đẩy vi nấm sinh bào tử - Môi trường CDA định danh Aspergillus sp Penicillium sp - Môi trường AFPA để phân biệt A.flavus A.parasiticus dựa vào màu sắc khóm nấm - Môi trường CCA, GYA đe xác định A.parasỉtỉcus A.flavus có khả sản xuất độc to aflatoxin: Nuôi cấy vi môi trường CCA GYA, ủ đĩa 20 - 25°c 5-7 ngày Quan sát đĩa mắt thường ƯV 365 n m Neu đĩa xuất sắc tố vàng cam phát huỳnh quanh duới uv 365 nm vi nấm có khả sinh aflatoxin So sánh với chứng âm môi truờng CCA GYA chưa nuôi cấy vi nấm Phần C: Báo cáo tổng kết đề tài 11 Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng (Luận tiếp cận vẩn đề nghiên cứu, thiết kế nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng gắn với nội dung chỉnh đề tài; so sảnh với phương pháp giải tương tự khác phân tích đế làm rỗ tính mới, tỉnh độc đáo, tỉnh sáng tạo đề tài) 11.1 Cách tiếp cận: - Dựa thực tế: Trong nước khơng có nhiều nghiên cứu tình hình nhiễm nấm dược liệu mà chủ yếu thực thực phẩm đậu, gạo Trong đó, điều kiện nóng ấm TP.HCM điều kiện lý tưởng cho phát triển vi nấm, đong thời việc mua bán sử dụng dược liệu phổ biến dề dàng Do đó, báo cáo tình hình nhiễm nấm dược liệu điều cần thiết đe nâng cao ý thức sử dụng dược liệu người dân ý thức bảo quản/chế biến dược liệu sở sở bán buôn, bán lẻ Chọn lựa phưong pháp nghiên cứu dựa vào: - Tài liệu quy định Tiêu chuẩn Quốc gia, Dược điển Việt Nam V - Một số nghiên cứu/bài báo khoa học ngồi nước có nội dung liên quan 11.2 Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng: - Xác định độ ấm dược liệu phương pháp sấy khô theo Dược dien Việt Nam V - Xác định mức độ nhiễm nấm dược liệu phương pháp trải đếm đìa thạch tiêu chuẩn đánh giá theo quy định phụ lục 13.6 Dược dien Việt Nam V: dung dịch pha loãng mầu dung dịch đệm natri clorid - pepton pH 7, môi trường thạch SDA bổ sung cloramphenicol (50mg/L) dùng đe trải đếm - Định danh nấm mốc dược liệu phương pháp hình thái Phát lồi Aspergillus flavus A.parasiticus mơi trường CDA, AFPA, CCA, GYA 11.3 Tính mới, tính độc đáo, tính sáng tạo: Việc khảo sát tình hình nhiễm nấm dược liệu so sở bán lẻ dược liệu điều cần thiết góp phần nâng cao ý thức sử dụng dược liệu người dân ý thức bảo quản/chế biến dược liệu sở sở bán buôn, bán lẻ Các phương pháp sử dụng nghiên cứu phương pháp thường quy, dễ dàng thực rẻ tiền nên dễ áp dụng quy mô lớn 12 TT Tiến •độ thực đề tài • • Nội dung, công việc chủ yếu Nội dung 1: Thu mua dược liệu Kết phải đạt Thời gian Dược liệu 1/2021 Nội dung 2: Xác định độ ấm cùa Độ âm cùa dược liệu 1/2021 Danh mục dược liệu đạt không đạt giới hạn nhiễm nấm 2/2021 đến 3/2021 Danh mục nấm mốc ly trích từ dược liệu 4/2021 đến 9/2021 dược liệu Nội dung 3: Xác định mức độ nhiễm vi nấm dược liệu Nội dung 4: Định danh nấm mốc III SẢN PHAM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ, HIỆU QUẢ CỦA ĐỀ TÀI 13 Sản phẩm khoa học công nghệ đề tài TT Tên sản phẩm Đơn vị đo Bài báo tạp chí khoa học có số ISSN Bài Chất lượng sản phẩm Số lượng/ quy mô 14 Phạm vi địa (dự kiến) ứng dụng kết đề tài Phục vụ công tác nghiên cứu khoa học Khoa Kỹ thuật xét nghiệm Y học, Đại học Nguyễn Tất Thành 15 Tác động lọi ích mang lại kết nghiên cứu 15.1 Đối vói lĩnh vực KH&CN có liên quan (Nêu dự kiến đóng góp vào lĩnh vực khoa học cơng nghệ nước quốc tế) - Góp phần cung cấp tình hình nhiễm nấm dược liệu 15.2 Đối với tổ chức chủ trì sở úng dụng kết nghiên cứu - Tham gia mở rộng công tác nghiên cứu sở Tp Hồ Chỉ Minh, ngày thảng .năm 202 KHOA/VIỆN/PHÒNG/TRUNG TÂM CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI HIỆU TRƯỞNG TRƯỞNG PHÒNG TRƯỜNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA HOC CƠNG NGHỆ PHỤ LỤC 3: Hình thái hiên vi chủng nâm môc dược liệu khảo sát Cỉcidosporium sp Mucor sp Aspergillus sp Aspergillus sp A.niger Càu kỷ từ Cladosporium sp Penicíìlíum sp Vỉ in sẹi uiáu khác Đại táo Vi nẩm sợi màu Aspergillus fumigatus Son thù Cơ Sơ A Vi nấm sợi không màu Hắc kỹ tử A.niger Aspergillus sp Curvularia Câu kỹ tử Vi nấm sợi không màu Hắc kỹ từ Vi nám sợi không màu Nhàu CƠSỞB Cơ SỜH Curvularia Long nhăn Penicillium sp Aspergillus sp Vi nấm sợi không màu Ngũ v| từ Cảu kỹ từ Cladosporium sp Sơn thù Vi nâm sợi không màu Nhàu Cơ SỜC Aspergillus sp - Đại táo Aspergillus sp - Son thủ Cơ SỞ G Cladosporium sp Ngũ vị tử Penicillium sp vi nâm Vi nấm sợi màu Cladosporium sp Penicilliụm sp Nhàu Đại táo Peniciìlium sp Son thù Cơ SỜ E khịn? màu Cladosporiuni sp Aspergillus sp Mucor sp villi K) I IT Vi nấm sợi màu A.glaucus Ngũ vị từ Penicilliuni sp Aspergillus sp Nhàu Mucor sp A.niger - Long nhàn Cơ SỠ F Táo mèo Aspergillus sp A.funiigatus - Son thù Vi nẩm sợi không màu A.fumigatus - Đại táo Penicillũun sp - Nhàu Câu kỳ' tử PeniciUiunì sp Aspergillus sp A.niger Ngũ vị tử A.niger Vi nấm sợi không màu rá Rhizopus sp A.niger Long nhân Cơ SỞI Cỉadosporium sp - Long nhãn A.fumigatus A.niger Aspergillus sp Vi nâm sợi * màu Vi nầm sợi • khơng màu Sơn thù Cơ SỞI ... định 35 mẫu nhiễm nấm men, 38 mẫu dược liệu nhiễm nấm mốc, có 25 mẫu nhiễm đồng thời nấm men nấm mốc Nấm men xuất nhiều dược liệu dạng quả, mọng/cơm dày khó phơi sấy khơ hồn tồn Các chi nấm mốc. .. xông dược liệu nhằm tăng hiệu bảo quản XÁC ĐỊNH VI NẤM NHIỄM TRONG DƯỢC LIỆU Có 60% mầu dược liệu khảo sát nhiễm nấm men Trong 35 mẫu dược liệu nhiễm nấm men, có 10 mầu nhiễm nấm men không nhiễm. .. nghiệp&Phát triển nông thôn, 21,1 3-2 1 PHỤ LỤC 1: SẢN PHÁM ĐĂNG KÝ Tình hình nhiễm nấm mốc số dược liệu dạng lưu hành quận - Tp Hồ Chí Minh ThS Lê Quang Hạnh Thư*, ThS Từ Minh Thành Khoa Kỹ thuật xét nghiệm