Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu trích ly các hợp chất phenolic và đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa từ dịch chiết vỏ lụa hạt (Cashew Testa)

Một số công trình nghiên cứu về trích ly một số hoạt chất sinh học từ vỏ hạt điều, Chandrasekara và cộng sự đã chỉ ra rằng tổng hàm lượng phenolic TPC của vỏ lụa hạt điều đã qua quá trì

Mục tiêu đề tài

Đề tài được thực hiện với mục tiêu tìm ra điều kiện nghiên cứu trích ly các hợp chất phenolic và đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa từ dịch chiết vỏ lụa điều (Cashew testa) Mục tiêu cụ thể:

• Khảo sát được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các hợp chất phenolic, flavonoild từ vỏ lụa hạt điều: khảo sát dung môi, thời gian trích ly, nhiệt độ trích ly, tỷ lệ dung môi trích ly so với nguyên liệu

• Khảo sát được ảnh hưởng của phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng và siêu âm đến hiệu quả trích ly và lựa chọn được phương pháp trích ly phù hợp nhất.

Nội dung nghiên cứu

Đề tài gồm các nội dung khảo sát như sau:

• Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các hợp chất phenolic và flavonoid từ vỏ lụa hạt điều: khảo sát nồng độ dung môi, thời gian trích ly, nhiệt độ trích ly, tỷ lệ dung môi trích ly so với nguyên liệu

• Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng và siêu âm đến hiệu quả trích ly và lựa chọn được phương pháp trích ly phù hợp nhất.

Ý nghĩa khoa học

Kết quả của quá trình nghiên cứu trích ly các hợp chất phenolic và đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa từ dịch chiết vỏ lụa điều (Cashew testa) giúp đưa ra các dữ liệu là những đóng góp đáng tin cậy làm phong phú nguồn tư liệu khoa học về các hợp chất sinh học có trong vỏ lụa hạt điều, là nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất sinh học được trích ly từ vỏ lụa hạt điều.

Ý nghĩa thực tiễn

Các kết quả của quá trình trích ly thích hợp một số hoạt chất sinh học từ và khảo sát khả năng kháng oxy hóa từ dịch trích vỏ lụa hạt điều góp phần tạo cơ sở giúp cho các nghiên cứu sinh và các nhà sản xuất có thể tham khảo để khai thác các hợp chất sinh học từ vỏ lụa hạt điều Đồng thời, từ nghiên cứu này và và các nghiên cứu tiếp theo có thể ứng dụng các hoạt chất sinh học từ vỏ lụa hạt điều vào các sản phẩm khác dùng để nâng cao chất lượng sản phẩm cũng như thay thể một số hợp chất gia tăng thời gian sử dụng Các chiết xuất từ vỏ lụa hạt điều có giá trị và tiềm năng trong việc phát triển các loại thuốc điều trị chống viêm Ngoài ra, việc tận dụng vỏ lụa hạt điều giúp cho các doanh nghiệp giảm đi lượng phụ phẩm, tối ưu chi phí sản xuất và góp phần giảm tác động xấu đến môi trường

TỔNG QUAN

Giới thiệu chung về hạt điều

Hạt điều (Anacardium occidentale L.) là một loại cây trồng lấy hạt nhiệt đới có nguồn gốc từ Nam Mỹ [1] Đây là loại cây trồng lấy hạt nhiệt đới quan trọng, có tầm quan trọng về kinh tế và xã hội trên toàn thế giới và các quốc gia có diện tích trồng điều tương đối lớn trên thế giới bao gồm Ấn Độ, Brazil, Việt Nam, Cote d'Ivoire, Mozambique và Tanzania [8] Nó có ý nghĩa kinh tế xã hội quan trọng ở vùng Đông Bắc Brazil, chủ yếu là do khả năng thích ứng vượt trội với điều kiện đất đai và khí hậu của khu vực nhiệt đới ở châu Mỹ, châu Phi, châu Á và châu Úc Hơn nữa, nó đóng vai trò then chốt trong việc tạo cơ hội việc làm và tạo thu nhập cho người làm nông nghiệp ở nông thôn [9]

Quả điều là một loại quả giả, có gắn hạt ở đầu Quả điều khác nhau về hình dạng và màu sắc khi chín mọng nước, có vị chát Hạt điều là nguồn cung cấp polyphenol, vitamin và khoáng chất [10] Cây điều chủ yếu được trồng để lấy hạt Hạt điều là sản phẩm thương mại, có cấu trúc hình thận chỉ chiếm 10% tổng trọng lượng của sản phẩm điều thu hoạch Hạt điều chứa lượng chất dinh dưỡng cao hơn, hương vị dễ chịu và các đặc tính sinh học khác nhau mang lại nhiều giá trị thương phẩm Vỏ hạt điều là lớp vỏ cứng của hạt điều Lớp phủ không ăn được này bảo vệ hạt điều khỏi tác hại của môi trường Vỏ hạt điều chỉ chiếm 3%

5 tổng trọng lượng quả và có khả năng chống thoái hóa Vỏ hạt điều chứa dịch chiết vỏ, một chất lỏng màu nâu sẫm giàu hợp chất phenolic [11]

Sự kết hợp giữa quả và hạt này làm cho cây điều trở thành nguồn cung cấp nhiều sản phẩm và dẫn xuất có giá trị, trong đó hạt điều nổi lên là mặt hàng xuất khẩu chính Nhân điều chứa khoảng 50% lipid, 21% protein và 25% carbohydrate; hạt điều là nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng thiết yếu quý giá Hơn nữa, chúng còn là nguồn cung cấp chất xơ, vitamin như vitamin C và vitamin B phức hợp, cũng như các khoáng chất thiết yếu như Mg,

P và K Thành phần dinh dưỡng phong phú này mang lại đặc tính chống oxy hóa, chống viêm và bảo vệ tim mạch, góp phần duy trì sức khỏe tim mạch, kiểm soát cân nặng và tăng cường hệ thống miễn dịch [8, 12]

Sau khi thu hoạch được quả điều, tiến hành phân tách phần quả thật và quả giả Phần quả thật sẽ tiếp tục được chế biến để thu được sản phẩm hạt điều Sau quá trình chế biến nhiệt thu được hạt điều kèm lớp vỏ lụa, loại bỏ được phần vỏ cứng của quả thật Sau đó thực hiện quá trình chế biến hạt điều bao gồm rang hoặc sấy loại bỏ vỏ lụa thu được hạt nhân (hạt điều đã loại bỏ vỏ) và vỏ lụa hạt điều [13] Việc phân loại nguyên liệu hạt điều thường được xác định theo tiêu chuẩn chất lượng quốc tế như của Hiệp hội Công nghiệp Thực phẩm (AFI) của Mỹ và theo luật pháp của từng nước xuất khẩu [14].

Tổng quan về vỏ lụa hạt điều

Nhân hạt điều được bao phủ bởi một lớp vỏ mịn gọi là vỏ lụa, có đặc tính chống oxy hóa do có chứa polyphenol trong thành phần của nó Nó chiếm gần 3% tổng trọng lượng hạt điều Vỏ lụa chứa một lượng đáng kể protein thô (190 g/kg), chất xơ thô (103 g/kg) và chất béo (20,1 g/kg) Vỏ lụa hạt điều cũng rất giàu khoáng chất, các khoáng chất chính trong vỏ hạt điều là magie (5,8 g/kg), canxi (5,6 g/kg), kali (1,5 g/kg) và photpho (1,9 g/kg) Cellulose

Hình 2.3: Quy trình chế biến hạt điều để thu được vỏ lụa

(33,65%), hemicellulose (9,25%) và lignin (19,25%) cũng được tìm thấy trong vỏ lụa [15, 16]

Hình 2.4: Các thành phần hóa học trong vỏ lụa hạt điều

Các hợp chất phenolic đại diện cho thành phần hóa học chiếm ưu thế của vỏ lụa Các hợp chất phenolic chính trong vỏ lụa hạt điều là (+) -catechin và (-) -epicatechin Tổng hàm lượng phenolic (TPC) của vỏ lụa hạt điều cao hơn nhiều loại trái cây và rau quả như xoài và cam quýt [17] Các nghiên cứu báo cáo rằng TPC của các loại vỏ xoài khác nhau dao động từ 54,67 đến 109,70 mg/g đương lượng acid gallic [18] Tuy nhiên, TPC của vỏ xoài kém hơn so với vỏ lụa hạt điều Flavonoid cũng là một phần chính trong các hợp chất phenolic của vỏ hạt điều, (+)-catechin, (-)-epicatechin, epigallocatechin và catechin gallate là những flavanoid chính Đây là những tannin được phân bố rộng rãi và chiếm ưu thế với các đặc tính sinh học khác nhau Hàm lượng các hợp chất phenolic chính của hạt điều bao gồm: (+) -catechin, (-) -epicatechin và epigallocatechin là các flavanoid chính, còn acid syringic, gallic và p-coumaric là các acid phenolic chính được báo cáo trong vỏ lụa hạt điều [19; 20] (+)-catechin và (-) -epicatechin là hai hợp chất phenolic quan trọng trong vỏ lụa hạt điều Chúng đóng vai trò quan trọng như chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, bảo vệ gan,

8 chống béo phì, bảo vệ thần kinh và ngăn ngừa các bệnh tim mạch [21; 22] Sự hiện diện của acid tannic cũng được tìm thấy trong vỏ lụa hạt điều [23; 24] Gần đây đã tìm ra thêm các hợp chất phenolic ở dạng phenolic tự do, este hóa có trong vỏ lụa Catechin và Procyanidin được xác định là hợp chất chính trong vỏ [25] Các hợp chất phenolic này cũng có trong các phụ phẩm nông nghiệp khác, chẳng hạn như vỏ hạt ca cao và phụ phẩm từ cà phê [26]

Tocopherols là một nhóm các hợp chất hữu cơ có thành phần Vitamin E có vai trò thiết yếu trong dinh dưỡng của con người Những hợp chất hòa tan trong lipid này là chất chống oxy hóa mạnh Các nghiên cứu báo cáo rằng nhân hạt điều chứa vỏ lụa có lượng α - tocopherol cao hơn đáng kể so với nhân không có vỏ lụa, trong khi γ -tocopherol là như nhau đối với cả hạt điều không có vỏ lụa và hạt chứa vỏ lụa Các dạng đồng phân của tocopherol dựa trên số lượng và vị trí của nhóm methyl trên vòng thơm Các nghiên cứu báo cáo rằng nhân hạt điều chứa vỏ lụa có lượng α -tocopherol cao hơn đáng kể so với nhân không có vỏ lụa, trong khi γ -tocopherol là như nhau đối với cả hạt điều không có vỏ lụa và hạt chứa vỏ lụa [27]

Carotenoid là một nhóm các hợp chất sắc tố tự nhiên tạo ra màu vàng, đỏ và cam cho thực vật, đặc biệt có trong lá, quả, vỏ, Chúng là một phần không thể thiếu trong bộ máy quang hợp của thực vật và bảo vệ chúng khỏi hiện tượng quang hóa Carotenoid có đặc tính chống oxy hóa và là nguồn cung cấp vitamin A β-carotene, α-carotene, lycopene và lutein là những carotenoid phổ biến có trong trái cây và rau quả và là một phần trong chế độ ăn uống của con người [28] Một nghiên cứu sử dụng các mẫu hạt điều từ Indonesia đã báo cáo lượng β-carotene và lutein trong hạt điều có chứa vỏ lụa cao hơn so với hạt không có vỏ lụa [27] Trong số các phụ phẩm hạt điều, quả điều là nguồn cung cấp carotenoid dồi dào [25]

2.2.1.4 Các acid béo trong vỏ lụa hạt điều

Theo nghiên cứu khi so sánh hàm lượng acid béo của hạt không chứa vỏ lụa và hạt chứa vỏ lụa Acid béo không bão hòa bao gồm acid oleic (18:1) và acid linoleic (18:2), acid béo bão hòa là acid stearic Hàm lượng acid béo chủ yếu có trong vỏ hạt điều là acid linoleic, có hàm lượng cao hơn so với hàm lượng acid oleic và stearic Acid oleic trong hạt chứa vỏ lụa cao hơn 10% so với hạt không chứa vỏ lụa Hàm lượng acid stearic cao (41 g/kg DM) cũng được tìm thấy trong hạt chứa vỏ hạt [27]

2.2.2 Một số ứng dụng của vỏ lụa hạt điều hiện nay

Các phụ phẩm nông - công nghiệp được sản xuất với số lượng rất lớn, thường bị đổ bỏ, dẫn đến ô nhiễm môi trường Ngành công nghiệp hạt điều chủ yếu tập trung vào sản xuất hạt do lợi ích dinh dưỡng và sức khỏe của nó Một lượng lớn phụ phẩm được tạo ra từ quá trình chế biến hạt điều Một số nghiên cứu đã khẳng định rằng vỏ hạt điều là một nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng thực vật, chủ yếu là polyphenol Polyphenol có những lợi ích sức khỏe vượt trội như chất chống oxy hóa, kháng khuẩn, trị đái tháo đường và nhiều đặc tính khác, khiến chúng trở thành thành phần quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Polyphenol của hạt điều có nhiều ứng dụng khác nhau trong thực phẩm và các ngành công nghiệp khác Các nghiên cứu gần đây cho thấy vỏ lụa có những ứng dụng khác nhau trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau

♦ Ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm

Vỏ lụa có thể được sử dụng như một thành phần thực phẩm do đặc tính chống oxy hóa cao Một số nghiên cứu đã đánh giá hoạt động chống oxy hóa của polyphenol vỏ lụa trong thực phẩm Ảnh hưởng của các điều kiện rang khác nhau đến khả năng chống oxy hóa của hạt điều và vỏ hạt điều bằng cách sử dụng các hệ thống mô hình sinh học và thực phẩm khác nhau, hệ thống mô hình thịt lợn nấu chín và β-carotene-linoleate được sử dụng cho nghiên cứu này [19] Ngoài ra, độ ổn định oxy hóa tăng tốc của dầu ngô khi có mặt chiết xuất cũng được đánh giá Nghiên cứu này đã xác nhận tiềm năng chống oxy hóa của vỏ lụa trong các hệ thống mô hình thực phẩm Việc ứng dụng phenolic vỏ lụa trong thực phẩm bị hạn chế do nhiều yếu tố khác nhau như vị đắng và chất làm đông, khả năng hòa tan trong nước của polyphenol thấp và độ ổn định kém Đóng gói có thể được sử dụng như một công cụ để vượt qua những khó khăn này và nó có thể cải thiện ứng dụng thực phẩm của polyphenol vỏ lụa hạt điều Cần nhiều nghiên cứu hơn để chiết xuất các hoạt chất sinh học vỏ lụa và đưa chúng vào các sản phẩm thực phẩm

♦ Sản xuất enzyme công nghiệp

Enzyme là chất xúc tác sinh học tham gia vào các quá trình và sản phẩm công nghiệp khác nhau Thông thường, vi sinh vật được sử dụng để sản xuất các enzyme khác nhau Các phụ phẩm nông nghiệp có thể được sử dụng làm phương tiện để tổng hợp các enzyme có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp và y tế Tannase là một enzyme quan trọng có tác dụng thủy phân tannin và tạo ra acid galic và glucose Tannase có nhiều ứng dụng khác nhau

10 trong ngành dược phẩm và thực phẩm Là nguồn giàu tannin, vỏ lụa có thể được sử dụng làm chất nền để sản xuất tannase Đây là nguồn carbon hiệu quả để sản xuất tannase chi phí thấp trong quá trình lên men ở trạng thái rắn sử dụng Aspergillus niger CEPC 11 [24] Acid gallic thu được dưới dạng sản phẩm phụ trung gian của quá trình này Việc sản xuất tannase từ vỏ lụa bằng quá trình lên men chìm bằng cách sử dụng Aspergillus oryzae Kết quả cho thấy lượng tannase tối đa được tạo ra trong môi trường chứa 0,5% (w/v) tannin thô của vỏ lụa Việc khai thác vỏ lụa hạt điều có thể là chất nền rẻ hơn cho sản xuất công nghiệp tannase [31]

♦ Vật liệu đóng gói sinh học

Bao bì hoạt tính kết hợp chất chống oxy hóa, kháng khuẩn và chất bảo quản tự nhiên gần đây đã được chú ý nhiều hơn vì nó có thể bảo quản thực phẩm trong quá trình vận chuyển và bảo quản [32] Màng bao bì hoạt tính phân hủy sinh học được phổ biến vì chúng thân thiện với môi trường và thay thế nhựa Chiết xuất vỏ lụa được sử dụng để chế tạo màng bao bì hoạt tính có khả năng phân hủy sinh học Chiết xuất vỏ lụa được đưa vào màng đóng gói hoạt tính dựa trên cellulose được điều chế từ bã mía thông qua tổ hợp bề mặt Lớp màng này cho thấy khả năng chống oxy hóa hiệu quả, hoạt tính kháng khuẩn tốt và độ ổn định nhiệt cao (290 0 C) [23]

Thông thường vỏ lụa được sử dụng trong ngành thức ăn chăn nuôi Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng vỏ lụa được sử dụng làm thức ăn thay thế Kết quả cho thấy có tới 6% vỏ lụa trong khẩu phần không có ảnh hưởng xấu đến năng suất của lợn chăn nuôi Trong một nghiên cứu khác, vỏ lụa được sử dụng làm thức ăn thay thế bột cá trong khẩu phần ăn của tôm nước ngọt Microbrachium rosenbergii Kết quả cho thấy bột cá có thể được thay thế tới 3,04% bằng vỏ lụa [29] Nghiên cứu ảnh hưởng của vỏ lụa khô đến khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng và ổn định đường ruột ở heo xuất chuồng Bao gồm 5% hạt điều khô vỏ lụa trong khẩu phần làm giảm khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng mà không ảnh hưởng đến tình trạng đường ruột của heo xuất chuồng [30]

♦ Nhiên liệu đốt sinh học

Vỏ hạt điều có thể được sử dụng để sản xuất dầu sinh học, than sinh học và nhiên liệu sinh học Một nghiên cứu đánh giá tiềm năng năng lượng của vỏ hạt điều Than được sản xuất từ vỏ hạt điều có mật độ năng lượng cao Vì vậy, sản phẩm phụ công nghiệp này có thể

11 được sử dụng thay thế cho sản xuất nhiên liệu rắn [35] Một nghiên cứu gần đây đã đánh giá khả năng sản xuất dầu sinh học từ các phụ phẩm khác nhau của ngành hạt điều như vỏ hạt điều Dầu sinh học được sản xuất từ vỏ hạt điều thông qua quá trình nhiệt phân chậm, mang lại hiệu suất 37,1% và nhiệt phân chậm vỏ hạt điều tạo ra hiệu suất than sinh học là 40 (wt

♦ Làm chất loại bỏ thuốc nhuộm kim loại nặng

Một ứng dụng quan trọng của vỏ hạt điều là loại bỏ kim loại nặng khỏi nước thải Nước thải công nghiệp chứa kim loại nặng và thuốc nhuộm Nồng độ cao của nó dẫn đến ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến đời sống thủy sinh và con người Nhựa tannin chiết xuất từ vỏ lụa loại bỏ các kim loại nặng như Cd, Cu và Pb khỏi nước thải Vỏ lụa cũng có thể được sử dụng làm chất hấp phụ để loại bỏ thuốc nhuộm pha lê tím, xanh malachite và xanh methylene [34] Đồng nano được điều chế từ chiết xuất vỏ lụa bằng phương pháp tổng hợp xanh để loại bỏ uranium khỏi nước thải Các chất hóa học thực vật có trong vỏ hạt mang lại sự ổn định và được sử dụng để hấp phụ nano uranium từ nước thải Một báo cáo việc tổng hợp xanh các hạt nano sắt từ vỏ hạt điều để loại bỏ uranium khỏi nước thải Thuốc nhuộm azo như đỏ Congo và cam methyl có chứa các nhóm azo gây ung thư Vì vậy việc loại bỏ hiệu quả các hợp chất azo khỏi nước là rất cần thiết [35] Các hạt nano bạc có nguồn gốc từ hạt điều cho thấy khả năng phân hủy thuốc nhuộm azo gây ung thư nhờ sự hỗ trợ của NaBH4 Phân tích quang phổ hồng ngoại thấy các hợp chất hoạt tính sinh học có trong dịch chiết vỏ hạt điều có thể ổn định các hạt nano bạc [36]

♦ Sản xuất polymer sinh học

Công dụng của polyphenol, flavonoid

Polyphenol là hợp chất thứ cấp được phân bố rộng rãi trong giới thực vật Chúng được chia thành nhiều loại, tức là acid phenolic (acid hydroxybenzoic và acid hydroxycinnamic), flavonoids (flavanols, flavanones, isoflavones, proanthocyanidins), stilbenes và lignans, có trong thực vật và thực phẩm có nguồn gốc thực vật [38, 39] Phenolics là thành phần quan trọng tạo nên chất lượng trái cây vì chúng góp phần tạo nên hương vị, màu sắc và đặc tính dinh dưỡng của trái cây [40]

Các hợp chất phenolic thường được tìm thấy ở cả thực vật ăn được và không ăn được, và chúng đã được báo cáo là có nhiều tác dụng sinh học, bao gồm cả hoạt động chống oxy hóa Chiết xuất thô từ trái cây, thảo mộc, rau, ngũ cốc và các nguyên liệu thực vật khác giàu phenolics [38] ngày càng được quan tâm trong ngành công nghiệp thực phẩm vì chúng làm chậm quá trình phân hủy oxy hóa lipid và do đó cải thiện chất lượng và giá trị dinh dưỡng của thực phẩm Các hợp chất phenolic này có thể được phân loại thành các nhóm khác nhau theo hàm số của số lượng phenol các vòng mà chúng chứa và các phần tử cấu trúc liên kết các vòng này với nhau

Các hợp chất này cũng phổ biến trong chế độ ăn uống, chẳng hạn như trái cây, rau, quả hạch, hạt, hoa và vỏ cây cũng như đồ uống thông thường như rượu, bia và trà và do đó, là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người Chúng chịu trách nhiệm một phần về chất lượng cảm quan và dinh dưỡng của thực phẩm thực vật, ví dụ như màu sắc và mùi tùy thuộc vào hàm lượng hợp chất polyphenolic [41] Hơn nữa, một số cũng có thể liên kết các đại phân tử, chẳng hạn như protein trong chế độ ăn, carbohydrate và enzyme tiêu hóa, do đó làm giảm khả năng tiêu hóa thực phẩm [42]

Cấu trúc hóa học của polyphenol được đặc trưng bởi sự có mặt của ít nhất một vòng phenyl và một hoặc nhiều nhóm thế hydroxyl Phenolic bao gồm từ các cấu trúc vòng thơm nhỏ đơn giản đến các tannin cô đặc phức tạp và nặng Polyphenol có nguồn gốc trong tự nhiên thông qua hai con đường chính có thể xảy ra độc lập hoặc cùng nhau [42].Một con đường liên quan đến sự liên kết của các đơn vị hai carbon, nghĩa là axetat hoạt hóa, để tạo thành polyketide, trải qua quá trình tuần hoàn hóa tiếp theo thành polyphenol [44]

Hình 2.5: Công thức hóa học của một số polyphenols

Flavonoid là các phân tử có benzopyran phenolic cấu trúc và chỉ xảy ra ở thực vật nơi chúng tồn tại hiện diện chủ yếu dưới dạng glycoside Các flavonoid có thể được chia thành sáu lớp như một chức năng của loại dị vòng liên quan: flavonols, flavones, isoflavones, flavanones, anthocyanidins, and flavanols Flavonoid và các phenol thực vật khác như acid phenolic, stilben, tannin và lignan đặc biệt phổ biến ở lá, hoa mô và các bộ phận bằng gỗ như thân và vỏ cây [43] Chúng quan trọng trong cây để phát triển và phòng vệ sinh trưởng bình thường chống nhiễm trùng và bị thương Flavonoid cũng một phần cung cấp màu sắc thực vật có trong hoa, quả và lá Polyphenol thực vật bao gồm rất nhiều loại các hợp chất, trong đó flavonoid và một số loại non-flavonoid thường được phân biệt [44]

2.3.3 Vai trò của polyphenol và flavonoid

Vai trò của polyphenol trong chế độ ăn uống trong việc duy trì sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật là một phần là do đặc tính chống oxy hóa và một phần là do khả năng thu dọn gốc tự do của các phân tử sinh học này Tổng hoạt động chống oxy hóa của trái cây chủ yếu là do hàm lượng polyphenol của chúng, ngoại trừ vitamin C [45] vì chúng ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do và có vai trò phá vỡ chuỗi trong việc loại bỏ gốc tự do trực tiếp của các phản ứng chuỗi peroxid hóa lipid [46]

Ngoài khả năng chống oxy hóa và loại bỏ gốc tự do, polyphenol còn được gọi là chất thải kim loại Trên thực tế, sự có mặt của các vòng thơm kết hợp với sự xuất hiện của một số nhóm chức (nhóm carboxyl, hydroxyl và carbonyl) khiến chúng có khả năng liên kết với các kim loại khác nhau [47] Khả năng này rất quan trọng đối với thực vật vì phenol tăng cường hấp thu chất dinh dưỡng bằng cách hình thành các chelate với các ion kim loại Hơn nữa, chelat hóa các kim loại chuyển tiếp như sắt hoặc đồng, làm giảm tốc độ phản ứng Fenton, do đó ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc hydroxyl phản ứng gây ra [48] Hơn nữa, người ta đã phát hiện ra rằng chức năng quét của polyphenol như một chất đồng chống oxy hóa và tham gia vào việc tái tạo các vitamin thiết yếu Ví dụ, Chu và các đồng tác giả [49] đã báo cáo một nghiên cứu chi tiết về cơ chế phối hợp chống oxy hóa của α-tocopherol với polyphenol trong trà xanh α-tocopherol là thành phần chính và là dạng vitamin E hoạt động mạnh nhất và là chất chống oxy hóa phá vỡ chuỗi hòa tan trong lipid nội sinh chính trong huyết tương người Hiệu quả chống oxy hóa của vitamin E có thể được tăng cường nhờ một chất chống oxy hóa cùng tồn tại khác (như vitamin Cand polyphenol trong trà xanh) nếu chất này có thể làm giảm gốc α-tocopheroxyl để tái tạo vitamin E Do đó, phản ứng tái tạo α-tocopherol bằng các chất chống oxy hóa cùng tồn tại đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả chống oxy hóa của α-tocopherol và loại bỏ cái gọi là peroxid hóa qua trung gian tocopherol

Gần đây, có một quan điểm mới cho rằng các chất phytochemical và đặc biệt là flavonoid, không hoạt động nghiêm ngặt như các chất chống oxy hóa thông thường mà còn đóng vai trò là chất điều biến tín hiệu tế bào [50, 51]

Các nghiên cứu được thực hiện trên anthocyanin (điển hình của rượu vang đỏ, trái cây đỏ và hành đỏ) cho thấy khả dụng sinh học thấp của chúng: trên thực tế, chỉ 1 - 2% anthocyanin được đưa vào thực phẩm duy trì cấu trúc phân tử ban đầu của chúng Điều này là do các yếu tố khác nhau như sự thay đổi độ pH trong đường tiêu hóa, phản ứng thủy phân bởi các enzyme trong ruột non, quá trình chuyển hóa giai đoạn II ở ruột và gan (glucuronid

15 hóa, sunfat hóa và methyl hóa) và hoạt động enzyme và dị hóa của hệ vi sinh vật đường ruột [52]

Flavonoid gần đây được sử dụng để điều trị bệnh động kinh [53] Động kinh là bệnh rối loạn thần kinh phổ biến nhất, ảnh hưởng đến 1 - 2% dân số thế giới và làm suy thoái đáng kể nhiều khía cạnh của chất lượng cuộc sống [54] Các nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra rằng, do cấu trúc của chúng tương tự như các thuốc benzodiazepin, flavonoid có tác dụng chống động kinh bằng cách điều chỉnh phức hợp kênh GABAA-Cl [55, 56] Quercetin là một flavonoid đã được phát huy thành chất chống oxy hóa tuyệt vời trong nhiều nghiên cứu [57] và cũng có đặc tính chống viêm [58], có thể ngăn ngừa bệnh tim mạch [59], chống lại virus cúm A [60], có tác dụng chống loét, chống dị ứng, và tác dụng chống tăng sinh [61] và điều chỉnh biểu hiện gen [62] Một số nghiên cứu trên động vật in vitro và in vivo đã chỉ ra rằng quercetin có thể được xem xét một lựa chọn để điều trị ung thư bằng cách gây chết tế bào hoặc ngừng chu kỳ tế bào trong tế bào ung thư [63, 64 ,65] Nhiều nghiên cứu cũng báo cáo rằng hợp chất này góp phần đến việc ngăn ngừa các bệnh tim mạch [59]

2.3.4 Ứng dụng khả năng kháng oxy hóa của polyphenol

Chiết xuất giàu polyphenol thực vật có đặc tính kháng khuẩn cao, nhưng nhiều lý do khiến chúng khó kết hợp vào các công thức sinh học: giải phóng nhanh, độ hòa tan thấp, hoạt tính sinh học thấp và khả năng chống lại các áp lực môi trường (nhiệt độ, độ ẩm, pH, ánh sáng oxy, v.v.) Sự phân hủy bức xạ oxy hóa có thể làm suy giảm các hợp chất này dẫn đến việc tạo ra các gốc tự do và phát triển các mùi vị khó chịu và mùi hôi Nó dẫn đến tác động không mong muốn đến độ ổn định của hệ, đặc tính cảm quan và khả năng chấp nhận của người tiêu dùng đối với sản phẩm Do đó, độ ổn định nhiệt của polyphenol có tầm quan trọng hàng đầu trong các giai đoạn chế biến thực phẩm khác nhau [66] Polyphenol được biết là tương tác với protein chủ yếu bằng liên kết hydro và kỵ nước, làm giảm khả dụng sinh học và hoạt tính sinh học của poly-phenol Hơn nữa, mặc dù một số hợp chất thực vật xứng đáng được công nhận là an toàn (GRAS), thông tin độc tính điển hình về việc sử dụng chúng trong thực phẩm lại không có ở đó Vì vậy, việc cải thiện thông tin về độc tính của các hợp chất này sẽ có lợi cho việc sử dụng chúng, đặc biệt là làm chất bảo quản thực phẩm

Sử dụng thực vật chiết xuất giàu polyphenol làm chất thay thế cho thuốc kháng sinh tổng hợp là một xu hướng đầy hứa hẹn trong ngành công nghiệp thực phẩm, vì khả năng kháng khuẩn cao và nhu cầu ngày càng tăng của người tiêu dùng đối với các sản phẩm hoàn toàn tự nhiên

Trong quá trình bảo quản sữa có thể sử dụng polyphenols để ức chế phản ứng Maillard trong các loại sữa có xử lý nhiệt [67]

Chất chống oxy hóa tự nhiên như tocopherols, polyphenol trong trà, vitamin C, acid carnosic, rutin và acid dihydrocaffeic, đã là chủ đề của các nghiên cứu được công bố rộng rãi Nó đã được tìm thấy rằng hầu hết các chất chống oxy hóa tự nhiên có tính ổn định nhiệt cao hơn và chống oxy hóa so với chất tổng hợp trong các loại dầu ăn khác nhau [68] Tóm lại, myricetin, quercetin, rutin, acid Carnosic, acid caffeic, catechin và theaflavin thể hiện đặc tính chống oxy hóa vượt trội trong các loại dầu tinh khiết trong quá trình bảo quản Nhìn chung, hoạt tính chống oxy hóa được xác định bởi số lượng nhóm hydroxyl và các nhóm thế vòng thơm khác có trong hợp chất phenolic [69] Hiệu suất của chúng tương đương hoặc tốt hơn một số chất chống oxy hóa tổng hợp (BHA, BHT và TBHQ) được thử nghiệm trong các nghiên cứu đó

Nhờ hoạt động chống oxy hóa và kháng khuẩn đặc biệt cũng như khả năng tiếp cận, polyphenol đã được áp dụng trong vật liệu đóng gói thực phẩm để cải thiện các tính chất vật lý và chức năng Nhìn chung, các chất chống oxy hóa tổng hợp hóa học được trộn với các polyme này để bảo vệ khỏi quá trình oxy hóa và lão hóa do nhiệt, oxy, tia UV, các gốc tự do và các yếu tố khác có nguy cơ tiềm ẩn đối với con người [70] Để thay thế các chất chống oxy hóa tổng hợp bằng nhựa, một số nghiên cứu đã cố gắng ghép các polyphenol tự nhiên hoặc chiết xuất giàu phenolic bằng các polyme tổng hợp hóa học thông thường để thay thế các chất phụ gia hóa học và giảm khả năng di chuyển trong thực phẩm Polyphenols hoặc chiết xuất giàu polyphenol như acid ferulic, quercetin, chiết xuất lá ô liu, polyphenol xoài và chè, được ghép bằng các polyme tổng hợp hóa học, như PET, PP và PVA, các màng tạo thành thể hiện đặc tính đóng gói và hoạt tính sinh học tốt [71, 72, 73, 74].

Tổng quan về phương pháp trích ly polyphenol và flavonoid

Phương pháp Soxhlet là một kỹ thuật cổ điển được coi là thước đo tiêu chuẩn để đo lường hiệu suất của các phương pháp trích ly khác Phương pháp này được sử dụng để trích ly lipid và các hợp chất sinh học Phương pháp Soxhlet thu được hiệu quả trích ly cao, không cần quá trình lọc sau khi trích ly và có thể trích nhiều mẫu cùng lúc Tuy nhiên phương pháp này còn một số hạn chế: thời gian trích ly kéo dài hơn so với nhiều phương pháp khác, nhiệt độ cao làm cho dung môi bay hơi và có thể làm phá hủy các thành phần bên trong mẫu, ảnh

17 hưởng đến chất lượng của hợp chất cần trích ly ngoài ra kỹ thuật bị hạn chế ở việc chọn dung môi [75]

2.4.2 Phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng (MAE)

Trích ly hỗ trợ vi sóng là phương pháp sử dụng thiết bị vi sóng có tần số từ 0,3 đến 300 GHz và bước sóng từ 1cm đến 1m [91] Để tạo ra nhiệt bên trong dịch trích thông qua sự lưỡng cực và sự dẫn ion các phân tử, tần số thường được sử dụng để trích ly từ 915 đến 2450 MHz và có bước sóng nằm trong 12 đến 20 cm [76, 77] Khi trích ly bằng vi sóng, thành tế bào vỡ ra để các hợp chất có hoạt tính sinh học ra khỏi tế bào, độ ẩm bên trong sinh khối kết hợp năng lượng vi sóng làm quá trình gia nhiệt diễn ra nhanh dễ dàng thu được dịch chiết bên trong sản phẩm [77] Phương pháp này mang lại một số lợi ích cho quá trình trích ly như: thu được dịch chiết nhanh, năng suất cao, tiết kiệm thời gian và dung môi Đây là một phương pháp trích ly mang lại hiệu quả tương đối cao và có khả năng thu hồi lớn Tuy nhiên, vi sóng cũng có tác động tiêu cực đến các hoạt chất sinh học nếu không kiểm soát được nhiệt độ, và phương pháp này chỉ phù hợp trong quy mô phòng thí nghiệm, nhiệt độ dung môi tăng nhanh có thể dẫn đế cháy nổ [78]

2.4.3 Phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm (UAE)

Phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm là một kỹ thuật chiết xuất không dùng nhiệt mà bằng cách sử dụng sóng siêu âm để tạo sóng có tần số từ 20 đến 100 kHz [79] Việc chiết xuất hoàn toàn các hợp chất sinh học được hoàn thành trong vài phút Sóng siêu âm cung cấp tác động cơ học, phá vỡ cấu trúc tế bào, giúp tăng sự thẩm thấu của dung môi vào mẫu Đây là một phương pháp hiện đại được sử dụng rộng rãi khi rút ngắn thời gian trích ly từ đó tiết kiệm dung môi, năng lượng, tăng năng suất dịch trích và để giữ lại các hợp chất có hoạt tính sinh học [80] Tuy nhiên, nhược điểm chính của phương pháp này là phải lặp lại nhiều lần quá trình trích ly dẫn đến mất nhiều thời gian và tiêu thụ nhiều năng lượng do sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ tế bào mẫu, nhiệt độ cao của thiết bị có thể ảnh hưởng đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất nhạy cảm với nhiệt như polyphenol [81]

2.4.4 Phương pháp trích ly bằng xung điện trường (PEFAE)

Phương pháp trích ly bằng xung điện trường có thể được coi là công nghệ trích ly mới để trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học có độ tinh khiết cao, sử dụng ít năng lượng và sử dụng dung môi thân thiện với môi trường [91] Phương pháp này còn được gọi là phương trích ly không dùng nhiệt vì các hợp chất được trích ly ở nhiệt độ tối thiểu không làm giảm chất lượng của các hợp chất cần trích ly [82] Trong quá trình trích ly, năng lượng điện được

18 sử dụng để tạo ra các nano chia nhỏ màng tế bào để các hợp chất có hoạt tính sinh học có thể ra ngoài màng tế bào [83] Xung điện trường gây ra sự dịch chuyển các ion và phân tử từ bên trong tế bào ra màng tế bào chúng hoạt động như một chất cách điện [84]

2.4.5 Phương pháp trích ly bằng chất lỏng siêu tới hạn (SFE) Đây là một phương pháp hiện đại và thân thiện với môi trường Chất lỏng siêu tới hạn là chất khí có áp suất và nhiệt độ cao hơn điểm tới hạn nhưng độ nhớt và độ khuếch tán vẫn mang tính chất của một chất khí Những chất lỏng siêu tới hạn thường có độ khuếch tán cao, độ nhớt thấp và có tính vận chuyển tốt dễ dàng khuếch tán vào mẫu và tăng tốc độ trích ly [85] CO2 thường là chất khí được chọn để thực hiện quá trình trích ly này vì CO2 không mùi, không vị, không độc hại, không gây cháy, giá thành thấp và có khả năng kết hợp với các chất chứa O2 Dung môi ethanol, acetone, ethyl acetate, được bổ sung tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm để tăng độ hòa tan, đặc biệt là tăng độ hòa tan của các cấu tử có phân tử lớn, và hàm lượng dung môi sử dụng thường không quá 10% [86] Các điều kiện vận hành phương pháp trích ly siêu tới hạn thông thường là CO2 ở nhiệt độ 31 o C và áp suất 7,38 bar [87] Chất lỏng siêu tới hạn có độ nhớt và sức căng bề mặt thấp với hệ số khuếch tán cao, giúp chúng xâm nhập vào mẫu một cách dễ dàng và nhanh chóng Ngăn chặn quá trình suy giảm và oxy hóa các hợp chất cần được trích ly Quá trình được đảm bảo chiết xuất trong thời gian ngắn Sau khi kết thúc quá trình trích ly, chất lỏng siêu tới hạn có thể được tái sử dụng, giảm thiểu chất thải và tiết kiệm dung môi Hiện nay phương pháp này được áp dụng trong quy mô lớn [88] Sự hiện diện của độ ẩm và tạp chất trong CO2 công nghiệp có thể gây ra trở ngại cho quá trình chiết xuất Do đó cần một hệ thống làm sạch chất lỏng, loại bỏ tạp chất từ đó tăng chi phí của quá trình trích ly [89]

Vỏ lụa hạt điều là phụ phẩm của ngành chế biến hạt điều nhưng vẫn chứa các hoạt tính sinh học tiềm năng cần được khai thác để ứng dụng trong các lĩnh vực như thực phẩm, y học,… Hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu và công bố về vấn đề trích ly các hoạt chất tốt này chính vì vậy nghiên cứu này được thực hiện giúp đưa ra các dữ liệu là những đóng góp đáng tin cậy làm phong phú nguồn tư liệu khoa học về các hợp chất sinh học có trong vỏ lụa hạt điều, là nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất sinh học được trích ly từ vỏ lụa hạt điều

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

Vỏ hạt điều (Cashew testa) được cung cấp bởi Công ty TNHH Vinahe có trụ sở tại tỉnh Bình Phước, với độ ẩm vỏ lụa ban đầu là 6,62%

Hoá chất được sử dụng trong nghiên cứu mua tại cửa hàng hoá chất SBC Scientific 568/52 Lê Văn Việt, P Long Thạnh Mỹ, Tp Thủ Đức, TP.HCM với độ tinh khiết >95% và cửa hàng chuyên dụng cụ và hóa chất phòng thí nghiệm Hóa Nam

Bảng 3.1: Các hóa chất dùng cho nghiên cứu

STT Tên hóa chất Thương hiệu

Trạng thái Độ tinh khiết

1 NaOH (Sodium hydroxide) Xi Long Rắn 99%

2 Na2CO3 (Sodium carbonate) Xi Long Rắn 99%

3 NaNO2 ( Sodium nitrite) Trung Quốc Rắn 99%

4 CH3OH (Methanol) Trung Quốc Lỏng ≥99.5%

5 C2H5OH (Ethanol) Việt Nam Lỏng ≥99.5%

6 DPPH (1,1-Diphenyl-2- picrylhydrazyl) Nhật Rắn 99%

8 Thuốc thử Folin- Ciocalteu’s Đức Lỏng 99%

9 Acid gallic Trung Quốc Rắn >95%

10 AlCl3 (Aluminum chloride) Trung Quốc Rắn 99%

Các dụng cụ dùng trong nghiên cứu

• Bình tam giác, cốc Becher, ống đong, bình định mức, đũa thủy tinh, phễu lọc thủy tinh, đĩa petri, ống nghiệm thủy tinh, khay đựng ống nghiệm

• Pipet, micropipet, bóp cao su, ống ly tâm

• Khay nhôm, màng bọc thực phẩm, giấy bạc

Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu

Thiết bị sử dụng Nhà sản xuất

Cân kỹ thuật 2 số lẻ LS 3200C PRECISA Thụy Sỹ

Cân phân tích 4 số lẻ LS220A PRECISA Thụy Sỹ

Cân sấy ẩm hồng ngoại PRECISA Thụy Sỹ

Tủ sấy đối lưu DKM600 Yamato Nhật Bản

Máy đo quang phổ hai chùm tia Hitachi Nhật Bản

Máy ly tâm Hermle Z366 Hermle Đức

Bộ xử lý siêu âm UP100H Hielscher Đức

Thiết bị lắc ổn định nhiệt IST 4075R JeioTech Hàn Quốc

Lò vi sóng Electrolux Thụy Điển

Quy trình sản xuất bột vỏ lụa hạt điều trong bài nghiên cứu

3.2.1 Sơ đồ quy trình công nghệ

Mục đích: Nhằm phân loại tối đa hạt điều còn lẫn trong vỏ lụa tránh các sai số trong quá trình nghiên cứu

Tiến hành: Phân loại các hạt điều vụn, bể còn sót lại trong vỏ lụa

Mục đích: Nhằm làm giảm lượng ẩm có trong vỏ lụa, làm khô vỏ lụa thuận tiện cho quá trình nghiền mịn

Bột vỏ lụa hạt điều

Hình 3.1: Sơ đồ quy trình sản xuất bột vỏ lụa hạt điều

Tiến hành: Vỏ lụa sau khi được loại bỏ hạt sót sẽ tiến hành sấy trong tủ sấy Memmert có hệ thống đối lưu với nhiệt độ 60 0 C đến độ ẩm đạt 4,2%

Mục đích: Nhằm tạo diện tích bề mặt tiếp xúc lớn để dễ tiếp xúc với dung môi giúp cho quá trình trích ly dễ dàng hơn

Tiến hành: Vỏ lụa hạt điều sau khi sấy khô sẽ được nghiền mịn bằng máy nghiền

Mục đích: Giúp bột vỏ lụa đồng nhất, loại bỏ được các hạt xay chưa mịn

Tiến hành: Vỏ lụa hạt điều sau khi nghiền mịn sẽ tiến hành rây qua có kích thước lỗ

0,125mm, loại bỏ các hạt lớn hơn không đi qua rây

Mục đích: Hạn chế sự tấn công từ các điều kiện bên ngoài, nấm, mốc và hạn chế sự hao hụt các hợp chất sinh học

Tiến hành: Sau khi rây thu được bột mịn, tiến hành bảo quản trong các túi zip tối màu có bổ sung các gói hút ẩm bên ngoài, các túi zip sẽ được tiến hành bảo quản trong tủ đông có nhiệt độ thấp hơn 5 0 C.

Quy trình trích ly polyphenol và flavonoid từ bột vỏ lụa hạt điều trong bài nghiên cứu

3.3.1 Sơ đồ quy trình công nghệ

Hình 3.2: Sơ đồ quy trình trích ly các hợp chất sinh học từ vỏ lụa hạt điều

Mục đích: Tạo môi trường tiếp xúc cho dung môi và nguyên liệu tạo cơ sở cho quá trình trích ly

Phương pháp ngâm chiết: Mỗi lần thí nghiệm sẽ tiến hành theo các dung môi và tỷ lệ theo bài nghiên cứu, cho vỏ lụa và dung môi vào erlen 125 mL và tiến thành ngâm chiết trong bể lắc ổn nhiệt

Ly tâm Bột vỏ lụa

Trích ly (Ngâm chiết, vi sóng, siêu âm)

Phân tích các chỉ tiêu (hàm lượng chất khô hòa tan tổng, phenolic tổng, flavonoid tổng, hoạt tính kháng oxy hóa)

Phương pháp hỗ trợ vi sóng: Chuẩn bị vỏ lụa và dung môi vào erlen 125 mL sau đó cho vào lò vi sóng thực hiện quá trình trích với dung môi và tỷ lệ, thời gian theo bài nghiên cứu

Phương pháp hỗ trợ sóng siêu âm: Chuẩn bị vỏ lụa và dung môi vào erlen 125 mL với dung môi và tỷ lệ theo bài nghiên cứu đặt đầu phát sóng siêu âm vào erlen tiến hành trích ly

Mục đích: Tạo môi trường và nhiệt độ ổn định, giúp cho toàn bộ dung môi và bột vỏ lụa tiếp xúc đồng đều giúp làm tăng hiệu quả quá trình trích ly

Tiến hành: Cho các bình erlen chứa mẫu bột và dung môi vào tủ lắc ổn nhiệt, thiết lập các thông số khảo sát theo bài nghiên cứu

Mục đích: Tách phần cặn và dịch chiết vỏ lụa hạt điều, chuẩn bị cho quá trình đo đạc các thông số dịch chiết

Tiến hành: Các mẫu sau khi kết thúc quá trình trích ly, tiến hành rót vào các ống ly tâm với các khối lượng bằng nhau 50g/ống ly tâm 50mL Tiến hành đặt các ống ly tâm đối xứng và ly tâm với tốc độ 4000 rpm trong vòng 15 phút Sau đó thu nhận dịch chiết và loại bỏ phần cặn đỏy, đem lọc dịch chiết với lỗ lọc cú kớch thước 0,45àm Thu nhận dịch chiết sau khi lọc và tiến hành đo đạc.

Nội dung nghiên cứu

Hình 3.3: Sơ đồ nghiên cứu trích ly các hợp chất sinh học từ vỏ lụa hạt điều

3.4.2 Thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly polyphenol và flavonoid từ bột vỏ lụa hạt điều

♦ Thí nghiệm 1.1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình trích ly

Mục đích: Dung môi ethanol được xem là dung môi an toàn đóng vai trò quan trọng trong quá trình trích ly, góp phần tạo môi trường để phá vỡ cấu trúc mẫu giải phóng polyphenol

Vì vậy thí nghiệm sẽ khảo sát nồng độ dung môi với mục đích tìm ra dung môi mang lại hiệu quả trích ly tốt nhất

Cách thực hiện: : Cân 2,5 g bột vỏ lụa hạt điều và 50ml dung môi theo từng nồng độ

20% ; 40%; 60%; 80%; 96% và thực hiện quá trình ngâm chiết ở bể lắc ổn nhiệt Sau đó thực hiện quá trình ly tâm, lọc để thu được dịch chiết và tiến hành xác định, hàm lượng chất

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly các chất có hoạt tính sinh học từ vỏ lụa hạt điều

Sản xuất bột vỏ lụa hạt điều

- Phân tích hiệu quả trích ly polyphenol, flavonoid và hàm lượng chất khô tổng số

- Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết

- So sánh hiệu quả trích ly giữa các phương pháp

So sánh hiệu quả trích ly có hỗ trợ vi sóng (từ 2 phút đến 10 phút), siêu âm

(từ 10 phút đến 40 phút) và truyền thống

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lắc ổn nhiệt trong khoảng 60 ÷ 240 (phút)

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lắc ổn nhiệt trong khoảng 30 ÷ 70 o C

- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu

26 khô tổng số hàm lượng polyphenol , flavonoid và hoạt tính kháng oxy hóa để chọn dung môi thích hợp

Cố định các yếu tố:

• Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu: 20/1 (mL/g nguyên liệu)

• Thời gian xử lý: 120 phút

♦ Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly

Mục đích: Khảo sát thời gian với mục đích tìm ra thời gian mang lại hiệu quả trích ly tốt nhất

Cách thực hiện: Cân 2,5 g bột vỏ lụa hạt điều và 50ml dung môi và tiến hành quá trình ngâm chiết ở bể lắc ổn nhiệt lần lượt theo thời gian 60; 120; 180; 240 phút Sau đó thực hiện quá trình ly tâm, lọc để thu được dịch chiết và tiến hành xác định, hàm lượng chất khô tổng số hàm lượng polyphenol, flavonoid và hoạt tính kháng oxy hóa để chọn thời gian thích hợp

- Cố định các yếu tố:

• Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu: 20/1 (mL/g nguyên liệu)

• Dung môi sử dụng : Ethanol 40%

♦ Thí nghiệm 1.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly

Mục đích: Khảo sát nhiệt độ trích ly với mục đích tìm ra nhiệt độ mang lại hiệu quả trích ly tốt nhất

Cách thực hiện: Cân 2,5 g bột vỏ lụa hạt điều và 50ml dung môi và tiến hành quá trình ngâm chiết ở bể lắc ổn nhiệt lần lượt theo nhiệt độ 30 0 C; 40 0 C; 50 0 C; 60 0 C; 70 0 C Sau đó thực hiện quá trình ly tâm, lọc để thu được dịch chiết và tiến hành xác định, hàm lượng chất khô tổng số hàm lượng polyphenol, flavonoid và hoạt tính kháng oxy hóa để chọn nhiệt độ thích hợp

- Cố định các yếu tố:

• Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu: 20/1 (mL/g nguyên liệu)

• Dung môi sử dụng : Ethanol 40%

• Thời gian xử lý: 60 phút

♦ Thí nghiệm 1.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến quá trình trích ly

Mục đích: Khảo sát tỷ lệ dung môi trích ly với mục đích tìm ra tỷ lệ mang lại hiệu quả trích ly tốt nhất

Cách thực hiện: Định lượng tỉ lệ dung môi/ bột vỏ lụa hạt điều lần lượt theo tỉ lệ 10/1;

20/1; 40/1; 80/1 (ml/g nguyên liệu) và tiến hành quá trình ngâm chiết ở bể lắc ổn nhiệt, sau đó thực hiện quá trình ly tâm, lọc để thu được dịch chiết và tiến hành xác định, hàm lượng chất khô tổng số, hàm lượng polyphenol, flavonoid và hoạt tính kháng oxy hóa để chọn tỷ lệ thích hợp

- Cố định các yếu tố:

• Dung môi sử dụng : Ethanol 40%

• Thời gian xử lý: 60 phút

♦ Thí nghiệm 1.5: Ảnh hưởng của trích ly có hỗ trợ vi sóng

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của trích ly bằng vi sóng đến một số hoạt chất sinh học của dịch chiết từ vỏ lụa hạt điều so với các phương pháp trích ly khác

Cách thực hiện: Cân 2,5 g bột vỏ lụa hạt điều và 100 ml dung môi bỏ vào cốc thủy tinh để tiến hành quá trình trích ly hỗ trợ vi sóng trong thời gian 2; 4 ;6; 8; 10 phút Nhiệt độ dung môi trong quá trình chiết tách hỗ trợ vi sóng thường tăng nhanh, dễ đạt nhiệt độ sôi Vì vậy nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết tách gián đoạn với 15 giây gia nhiệt (“on”) và

45 giây không nhiệt (“off“) xen kẽ để tránh nhiệt chiết mẫu bị gia nhiệt quá độ Quá trình thực hiện với công suất thấp nhất của lò vi sóng để có thể kéo dài thời gian chiết tách Sau đó thực hiện quá trình ly tâm, lọc để thu được dịch chiết và tiến hành xác định, hàm lượng chất khô tổng số hàm lượng polyphenol, flavonoid và hoạt tính kháng oxy hóa để chọn thời gian thích hợp

Cố định các yếu tố:

• Dung môi sử dụng : Ethanol 40%

• Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu: 40/1 (ml/g)

♦ Thí nghiệm 1.6: Ảnh hưởng của trích ly có hỗ trợ siêu âm

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của trích ly bằng sóng siêu âm đến một số hoạt chất sinh học của dịch chiết từ vỏ lụa hạt điều so với các phương pháp trích ly khác

Cách thực hiện: Cân 1 g bột vỏ lụa hạt điều và 40 ml dung môi bỏ vào cốc thủy tinh đặt đầu phát sóng siêu âm vào cốc thực hiện trích ly trong thời gian 10; 20 ; 30; 40 phút Sau đó thực hiện quá trình ly tâm, lọc để thu được dịch chiết và tiến hành xác định, hàm lượng chất khô tổng số hàm lượng polyphenol, flavonoid và hoạt tính kháng oxy hóa để chọn thời gian thích hợp

Cố định các yếu tố:

• Dung môi sử dụng : Ethanol 40%

• Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu: 40/1 (ml/g nguyên liệu)

• Tần số thực hiện: 30 kHz.

Phương pháp phân tích

3.5.1 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng

Nguyên tắc: Polyphenol được xác định bằng cách sử dụng thuốc thử Folin – Ciocalteu

Thuốc thử Folin-Ciocalteu là hỗn hợp của phosphotungstic acid (H3PW12O40) và phosphomolybdic acid (H3PMo12O40), một chất có tính oxy hóa phản ứng khử các hợp chất polyphenol có trong dịch trích trong môi trường kiềm Phản ứng đi kèm với sự hình thành phức chất màu xanh lam có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 765 nm Do oxotungstate và oxomolybdate được hình thành trong phản ứng oxy hóa khử này tạo thành màu xanh lam tỷ lệ với nồng độ polyphenol [90;92]

Cách tiến hành: Hàm lượng polyphenol tổng được thực hiện theo mô tả của Singleton và cộng sự [96] Lấy 0,2 mL dịch trích vào các ống nghiệm, bổ sung 2,8 mL dung dịch Folin – Ciocalteu 10% và để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 5 phút sau đó cho thêm 2 mL dung dịch Na2CO3 7,5 % Lắc ống nghiệm để trộn đều hỗn hợp sau đó để phản ứng xảy ra trong phòng tối trong 30 phút Sau phản ứng dung dịch sẽ được xác định bằng máy đo quang phổ

29 tại bước sóng 765 nm Sử dụng acid gallic để xây dựng đường chuẩn và kết quả được biểu diển bằng milligram gallic acid tương đương (mg GAE/g nguyên liệu)

Xây dựng đường chuẩn gallic acid:

Pha 0,025g acid gallic trong methanol rồi định mức lên 50mL Sau đó pha acid gallic với các nồng độ: 10; 20; 30; 40; 50; 60;70 𝜇g/mL Lấy 0,2 mL dung dịch acid gallic theo nồng độ trên cho lần lượt vào các ống nghiệm, bổ sung 2,8 mL dung dịch Folin – Ciocalteu 10% và để phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 5 phút sau đó cho thêm 2 mL dung dịch Na2CO3 7,5

% Lắc ống nghiệm để trộn đều hỗn hợp sau đó để phản ứng xảy ra trong phòng tối trong 30 phút Sau phản ứng dung dịch sẽ được xác định bằng máy đo quang phổ tại bước sóng 765 nm Xây dựng đường chuẩn và phương trình tương quan giữa nồng độ acid gallic và độ hấp phụ

Xác định tổng hàm lượng polyphenol (mg GAE/g CK nguyên liệu)

TPC :Hàm lượng phenol tổng số tương đươg hàm lượng acid gallic (mg GAE/g CK nguyên liệu)

C: Nồng độ acid gallic tương đương được tính dựa vào phương trình đường chuẩn (𝜇g/mL) n; Hệ số pha loãng mẫu m: Khối lượng mẫu thí nghiệm (g)

V: Thể tích dịch chiết mẫu (mL)

3.5.2 Phương pháp định lượng tổng hàm lượng flavonoid

Nguyên tắc: Hàm lượng flavonoid tổng được xác định bằng phương pháp đo màu dựa trên nguyên tắc flavonoid tạo phức với dung dịch AlCl3 trong môi trường kiềm như mô tả của Loganayaki Nataraj và cộng sự [97].Sự có mặt của dung dịch NaNO2 khiến các vòng thơm có gốc catechol bị nitrate hóa và sự xuất hiện của ion Al 3+ tạo thành phức Al(III)- flavonoid có màu vàng Khi thêm dung dịch NaOH hợp chất sẽ chuyển sang màu đỏ và độ hấp thụ của chúng đo được ở bước sóng trong khoảng 510 nm [93; 94]

Cách tiến hành: Cho 0,5 mL dịch chiết được trộn với 2 mL nước cất và sau đó với 0,15 mL dung dịch NaNO2 5% Sau 6 phút, thêm 0,15 mL dung dịch AlCl3 10% và để yên trong

6 phút, sau đó thêm 2 mL dung dịch NaOH 4% vào hỗn hợp Ngay lập tức thêm nước cất vào để đạt thể tích cuối cùng là 5 mL, sau đó trộn kỹ hỗn hợp này và để yên thêm 15 phút nữa Độ hấp thụ của hỗn hợp được xác định ở bước sóng 510 nm so với mẫu nước cất đã chuẩn bị Rutin được sử dụng làm hợp chất tiêu chuẩn để định lượng tổng flavonoid Tất cả các giá trị được biểu thị bằng gam rutin tương đương trên một đơn vị khối lượng chất khô nguyên liệu

Rutin lần lượt được pha loãng theo nồng độ 0,25; 0,5; 0,75; 1 (𝜇g/mL) trong nước cất Lấy 0,5 mL dịch chiết pha với 2 mL nước cất và sau đó cho 0,15 mL dung dịch NaNO2 5% Sau 6 phút, thêm 0,15 mL dung dịch AlCl3 10% và để yên trong 6 phút, sau đó thêm 2 mL dung dung dịch NaOH 4% bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 phút và tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 510 nm

TFC (𝑚𝑔 RE/g CK nguyên liệu) = Cx n x V

TFC :Hàm lượng flavonoid tổng số tương đươg hàm lượng rutin (mg RE/g CK nguyên liệu)

C: Nồng độ rutin tương đương được tính dựa vào phương trình đường chuẩn (𝜇g/mL) n: Hệ số pha loãng mẫu m: Khối lượng mẫu thí nghiệm (g)

V: Thể tích dịch chiết mẫu (mL)

3.5.3 Phương pháp xác định hàm lượng chất khô tổng số

Nguyên tắc: Sấy đến khối lượng không đổi theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5610:1991

Cách tiến hành: Chuẩn bị đĩa petri đem đi sấy sau đó cân đĩa, ghi nhận khối lượng (m1) Hút 10mL dịch chiết cho vào đĩa petri Đặt đĩa chứa mẫu vào tủ sấy và tiến hành sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 105 0 C Sau khi lấy mẫu ra khỏi tủ sấy đặt vào bình hút ẩm để làm nguội đến nhiệt độ phòng và cân ghi nhận khối lượng (m2)

Hàm lượng chất khô tổng của mẫu được xác định theo công thức:

E: Hàm lượng chất khô tổng của mẫu (mg/g) m2: Khối lượng đĩa petri chứa mẫu sau khi sấy (mg) m1: Khối lượng đĩa petri đã sấy ban đầu (mg) n: Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu

V: Thể tích dịch chiết mẫu; V= 10 mL

3.5.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa

Nguyên tắc: DPPH là hợp chất có gốc tự do bền màu tím và electron tự do của DPPH với độ hấp thụ mạnh tại bước sóng 515nm Phương pháp ức chế gốc tự do DPPH dựa trên phản ứng khử của DPPH khi phản ứng với các chất chống oxy hóa, tạo sản phẩm khử tương ứng Kết quả sau phản ứng dung dịch chuyển từ màu tím sang màu vàng do số electron tự do đã tham gia phản ứng, làm giảm độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng 515 nm Tóm lại, khi dung dịch DPPH được trộn cùng với dịch trích có tính khử thì DPPH sẽ bị khử thành Diphenylpicrylhydrazine (không còn electron tự do) với sự mất đi màu tím đặc trưng (mặc dù sẽ còn đọng lại màu vàng nhạt trong hỗn hợp dung dịch do còn gốc Picryl) [95] Sự thay đổi màu sắc trên được đo bởi máy đo quang phổ và sử dụng cho việc xác định khả năng chống oxy hóa của hợp chất nghiên cứu

- Chuẩn bị dung dịch DPPH: Hòa tan 0,024g thuốc thử DPPH với methanol, định mức lên 100 ml (1), dung dịch được bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng, nhiệt độ -20 0 C Pha dung dịch DPPH để sử dụng bằng cách hút 10ml DPPH (1) và pha loãng với 45ml methanol sao cho dung dịch có độ hấp thụ quang đạt 1,1 ± 0,02 tại bước sóng 515nm

Khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do của dịch chiết

- Các mẫu dịch chiết được pha loãng ra các nồng độ thích hợp Lấy 0,2ml dịch chiết với các nồng độ pha loãng cho lần lượt vào từng ống nghiệm, bổ sung 3,8ml dung dịch DPPH đã pha sau đó lắc đều Để yên mẫu trong 1,5h ở điều kiện nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng

Tiến hành đo mẫu ở bước sóng 515nm bằng máy đo quang phổ Mẫu đối chứng cũng được thực hiện như mẫu dịch chiết nhưng thay dịch chiết bằng dung môi ngâm chiết

Phần trăm ức chế gốc tự do của DPPH của mẫu được xác định theo công thức:

Khả năng ức chế DPPH (100%) = A o −A m

A0: Độ hấp thu quang của mẫu đối chứng

Am: Độ hấp thụ quang của mẫu thử

- Hoạt độ chất chống oxy hóa tổng số của mẫu thử, E biểu thị bằng mg đương lượng Trolox trên 1g mẫu (mg TE/g CK nguyên liệu) theo công thức

E= 𝑐−𝑏 a x m × 𝑛 × 𝑣 (mg TE/g CK nguyên liệu)

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Ảnh hưởng của các nồng độ dung môi đến hiệu quả trích ly

4.1.1 Hàm lượng polyphenol và flavonoid

Hình 4.1a: Ảnh hưởng của các nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol

Các ký tự abc khác nhau cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p