Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Sự ảnh hưởng của Polyphenol Oxidase lên các hợp chất Phenolic trong các quy trình sản xuất trà Oolong

TÊN DE TÀI: “St ảnh hưởng của polyphenol oxidase lên các hop chất phenolic trong quy trình san xuất trà Oolong” NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:- Khảo sát sự biển động của polyphenol oxidase va các

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Ụ›NGUYEN NGOC TRAM

SU ANH HUONG CUA POLYPHENOL OXIDASELEN CAC HOP CHAT PHENOLIC TRONG QUY

TRINH SAN XUAT TRA OOLONG

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Hoc

Mã số: 604280

Ma học viên: 12310756

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Công trình được hoàn thành tại:- Phòng BioLab 108B2, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Dai hoc Bách Khoa,

Thành phố Hồ Chí Minh- Nhà máy Trà Cầu Tre huyện Bảo Lâm, tỉnh Lâm Đồng.Cán bộ hướng dẫn khoa học: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

TS Huynh Ngọc Oanh

Cán bộ chấm nhận xét 1: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vi và chữ ký)PGS TS Đồng Thị Thanh Thu

Cán bộ chấm nhận xét 2: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vi và chữ ký)TS Lại Quốc Đạt

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Dai học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCMngày 15 tháng 01 năm 2015

Thành phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:(Gh¡ rõ họ, tên, học hàm, họcvị của Hội dong chấm bao vệ luận văn thạc Si)

1 Chủ tich hoi déng —: PGS TS Lé Phi Nga2 Thu ký hội đồng : PGS TS Nguyễn Thúy Hương3 Ủy viên phản biện I : PGS TS Đồng Thị Thanh Thu4 Ủy viên phản biện2_ : TS Lại Quốc Dat

5 Ủy viên hội đồng : TS Hoang Anh Hoàng

CHỦ TỊCH HOI DONG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Ngọc Trâm MSHV: 12310756

Ngày, tháng, năm sinh: 01/04/1989 Nơi sinh: Khánh Hoà

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 604280I TÊN DE TÀI:

“St ảnh hưởng của polyphenol oxidase lên các hop chất phenolic trong quy trình

san xuất trà Oolong”

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:- Khảo sát sự biển động của polyphenol oxidase va các hợp chat phenolic trong

quy trình sản xuât trà Oolong.

- Khảo sát ảnh nhiệt độ tại giai đoạn xào bất hoạt enzyme lên hoạt tính

polyphenol oxidase.- Bước đầu ứng dụng phương pháp xử lý vi sóng trong việc bất hoạt enzymepolyphenol oxidase nhăm trong thu nhận dịch trích ly giàu hợp chất phenolic từ búptra tươi.

II NGÀY GIAO NHIỆM VU: (Ghi theo trong QD giao dé tài): 25/06/2013Ill NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QD giao dé tài):

14/11/2014IV CAN BO HUONG DAN (Ghi rõ hoc hàm, học vi, họ, tên):

TS HUYNH NGỌC OANH

Tp HCM, ngày 26 thang 0T năm 2015

CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

Dau tiên, con xin gửi những lời cảm ơn chân thành nhât đên Ba Mẹ, người đã

nuôi dưỡng, chăm sóc và dạy dỗ con nên người Cảm ơn Ba Mẹ và những người thân

yêu đã luôn động viên, tạo mọi điêu kiện cho con học tập và luôn bên cạnh con trong

suốt thời gian qua

Bên cạnh đó, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Huỳnh Ngọc Oanh đãhết lòng hướng dẫn, tận tình giúp đỡ em về chuyên môn cũng như tinh thần Xin cảmơn PGS TSKH Phan Phước Hiên, người luôn tạo cho em những cảm hứng, cũngnhư ý tưởng dé làm việc và thực hiện dé tài một cách hiệu quả nhất

Xin cám ơn ông Võ Quang Vinh, chú Nguyễn Văn Đức đã tạo mọi điều kiệnvề phương tiện, cùng với sự giúp đỡ của chú Trinh Ngọc Can — Giám đốc Nhà máytrà Cau Tre, anh Mai Việt Hùng — Phó giám đốc, chú Nguyễn Đức Tiến — Phó giámđốc đã rất nhiệt tình hỗ trợ về kỹ thuật cũng như công tác lấy và vận chuyển mẫu từBảo Lộc về thành phố Hồ Chi Minh Đặc biệt, xin gửi lời tri ân đến chú Trần PhướcĐường - Truong xưởng, một người chú, một người cộng sự và là một người thaynhiệt tình, luôn theo dõi từng bước, từng công đoạn thử nghiệm trực tiếp tại Nhàmáy Trà Tuy không phải thử nghiệm nao cũng thành công, nhưng mỗi khi thất bại,chúng em lại có thêm động lực để tiếp tục công việc của mình Xin cảm ơn nhữnganh, chị công nhân tại xưởng trà đã nhiệt tình trợ giúp về kỹ thuật và giải đáp nhiệt

tình những thac mac của chúng em.

Hơn thé nữa, sự thành công của dé tài không thé thiếu sự giúp sức của cácThay Cô trong BO môn Công nghệ sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Truong Daihọc Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về trang thiết bị và giờ làm việcphù hợp nhất cho chúng em Đặc biệt, em xin gửi lời cam ơn chân thành đến cô chủnhiệm PGS TS Nguyễn Thuý Hương Qua những kiến thức cô truyền đạt, những lờigóp ý chân tình cùng tâm huyết của một người thay đã giúp em nói riêng, tập thé lớp

Cao học khoá 2012 nói chung trưởng thành hơn và có được thành công như ngàyhôm nay.

Nguyễn Thị Huế, Dương Thị Thuỷ - lớp Công nghệ Sinh học khoá 2010 đã nhiệttình hỗ trợ chị trong suốt thời gian qua.

Cuỗi cùng, Trâm xin gửi lời cảm ơn đến các thành viên trong Nhóm Trà: ban

Phạm Ngọc Xuân, bạn Huỳnh Thị Phương và các anh, chị lớp Cao học khoá 2012 đã

động viên, khích lệ và giúp đỡ Trâm trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành dé

tài luận án này.

Trân trọng.

TP Hỗ Chí Minh, thang 08 năm 2014

Nguyễn Ngọc Trâm

II

Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu tập trung vào khảo sát sự biến độnghoạt tính polyphenol oxidase và các hợp chất phenolic Đồng thời, qua sự tươngquan giữa hoạt tính enzyme với các hợp chất phenolic trong từng giai đoạn của quytrình sản xuất, giúp ta có cái nhìn chung về vai trò tại từng giai đoạn của enzyme

này.

Sự biến động của polyphenol oxidase (PPO) và các hợp chất phenolic nhìnchung có xu hướng giảm từ giai đoạn tươi đến thành phẩm Cụ thể, hoạt tính PPOhoạt động mạnh tại giai đoạn làm héo (111,89% so với trà tươi ban dau) và các gial

đoạn ủ (108,73% tại giai đoạn ủ 1, 120,19% tại ủ 2 và 109,18% tại ủ 3); giảm tại các

giai đoạn quay thơm (quay thom 1 va quay thơm 2 lần lượt là 96,83% và 106,68%)

Hàm lượng các hợp chất phenolic lại ngược lại: hàm lượng cao tại các giai đoạn lá

trà chịu tac động cơ học (quay thơm, làm héo) Sự biến động ham lượng polyphenol

tổng, tannin tong va tannic acid có su tương dong, hàm lượng dat đỉnh tai giai đoạn

lam héo (12,15% đối với polyphenol tống, 9,39% đối với tannin tổng và 2,66% đốivới tannic acid), sau đó giảm dan đến giai đoạn thành phẩm Hàm lượng các hợpchất màu (TE, TR) cao tại các giai đoạn trước bất hoạt enzyme (vì TF, TR là sanphẩm của quá trình chuyén hóa polyphenol dưới vai trò xúc tác của PPO) và giảm rõrỆt sau giai đoạn xào bất hoạt enzyme (tỉ lệ TF/TR giảm từ 0,059 đến 0,01) Qua đó,có thé kết luận giai đoạn xào bat hoạt enzyme là giai đoạn quan trọng nhất

Từ kết quả khảo sát ban đầu, sự ảnh hưởng của các nhiệt độ bất hoạt enzymekhác nhau lên hoạt tính PPO đã được khảo sát Kết quả cho thấy các mẫu có nhiệt độtừ 180°C đến 310°C có hoạt tính PPO so với đối chứng có sự khác biệt không đángkế (trừ mẫu tại nhiệt độ 150°C) Từ đó có thé kết luận, nhiệt độ từ 180°C đã có thểbat hoạt enzyme PPO

Vi sóng ngày nay đang được ứng dung khá rộng rãi vi tính tiện lợi va tiết kiệmthời gian Nhăm mở rộng tiềm năng ứng dụng vi sóng trong công nghệ sản xuất trà,mô hình tôi ưu các điều kiện trích ly dich trà giàu hợp chat phenolic có hỗ trợ xử lývi sóng đã được thiết lập Với giá tri p<0,0001, giá tri Lack of fit là 0.6376 (>0,05)

lil

PPT (%) = 24,32 + 0,034A + 0,66B — 0,012C + 0,22D + 0,034AB — 7,376x10 AC—~ 1,05AD + 0,025BC + 0,18BD — 0,18CD — 1,57A“ - 1,09BŸ — 0.36C”- 0,32D°Toa độ tâm tối ưu với các thông số như sau:

- Thor gian xử lý vi sóng: 15 giâyTỉ lệ nước/trà: 60 ml/g

- Thor gian trích ly: 40 phút

Nhiệt độ trích ly: 82°C

Ngoài ra, mô hình còn đưa ra một số giải pháp tôi ưu nhăm thích hợp với điều kiệnsản xuất công nghiệp với độ tin cậy là 1

IV

In this study, we focused on the study of the variation in polyphenol oxidaseactivity and phenolic compounds At the same time, through the relationshipbetween enzyme activity and phenolic compounds in each stage of the processing, ithelped us had a general understanding of the role of this enzyme at each stage.

Generally, the influences of polyphenol oxidase (PPO) and phenoliccompounds fell from the fresh to the final product Specifically, the activities of PPOincreased to the withering (111.89%) and the incubation period (108.73% in theincubated 1, 120.19% in the incubated 2 and 109.18% in the incubated 3); decreasedin the rolled stages (96.83% and 106.68% in the rolled 1 and 2, respectively) Theinfluences of the phenolic compounds contents were opposite The influences of thetotal polyphenol, tannic acid and tannin contents were similarities: reached peak atthe withering stage (12.15% of total polyphenol, 9.39% of the tannin and 2.66% ofthe tannic acid contents), then desceased to the final product The high content of thepigment (TF, TR) in the period before the dried stage and markedly reduced after thedried stage (the TF/TR ratio decreased from 0.059 to 0.01) Thereby, it can beconcluded that the dried was the most important stage.

The influence of the different temperature on the PPO inactivation was

investigated The results showed that the PPO activities from 180°C to 310°C werenot significant (except for the temperature at 150°C) The PPO activity was

inactivated above 180°C.

Today, microwave was widely applied because of its convenience and timesavings In order to expand the potential applications of microwave technology, theoptimal model was designed to extract the rich phenolic tea liquids The microwavemethod was used to inactivate the enzyme With the p-value<0.0001, Values of"Prob > F" less than 0.0500 indicate model terms were significant The "Lack of FitF-value" of 0.81 implies the Lack of Fit is not significant relative to the pure error.Final equation in terms of coded factors:

- 1,05AD + 0,18BD + 0,025BC - 0,18CD - 1,57A” - 1,09B° - 0,36C” - 0,32D°

The center optimization parameters were as follows:- Microwave processing time: 15 seconds- The ratio of water/tea: 60 ml/g

- Extraction time: 40 minutes

- Extraction temperature: 82°C

In addition, the model also provided some optimal solutions suited to theconditions of industrial production reliability was 1.

Vi

Tôi tên Nguyễn Ngọc Trâm, học viên cao học chuyên ngành Công Nghệ SinhHọc, khóa 2012, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại học Bách Khoa Tp H6 Chí

Minh Tôi xin cam đoan:

Công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn khoa

học của TS Huynh Ngọc Oanh.

Các sô liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bô ở

các nghiên cứu khác hay trên bất kỳ phương tiện truyền thông nào

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kêt quả nghiên cứu trong luận án tôtnghiệp của mình.

Học viên

Nguyễn Ngọc Trâm

VII

LOI CAM 090

¡900 — ,ÔỎ iii[ph NV võiiaẳaầaaẳẳẳâẳâẳdẳỔỔỶỔỶỒồỒ VvLOI CAM 06990000777 vii

I/19/9800:9M : -:À5À 4 VillM958 /0090000109500.90020225 xi

2.[ Nguyen lIỆU - GG G s1 0 nọ 27

2.2.1 Chuẩn bị mẫu trà ¿- + 2E +SE+E SE ESEEEE SE 315151115151 115 111.111, 272.2.2 Xác định hàm lượng chất khô (HLCK) . 5- 2 555525552552 272.2.3 Khao sát biển động polyphenol oxidase và các hop chat phenolic trongquy trình chế biến trà OolONg cececeecssesessssssesssscssssesessssescssessssesecsesecsssesseseseeens 27

2.24 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ diệt enzyme lên hoạt tính polyphenoloxidase32

2.2.5 Ung dụng xử lý bất hoạt enzyme bang vi sóng và tối ưu hóa điều kiệntrích ly dich trà giàu hợp chat phenolic từ búp trà tươi . . - - 322.3 Xử lý thống kê 2c 2+ Set S1 1 1111211111111 2111151111111 11 111111 ke 33Chương III: KET QUA VA BAN LUẬN 2-5-5652 Se‡ESEkEEEkErkerrrerkerered 343.1 Sự biến đối hình thái của lá trà tại các giai đoạn trong quy trình sản xuất trà

3.2 Khảo sát sự biến động của polyphenol oxidase và các hợp chất phenolictrong quy trình sản xuất trà olOng ¿- ¿5+ 5 2 <+E2EE£EE£EEE£EeEEEESrkrrerkrrerree 363.2.1 Khao sát sự biến động của PPO và độ Am e.eeceeccescsseseseeessesseeesseseseeees 363.2.2 Khảo sát sự biến động của các hợp chất phenolic - -. - 373.3 Mối tương quan giữa hoạt tính polyphenol oxidase với các hợp chất

1519) 21177 4]

3.3.1 Mối tương quan giữa PPO va polyphenol tổng, tannin và độ âm 4]3.1.2 Mối tương quan giữa hoạt tinh PPO, TF/TR, mau tông 42

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính PPO ở giai đoạn diệt men

(xào bat hoạt CNZYME) 77 443.5 Bước dau ứng dụng phương pháp xử lý vi sóng trong việc bat hoạt enzymepolyphenol oxidase nhăm trong thu nhận dịch trích ly giàu hợp chất phenolic từ

IE8¡400/218)11) 20027278 45

3.5.1 Tối ưu hoá đơn yếu tỐ -¿ - + + ®+©£ S2 +E+EE£E#EEEEEEEEEEEEEEErrrrkrrerree 46

Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 2 22+ E+S££E£ E2 E2 xzxzzsersee 544.1 KKẾt luận +: S<SES2 3 E1 15 1215 1151101111111 11511 1.11111111011111 11g %44.2 Kiến nghị 2+: 5< SES* 3 E1 1 1 11 1 151101111111 01511 1.11011110101111 55TÀI LIEU THAM KHẢO - 2-5-2 2 £+<9SE£EEESEEEEEEEEEEEEEEEE122152321 21111 56PHU LUC 1: BANG SỐ LIEU - 2-52 5-52 SE22E SE E2 EEEEEEEEE AE E121 crrrree -1-PHU LUC 2: KET QUA PHAN TÍCH SO LIEU BẰNG STATGRAPHIC -6-PHU LUC 3: KET QUA PHAN TICH HPLCC - 2-5 +5 E+E+EE£EeEsrezvzxd - 13 -TOM TAT LY LICH KHOA HỌCC + +2 +22 +E££E£EE+EE£E£EeEEEErkersrrxee -15-

TF: TheaflavinTR: ThearubiginEGCG: epigallo catechin gallateEC: epicatechin

C: catechinECG: epicatechin gallateDPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylPPO: polyphenol oxidase

POD: peroxidase

PPT: polyphenol tổngSLE: trich ly ran longPLE: trich ly bang cach nén chat longUAE: trích ly có hé trợ siêu âmMAE: trích ly có hỗ trợ vi sóng

XI

Bang | - 1: Phân loại theo đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá -«««<+2 7

Bảng | - 2: Thành phan hoá học của dot trà tươi (tính theo % chất khô) 8

Bang 1 - 3: Tỉ lệ phần trăm khối lượng của các catechin - - 255552552 9Bang | - 4: Thành phan các hợp chat dé bay hơi (hương) của từng loại trà 13

Bảng l - 5: Các hop chất hoá sinh tạo nên mùi hương của trà -. . +: 13

Bang | - 6: Các hợp chất hoá sinh tạo nên màu và vị của trà s-scz+s+s+sssz 15Bang 1 - 7: Các chất được dé nghị thêm vào môi trường dịch trích ly 22

Bang 3 - 1: Kết quả phân tích hàm lượng EGCG trong mẫu trà có và không xử lý vi100 39

Bảng 3 - 2: Mối tương quan giữa TF, TR và hoạt tính PPO 555555: 43Bang 3 - 3: Kết quả thí nhiệm tại nhà máy trà Cau Tre huyện Bao Lâm, tinh Lam900) 51 45

Bảng 3 - 4: Giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố thực nghiệm 48

Bảng 3 - 5: Ma trận thực nghiệm với 4 yếu tố và kết quả thí nghiệm 49

Bảng 3 - 6: Kết quả phân tích ANOVA tôi ưu quá trình tong hợp các yếu tố 50Bảng 3 - 7: Thí nghiệm kiểm chứng - 2 2 5 2s SE+EE£E£EE£Ee£E£EsrEerrkrrersee 53

XI

Hình 1 - 1: Các loại trà phố biẾn -¿- - ©5252 SE S2 £E#E£ESEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrrkrrrred 5Hình 1 - 2: Các bước trong quy trình sản xuất từng loại tr ¿55552552 6Hình 1 - 3: Thành phan polyphenol chính trong tra đen, tra Oolong II

Hình | - 4: Sự hình thành 8-C-ascorbyÏl-(—)-epigallocatechin-3-O-øallate 16

Hình 1 - 5: Cấu trúc của oolonghomobisflavan va dimer không bền EGCG sản xuấtbởi phản ứng với acetaldelhy(d€ << 5+2 119311 99301 9 101g ng ng re 16Hình | - 6: Phan ứng cua theasinensin A với theanine Strecker aldehyde 16

Hình 1 - 7: Su chuyén hoá catechin va sự hình thành TF, TR dưới tác dụng cuaenzyme polyphenol OXidAaSE - <5 563 19.01 TH ve 18Hình 1 - 8: Cơ chế phan ứng của tyTOSiIASe ¿2+ 5-5255 SE E2 EEEeEeErrererrered 20Hình 1 - 9: Cơ chế phản ứng catechol Oxidase ¿5-2 52252 2S £££EszEvrsrxered 21Hình 1 - 10: Cơ chế phan ứng laccase c.ccccccescssessssessssscsessessssesssscsscsesesessssessesessceseans 21Hình 2 - 1: Quy trình phân tích các chỉ tiêu TF, TR và màu tổng . 29

Hình 3 - 1: Hình thái lá trà ở từng giai đoạn chế bién trà Oolong . 34

Hình 3 - 2: Đồ thị biến động polyphenol oxidase trong quy trình sản xuất trà KimTUYEN OOlONG 11777 — 37

Hình 3 - 3: Mối quan hệ giữa ham lượng TF/TR và màu tống - - 38

Hình 3 - 4: Anh hưởng của vi sóng lên hoạt tinh PPO va polyphenol tông 40

Hình 3 - 5: Đô thị biến động các hợp chất phenolic trong quy trình sản xuất trảOOlONG 1177 40

Hình 3 - 6: Anh hưởng của thời gian xử lý vi sóng lên hàm lượng PPT 46

Hình 3 - 7: Sự ảnh hưởng của tỉ lệ nước/trà lên hàm lượng PPT' - 46

Hình 3 - 8: Sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly lên hàm lượng PPT 48

Hình 3 - 9: Ảnh hưởng của thời gian trích ly lên hàm lượng polyphenol tống 48

Hình 3 - 10: Bề mặt đáp ứng của từng cặp yêu tố ảnh hưởng lên hàm lượng PPT 51

XI

1 Đặt van đềPolyphenol oxidase là enzyme oxy hóa khử sẵn có trong lá trà Nó đóng vai tròquan trọng trong việc hình thành màu sắc và hương vị đặc trưng của trà lên men nói

chung, trà Oolong nói riêng Sự khác nhau trong hoạt động của polyphenol oxidase

sẽ cho các sản phẩm trà khác nhau Cụ thể, polyphenol oxidase có tác dụng chuyểnhóa catechin thành theaflavin và thearubigin Theaflavin có mảu vàng cam, góp phần

quan trọng trong việc hình thành độ sáng của trà Ngược lại, thearubigin có mau nau

đỏ, góp phan trong việc hình thành mau tổng của tra Sự hoạt động khác nhau củapolyphenol oxidase dẫn đến sự hình thành theaflavin và thearubigin trong từng loại

trà khác nhau Và giai đoạn lên men là giai đoạn quan trọng cho sự hình thànhthearubigin và theaflavin.

Dựa vào mức độ lên men, trà có thé được chia làm 3 loại: tra xanh (không lênmen), tra Oolong (lên men ban phan) và trà đen (lên men hoàn toàn) Theo thống kêcủa Wu va Wei (2002), tra đen chiếm khoảng 78% tong lượng tiêu thu trà trên thé

giới, trong khi đó, sự tiêu thụ trà xanh chỉ khoảng 20% và trà Oolong khoảng 2% Vi

sản lượng tiêu thụ trà Oolong khá ít nên số lượng nghiên cứu về loại trà này khôngnhiều Và hau như không có nghiên cứu nào về sự biến đổi hóa hoc, enzyme trongquy trình sản xuất trà Oolong Vì vậy, nhóm nghiên cứu đã thực hiện đề tài “Sự ảnhhưởng của polyphenol oxidase lên các hợp chất phenolic trong quy trình sản xuất tràOolong” dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Huỳnh Ngọc Oanh, cô van khoa hocPGS TS Phan Phước Hiên và sự hỗ trợ kỹ thuật của Nhà máy trà Cau Tre

2.C cnghiéne utrongv ngo inư c

Với những lợi ich và tác dụng trên, tra đã trở thành đối tượng nghiên cứu của

các nhà khoa học trong và ngoài nước Có thê chia thành các nhóm nghiên cứu sau:Nh m nghiên c uv dctnh,c cth nhph nc trongl tr : Roberts, E A.

H là người đầu tiên nghiên cứu về những hợp chat flavonoid trong trà lên men bangquang pho [1] hoặc sac ký giấy vào những năm 1960 [2] Thearubigin được xác địnhnhư là một tiền t6 của anthocyanidin vào năm 1969 [3] Năm 1983, sự hình thành

Sự giảm hàm lượng thearubigin và theaflavin trong dịch chiết trà đen đã được nghiêncứu vào năm 1996 [6] Năm 2006, Jen-Kun Lin va cộng sự đã khảo sát về catechin,gallic acid, và methylxanthines trong trả xanh, trà oolong, tra đen va trà Phố Nhĩ [7].Năm 2007 có 69 nghiên cứu về các hợp chất catechin từ trà xanh, 74 nghiên cứu vềepigallocatechin gallate (EGCG), 8 nghiên cứu về epicatechin va epicatechin gallate(ECG), 8 nghiên cứu về theaflavin va thearubigin từ tra den theo thông kê của Guptava cong su (2008) Su hinh thanh thearubigin trong tra den co lién quan dén su giamhàm lượng của các hợp chat catechin vào năm 2009 [8] Có thé nói, những nghiêncứu về trà cảng lúc càng nhiều giúp làm rõ thêm về tác dụng của từng loại hợp chấtpolyphenol trong trả và giúp giải thích nguyên nhân trà xanh lại được tiêu thụ nhiềunhất trên toàn thé giới [9].

Nh m nghiên c uv sự ho td ng của enzyme oxy h akh lên chất lượngcủa trả lên men, đặc biệt là trà đen G W Sanderson đã nghiên cứu sự thay đối tronghoạt tính của enzyme polyphenol oxidase trong lá trà xanh trong điều kiện bảo quảnsau thu hoạch vào năm 1964 [10] Nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạttính của enzyme trong suốt quá trình lên men trà công nghiệp do John B Cloughley

thực hiện vào năm 1980 [11] Năm 1990, nghiên cứu ảnh hưởng của enzyme

polyphenol oxidase và hàm lượng polyphenol của búp trà lên chất lượng trà đen do

Thanaraj, S5 N S thực hiện [12] Nam 1993, Pradip K Mahanta va cộng sự nghiên

cứu sự thay đôi hoạt tính của polyphenol oxidase và peroxidase và hợp chất tạo maucủa trà đen lên men công nghiệp [13] Năm 1998, nghiên cứu về đặc tính và khảnăng tách chiết enzyme polyphenol oxidase trong lá trà xanh n Độ được thực hiệnbởi Jyotsnabaran Halder và cộng sự [14] Năm 2010, những biến động thành phan

hoá hoc và hoạt tính polyphenol oxidase trong quá trình bao quản lạnh do Hiilya

Olmez thực hiện [15] Nghiên cứu động học bất hoạt polyphenol oxidase vàperoxidase bởi nhiệt độ dựa trên hàm lượng chất khô các hợp chất phenolic trong lá

và hoạt tính sinh học của chúng năm 2012 [16].Bên cạnh những nghiên cứu ngoài nước, trong nước cũng có những nghiên cứuvê trà Nôi trội là Vũ Hông Sơn và Hà Nguyên Tư nghiên cứu về các yêu tô ảnh

và nghiên cứu về trích ly polyphenol từ búp trà xanh có hỗ trợ vi sóng [20] Ảnhhưởng của quá trình làm héo nhẹ đến chất lượng nguyên liệu và sản phâm chè xanhcủa Ngô Xuân Trường và cộng sự [21] Hiện nay, trong nước vẫn chưa có nghiêncứu về sự biển động của polyphenol oxidase trong quy trinh sản xuất trà Oolong.Đồng thời, những nghiên cứu về ứng dụng vi sóng vào công nghệ sản xuất trà cònhạn chế Việc hiểu rõ những tính chat enzyme polyphenol oxidase sẽ góp phan nângcao hiểu biết về enzyme nay và khai thác chúng trong quá trình chế biến tra thànhphẩm.

3 MỤC TIỂU NGHIEN CUKhảo sát sự biến động của polyphenol oxidase và các hợp chất phenolic trongquy trình sản xuất tra Oolong Từ đó đưa ra mối tương quan giữa các đại lượng này

Khao sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme polyphenol oxidase.

Ứng dụng xử lý nguyên liệu bằng vi sóng trong công nghệ sản xuất trả.4 NỘI DUNG NGHIÊNC U

- Khảo sát sự biến động của polyphenol oxidase trong quy trình sản xuất tra Oolong

- Khảo sat ảnh hưởng của vi sóng lên hoạt tinh polyphenol oxidase

- Khảo sát sự biến động của các hop chất phenolic trong quy trình sản xuất tra

Oolong.

- Ứng dụng xử lý bat hoạt enzyme băng vi sóng và tôi ưu hóa điều kiện trích ly dichtrà giàu hợp chất phenolic từ búp trà tươi

5 PHAM VINGHIENC UĐề tài chú trọng nghiên cứu sự biến động của polyphenol oxidase trong các giaiđoạn sản xuất trà và mỗi tương quan giữa hoạt tính polyphenol oxidase lên hàmlượng polyphenol tổng số, tannin, theaflavin và thearubigin

Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ diệt enzyme lên hoạt tính của polyphenoloxidase.

hình tối ưu hóa điều kiện trích ly dich tra giàu hợp chat phenolic từ búp tra tươi.7 NGHĨA KHOA HỌC, T NH THỰC TI NCUADET I

Khảo sát sự biến động của polyphenol oxidase và các hop chat phenolic trongcác giai đoạn của quá trình sản xuất trà giúp khoanh vùng các giai đoạn ảnh hưởngnhiều nhật lên hoạt tính polyphenol oxidase Qua đó cho thay được mối quan hệ giữapolyphenol oxidase với các hợp chất phenolic nảy

Xây dựng mô hình đáp ứng bề mặt băng phần mềm quy hoạch thực nghiệmDesign Expert 9.0 nhằm tối ưu điều kiện trích ly dịch trà giàu hợp chất phenolic từ

búp trà tươi.

Chương I: TONG QUAN

1.1 Tra

Trà là loại nước uống b6 dưỡng, chứa nhiều hợp chat polyphenol có lợi cho sứckhỏe Trong đó, hai nhóm polyphenol quan trọng phải kế đến, đó là theaflavin vathearubigin Theo Francis Muigai Ngure và cộng sự (2009), chất lượng trả đen phụthuộc vào hàm lượng theaflavin tổng và theaflavin digallate Theaflavin quyết địnhđộ nén (độ chặt), độ sáng, màu, sự tạo bọt và thearubigin liên quan đến độ đậm vàmau của tra đen [12, 22, 23] Theaflavin là sản phẩm của quá trình oxi hóa hop chat

catechin dưới xúc tac của enzyme polyphenol oxidase (PPO) Trong quá trình xúctac phan ứng, H;O; được sinh ra Luc này, peroxidase (POD) sẽ tham gia phản ứng

chuyển hóa theaflavin thành thearubigin [8, 24] Tuy nhiên, cơ chế chuyển hoá qualại giữa theaflavin và thearubigin dưới sự xúc tác cua PPO va POD vẫn còn là mộtAn sô [25]

1.1.1 Phân loại theo kiểu lên menDựa vảo quy trình sản xuất từng loại trà khác nhau trà được phân thành 2 nhómchính: Trà lên men va trà không lên men Trong đó, tra xanh, tra trang là nhóm trakhông lên men Tra Oolong là trà lên men 1 phan va tra đen là tra lên men hoàn toản

GVHD: TS Huynh Ngọc Oanh 5

Trong đó, A là trà xanh, B là trà vàng, C là trà Oolong, D là trà đen (hay còngọi là hông trà).

Làm héo Dao tron Say

Hình 1 - 2: Các bước trong quy trình sản xuất từng loại trà [26]Qua hình 1 - 2 giúp ta hình dung cụ thé hơn về quy trình sản xuất công nghiệpcủa từng loại trà khác nhau từ trà trăng đến trà đen Trong đó, trà đen CTC (Crush,Tear, Curl) là một phương pháp chế biến trà đen tương tự như quy trình sản xuất tràđen truyền thống Tuy nhiên trước giai đoạn lên men, lá trà được qua công đoạn cắt,xoăn và cuộn tron Phương pháp này ngày nay được sử dụng khá rộng rãi Trà PhốNhĩ cũng được sơ chế theo phương pháp này trước khi tiễn hành lên men ủ đống

1.1.2 Phân loại theo đặc điểm hình th i, sinh lý, sinh hoDựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá, người ta phân trà thành 4giống trà cơ bản: trà Trung Quốc lá nhỏ, Trung Quốc lá to, tra Shan và trà n Độ.Trong đó, giống trà Trung Quốc lá nhỏ được dùng sản xuất trà Oolong vì đặc điểmcau trúc vách lá khá dẻo dai Khi ở độ âm khoảng 35-45%, lá có thé được vò tạo hìnhthành những viên tròn mà không bị nát hoặc gãy vụn Giống trà Shan tuyết thườngđược sử dụng dé sản xuất trà Phổ Nhĩ bởi đây là giống trà cô thụ Hiện nay, giống trànày được trông nhiều ở tỉnh Hà Giang, Việt Nam

Bang 1 - 1: Phân loại theo đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá

Phân Trung Quoc la Trung Quốc lá Shan Án Độ

loại nhỏ toTha Bui, thap, phan Gỗ, nhỏ, cao tới | Gỗ, cao từ 6 đến | Gỗ cao tới 17 m,

4 Í cành nhiều 5m 10m canh thua

Nho, day nhiều | To, dai 12 - 15|To và dai 15 - 18 | Dài tới 20 - 30

gon sóng, màu |cm, rộng 5 - 7|cm màu xanh |cm, mỏng, mém,

Lá xanh đậm, lá dài |cm, xanh nhạt, |nhạt, dau lá dài, | màu xanh đậm,

35-6 5cm bóng, dau lá nhọn | rang cưa nhỏ và |hình bâu dục,

dày phiên lá gợnsé 6 - 7 đôi gân lá |S - 9 đôi, gan la} 10 đôi gan lá 12 - 15 đôi gân lá

° không rõ, rang | rõsan cưa nhỏ, không

lá A

déu.

Kha nang chiu rét | Nang suất cao.| Chiu duoc âm, Không chiu được

ở độ nhiệt -12°C | Phâm chat tôt âm, ở địa hình | rét hạn.

Đặc den -15°C cao Nang suat, pham

diém Năng suat cao, | chat tot

pham chat totnhat

1.1.3 Th nh phan ho họcThanh phan hóa học của lá tra đã được nghiên cứu kỹ lưỡng Các thành phanchính thuộc nhóm polyphenol chiếm 25-35% trên trọng lượng khô Ngoài ra, trảcũng chứa các thành phan hóa học khác nhau bao gồm methylxanthine, aminoacid,

chất diệp lục, carotenoid, chất béo, carbohydrate, vitamin và hơn 600 hợp chat débay hoi.

Các flavanol chủ yếu là quercetin, kaempferol, myrecetin va glycoside Trongtrà den, quá trình oxy hóa polyphenol dẫn đến sự hình thành các catechin va phức

acid gallic như theaflavin, acid theaflavinic, thearubigin hoặc theasinensis và

polymer proanthocyanidin Methylxanthine chiếm 2-4% gồm caffeine và một lượngnhỏ theophylline và theobromine Trà chứa nhiều aminoacid, nhưng theanine là chủyếu, chiếm 50% tổng số aminoacid Các aminoacid bi phân huy trong quá trình lên

men để hình thành hương trà Chất diệp luc, carotenoid, chất béo va các hợp chất dễ

bay hơi tuy không phải là thành phan chính trong nước trà nhưng nó đóng vai trò

GVHD: TS Huynh Ngọc Oanh 7

quan trọng trong sự hình thành hương thơm Hương thơm của trà đã được nghiên

cứu một cách chi tiết và có hơn 600 các phân tử khác nhau đã được phân lập [27,28] Chúng bao gồm các terpenoid, các sản phẩm của quá trình phân giải aminoacid,

carotenoid và acid linoleic Mặt khác, trà còn chứa các carbohydrate, vitamin E, K,A, lượng ít vitamin B và vitamin C (chi có trong trà xanh) Ngoài ra, trà cũng cungcap các ion kali, mangan và flo.

Bang 1 - 2: Thanh phan hoá học cua dot tra tươi (tinh theo % chat khô) [29, 30]Nhóm hợp chat Tên từng loại hợp chất % Khối lượng khô

Acid Aminoacid 2-4

Acid hữu cơ 0,5 -2

Chat khoang Chat khoáng không hoa tan 15-3

Chat khoang hoa tan 2-4

Saccharide Carbonhydrate 3-5

Cellulose 6-8Polysaccharide 4-10

Polyphenol/Flavonoid | (-)-EC 1-3

(-)-ECG 2-4(-)-EGC 4—7(-)-EGCG 9-14

(-)-GC 1-2(+)-C 05-1Flavonol glucoside 3-4Minor Catechin 04-1Proanthocyanindin 2-3

Những hop chat khác | Caffeine 3-4

Hop chat mau (pigment) 0.5— 0,8Hợp chất màu không tan 0,5

Lignin 4-6Lipids 2-4Saponin (),04 — 0,07Vitamin 06-1

Hop chat dé bay hoi 0,01 — 0,02

1.1.3.1 Polyphenol

Các polyphenol trong trà gồm sáu nhóm: các hop chất của flavanol,

anthocyanin, hydroxyl-4-flavanol, flavon, flavonol va acid phenolic Polyphenoltrong tra quan trong va đặc trưng là flavanol Trong đó, catechin (flavan-3-ol) là

quan trọng nhất Các loại catechin thường gặp: (-)-epicatechin (EC), (-)-epicatechin

gallate (ECG), (+)-catechin (C), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epigallocatechin

gallate (EGCG) và (+)-gallocatechin (GC) Những hợp chat nay đóng góp tạo nên vicay đăng, chát và dư vị ngọt của trà.

Bảng | - 3: Tỉ lệ phan trăm khối lượng của các catechinNhững hợp chất catechin Viết tat % khôi lượng catechin

(+)-Catechin (+)-C 3(-)-EpIcatechin (-)-EC 14(-)-EGC-3-O-p-coumarate

(-)-EC-3-O-cinnamte(-)-Epigallocatechin (-)-EGC 4A(+)-Gallocatechin (+)-GC

)H OH

OH OH| | OH

Sy “Ny, Sy Wy “nyÌ “O ie) OH )

OH A Hy OH a Z OH

O OH

| OH OH OHOH OH OH(-)-Epicatechin gallate (ECg) (-)-Epigallocatechin gallate(EGCg) (-)-Gallocatechin gallate(GCg)

GVHD: TS Huynh Ngoc Oanh 9

3 | H H OH G H 11 |OH H H

4] H H OH 3MeG H 2|OH G H5s |OH H OH H HU l3|OH G G

Cx HOW a On w

OH

R, R, R, Ry R, Ry Ryi6|/ H H H H ISÍH H H20 |OH OH H H 23 |OH OH H2 [|OH OH HG 24|OH OH G22] 0H OH G G 30] H OH H261 H OH H G 31] H OH G27 H OH G G 32 | OH H H

2 | OH H HỆ G22 }0H H G G

(C) Chalean-flavan dimers

ÉXY~ ` 47|H H

HO # \ 5 OH 48 | H G

49 G GHO Z | oO —— OH

GVHD: TS Huynh Ngọc Oanh II

tiêu để đánh giá chất lượng theo mùa của trà đen Như vậy, phân tích các hợp chấtpolyphenol trong trà là một phương pháp hiệu quả để xác định chất lượng trà.

1.1.3.2 Hương, vị và màu sắc của trà

Nước trà được pha từ các loại trà khác nhau có màu sắc, hương vi và mùi thơm

đặc trưng riêng Nó được hình thành trong quá trình sản xuất Nguyên liệu trà đượcsử dụng thường là chổi non (búp) và hai chi lá liền kẻ, dân gian thường gọi với cáitên là 1 tôm, 2 lá Trong dot trà tươi chứa một lượng lớn các hop chất không bay hơi;polyphenol, flavonol glycoside và flavonol, flavon, acid phenolic, aminoacid, chấtdiệp luc và các chat màu khác, carbohydrate, acid hữu cơ, caffeine và các alcaloidkhác, khoáng chất, vitamin và enzyme Sự khác biệt về màu sắc, hương vi và mùithơm của các loại trà lên men và không lên men được gây ra bởi quá trình sản xuất

a) Hương thơm

Hương thơm là yếu tố quan trọng đầu tiên trong cảm quan trà, nó quyết địnhmức độ ưa chuộng của loại trà đó Từ cuối những năm 30 của thé ky XIX, nhữngnghiên cứu về hương thom đã xuất hiện [34, 35] Từ năm 1960, khi sac ký khí đãđược sử dụng rộng rãi, đặc biệt là khi các kỹ thuật cột mao quản ra đời đã đánh dấubước phát triển lớn về lĩnh vực nghiên cứu hương thơm Những tiễn bộ to lớn trongsắc ký khí và sắc ký khí ghép khối phô đã giúp các nhà khoa học rất nhiều trong việcnghiên cứu hương thơm trà Tất cả các số liệu báo cáo cho đến nay cho thây hơn 630hợp chat tạo nên hương thơm tra đã được báo cáo Mục tiêu chính trong nghiên cứuhương thơm là để xác định thành phan chủ yếu tạo nên hương thơm đặc trưng củatrà Nhiều nỗ lực đã được thực hiện dé tìm kiếm các hợp chất quan trọng cho hươngvị của trà [36-38] Tuy nhiên, các nhà khoa học không phát hiện được hợp chất haynhóm các hop chất duy nhất nào quyết định toan bộ hương vi tra Họ đưa ra giả

thuyết các đặc tính của các loại trà là một sự cân băng của một hỗn hợp rat phức tap

các hợp chat thơm trong trà (Bang 1 - 4 và 1 - 5) Những nghiên cứu về hương thom

trà đã được xem xét trong một loạt các bao cáo của Venkata (2011); Yamanishi(1995, 1996), Takeo (1996), Kawakami (1997) [30, 39].

Bang 1 - 4: Thanh phan các hợp chat dé bay hơi (hương) của từng loại trà

Retention time Compound White tea (n= 8) Green tea (n= 27) Oolong tea (n= 27) Blacktea (n= 15) Puer tea (n= 10)3.15 1-Penten-3-ol 1.68 + 0.93a* 0.20 + 0.21c 1.16 + 1.12ab 0.94 + 0.43b 0.34 + 0.20c

3.34 Pentanal 2.44 + 0.39a 0.37 + 0.18c 0.49 + 0.29c 0.71 + 0.25b 0.33 + 0.21c

4.79 (Z)-2-Penten-1-ol 0.59 + 0.35a 0.09 + 0.11b 0.68 + 0.53a 0.77 + 0.49a 0.17 + 0.04b

5.60 Hexanal 49.13 + 40.15a 0.63 + 0.62b 2.25 + 1.26b 12.05 + 5.29a 1.60 + 0.76b7.56 (E)-2-Hexenal 15.68 + 9.65a 0.15 + 0.15b 0.46 + 0.32b 16.88 + 12.40a 0.47 + 0.20b

7.69 (Z)-3-Hexen-1-ol 3.79 + 2.33a 0.33 + 0.19c 0.64 + 0.78c 1.35 + 0.83b 0.01 + 0.02c

9.76 Heptanal 1.82 + 0.69a 0.59 + 0.40b 0.25 + 0.09c 0.58 + 0.19b 0.30 + 0.09c10.24 (E,E)-2,4-Hexadienal Ob Ob Ob 0.21 + 0.22a Ob13.00 Benzaldehyde 5.34 + 1.89a 0.36 + 0.47d 0.76 + 0.70cd 1.87 + 0.97b 1.07 + 0.6ác13.30 5-Methyl-2-Furancarboxaldehyde 0a 0a 0.05 + 0.14a 0.05 + 0.04a 0.05 + 0.07a14.73 6-Methyl-5-Hepten-2-one 0.64 + 0.40a 0.05 + 0.11b 0.53 + 0.45a 0.26 + 0.15b 0.16 + 0.09b14.95 2-Pentyl-Furan 1.74 + 0.684 0.11 + 0.1ác 0.49 + 0.33b 0.51 + 0.35b 0.18 + 0.13c15.70 Octanal 0.34 + 0.11a 0.08 + 0.06b 0.10 + 0.07b 0.11 + 0.06b 0.07 + 0.06b16.19 (E,E)-2,4-Heptadienal 0.16 + 0.12b 0.05 + 0.05b 0.27 + 0.22b 0.51 + 0.49a 0.71 + 0.46a

17.81 Benzyl Alcohol 3.33 + 2.38a 0.13 + 0.12b 0.46 + 0.39b 0.53 + 0.62b 0.03 + 0.09b

18.37 Benzeneacetaldehyde 4.02+2.76abc 0.18 +0.17c 5.27 +9.21ab 6.05 + 4.32a 0.93 + 0.64bc

20.32 Linalool oxide | (trans, Furanoid) 5.49 + 5.64a 0.30 + 0.24d 2.69 + 1.77bc 3.57 + 4.02ab 1.11 + 0.78cd21.51 Linalool oxide Il (cis, Furanoid) 13.12 + 17.87a 0.48 + 0.41c 1.43 + 1.56c 6.30 + 6.92b 1.61 + 1.3%c

30.52 fi-Cyclocitral 0.22 + 0.20bc 0.04 + 0.08d 0.50 + 0.24a 0.32 + 0.23b 0.13 + 0.11cd33.08 (E)-Geraniol 8.54 + 11.01a 2.43 + 2.05b 1.89 + 2.50b 7.21 + 12.05a 0.10 + 0.14b

35.50 Indole 0.16 + 0.14b 0.12 + 0.15b 8.18 + 7.56a 0.04 + 0.10b 0.07 + 0.16b

37.00 1,2,3-Trimethoxybenzene Ob Ob Ob Ob 2.34 + 2.00a

41.22 (Z)-Hexanoic acid 3-hexenyl ester 0b 1.05 + 0.96a 0.95 + 1.12a 0.16 + 0.23b Ob41.57 Hexanoic acid hexyl ester Ob 0.04 + 0.04b 0.38 + 0.46a 0.05 + 0.08b Ob42.03 (E)-Hexanoic acid 2-hexenyl ester 0b 0.09 + 0.09b 0.19 + 0.19a 0.07 + 0.10b 0b42.34 (Z)-Jasmone 0.71 + 0.58b 0.48 + 0.33b 1.72 + 2.16a 0.23 + 0.32b 0b44.10 a-lonone 0.23 + 0.22a 0.02 + 0.03b 0.18 + 0.13a 0.22 + 0.21a 0.20 + 0.13a

45.67 (E)-Geranylacetone 0.42 + 0.46a 0.05 + 0.09b 0.33 + 0.19ab 0.46 + 0.73a 0.20 + 0.21ab47.70 f-lonone 2.40 + 1.92a 0.19 + 0.23c 1.33 + 1.00b 1.29 + 1.02b 0.67 + 0.42bc

49.28 +-Farnesene 0b 0.15 + 0.11b 3.02 + 3.58a 0.05 + 0.08b 0b

52.25 (E)-Nerolidol 0.51 + 0.36b 1.14 + 1.48b 22.03 + 20.90a 1.34 + 2.01b 0.32 + 0.45b52.69 (Z)-3-Hexen-1-ol-benzoate 0b 0.03 + 0.06b 0.47 + 0.38a 0.07 + 0.14b 0b54.34 Cedrol 0.94 + 1.01a 0.10 + 0.08b 0.10 + 0.14b 0.53 + 0.90a 0.64 + 0.71a

57.30 Methyl jasmonate Ob Ob 0.50 + 0.53a Ob Ob64.66 6,10,14-Trimethyl-2-Pentadecanone 0.69 + 0.65a 0.02 + 0.04c 0.32 + 0.26b 0.33 + 0.46b 0.28 + 0.46bc

phenyl! ethanol Ngot cua trai cay (fruity)

- Trans-2-hexenal, n-hexanal, cis-3-hexenol,grassy, B-lonone Huong tuoi (fresh flavor)

Nhin chung, cac hop chat nerolidol, indole, benzeneacetaldehyde, linalool,linalool oxide, hexanal, benzyl nitrile, (E)-geraniol và 1-penten-3-ol chiếm tỉ lệ cao

GVHD: TS Huynh Ngoc Oanh 13

trong trà Oolong (Bảng I — 4) Các hợp chat này cùng với methyl salicylate, methyljasmonate, phenylethyl alcohol, benzyl alcohol, B-ionone là những thành phan chínhtao nên hương hoa của tra Oolong Nông độ lớn của chúng trong tra Oolong có théđược hình thành trong quá trình sản xuất Trong đó, quá trình thuỷ phân mạnh mẽ

glycoside và primeveroside nhờ sự xúc tác của enzyme f-glucosidase

primeverosidase Một số hợp chất được tạo ra do nhiệt độ cao Ví dụ:

3,7-dimethyl-1,5,7-octatrien-3-ol, 2,5-dimethyl pyrazine va 5-methyl-2-furancarboxaldehyde có

mùi nướng (toasted flavor), chúng là các sản phẩm từ các aminoacid va đường được

hình thành do nhiệt độ cao [40].

b) Vị

Vị của thực phẩm chủ yếu gồm năm thành phan cơ bản: ngọt, chát, chua, đăngvà umami Một tach trà ngon là một sự cân băng hai hoà của những vi khác nhau VỊchát gây ra một cảm giác se hoặc thô trong miệng, lưỡi Vị cay, đăng thường khóchịu, được cảm nhận chủ yếu ở phía sau cùng hai bên lưỡi Vi umami là vi ngọt đượctạo nên từ các aminoacid như glutamate Các hop chất tạo ra vị umami thường cótrong thực phẩm lên men Các dẫn xuất gallate của flavonol có vị chát và cay đăng.Trong số các theaflavin (TF) và dẫn xuất của chúng, theaflavin ít có vị chat nhất Sựcó mặt của di- và monogallate của theaflavin cho vi chát lần lượt là 6,4 và 2,2 lầncủa theaflavin VỊ ngọt thanh và mùi thơm đặc trưng đã tạo nên chất lượng trà Các

hương vi cua trà Oolong phụ thuộc vào quá trình lên men Hàm lượng TF trong tra

Oolong rất thấp hoặc gần như không có Ngay cả trong trà Oolong lên men quá mức,hàm lượng TE chỉ băng một phần mười so với trà đen Tuy nhiên, thearubigin (TR)

lai được hình thành thông qua quá trình oxy hóa của EGC và EGCG [8, 9, 24, 30,41-44].

Ngoài ra một số các hợp chat polyphenolic thứ cấp như oolonghomobisflavane,đến theasinensine và oolongotheanine cũng tạo nên hương vị riêng cho trà Oolong.Do đó, vị ngọt thanh và mùi thơm đặc trưng của trà Oolong là những vị tổng hợp củacác catechin không bị oxy hóa, TR, một số hợp chất polyphenolic thứ cấp, caffeine,aminoacide tự do và đường Vị chát của trà Oolong thường thấp và ngọt hơn của tràxanh Hiện nay, các hợp chất có liên quan vẫn còn đang được nghiên cứu

c) M usắcMau sắc nước tra là chỉ tiêu quan trọng thứ ba bên cạnh mùi thom va hương vi.

Trà Oolong thường có màu vàng ánh xanh hoặc vàng đậm Flavonol, flavon và một

lượng nhỏ TE và TR là những thành phần tạo nên màu sắc đặc trưng của trà Oolong

Nó là màu trung gian giữa trà xanh và trà đen Hàm lượng TF trong trà Oolong lên

men chỉ băng một phần mười ham lượng TF trong trà đen [45] Ngoài ra, một số hợpchất homobisflavin như oolonghomobisflavin A, B, theasinensin D, E, F, G vaoolongthenin cũng góp phan tao nên màu sắc của tra Oolong (Bang 1 - 6)

Bang | - 6: Các hợp chất hoá sinh tạo nên màu và vị của trà [20]Hợp chất Vi Hop chat Mau

Polyphenol Chat Theaflavin Vang nauAminoacid Hau vi ngot Thearubigin Nau do

Caffeine Dang Flavonol glycoside Vang sang

Theaflavin Chat Pheophorbide Hoi nauThearubigin Chat nhe Pheophytin Hoi den

Carotene Vang

1.1.4 Những biến đổi trong quá trình lên men traTrong quá trình lên men trà, cầu nối giữa các catechin vòng A với các hợp chấtcacbonyl sẵn có được hình thành 8-C-Ascorbyl-(-)-epigallocatechin-3-O-gallate lầndau tiên được phân lập từ tra Oolong (Hình I - 4) [46] Hợp chất nay là một sanphẩm của sự bắt cặp giữa EGCG và acid dehydroascorbic

Ngoài ra, các dimer giữa EGCG với các formaldehyde cũng được tìm thấytrong tra Oolong và có tên là oolonghomobisflavan Thông thường, liên kết C-C giữacác aldehyde và vòng A là không bên vi sự thay thé ái nhân tai methine hoặcmethylene carbon giữa hai nhóm phenyl dễ dang xảy ra Oolonghomobisflavan(Hình 1 - 5) bền hơn so với các sản phẩm dimer EGCG-acetaldehyde tương tự

Cac aldehyde còn được tạo thành từ các aminoacid thông qua hiệu ứng Strecker

(là phản ứng hóa học trong đó một a-aminoacid được chuyến hoá thành một

GVHD: TS Huynh Ngọc Oanh 15

aldehyde nhờ một imine trung gian Nó được đặt tên sau khi Adolph Strecker, mộtnhà hóa học người Đức).

O O

“O-G Ine OH ` OH

OH HO 2 HO 4

O-G OH O-G OH

oolonghomobisflavan A oolonghomobisflavan B dimer obtained by condensation

with acetaldehyde (unstable)

Hình 1 - 5: Cau trúc của oolonghomobisflavan va dimer không bền EGCG sản xuất

bởi phản ứng với acetaldehyde |47|

Trà còn chứa một aminoacid riêng là L-theanine (5-N-ethylglutamine) chiếmhơn 50% tổng hàm lượng aminoacid có trong lá Hàm lượng theanine giảm trongsuốt quá trình lên mén trà Các quinone catechin có thé phản ứng với aminoacid va

tạo ra các Strecker aldehyde [47].1.1.5 Công dụng của tr

Theasinensin là hợp chất polyphenol được hình thành trong quá trình lên men.Một vài nghiên cứu chỉ ra rằng theasinensin A trong trà Oolong có khả năng chốngsự oxy hoá của lipid, sự già hoá của tế bào U937 ở người Tuy nhiên, cấu trúc trungtâm phản ứng và cơ chế hoạt động vẫn chưa được tìm hiểu rõ [48] Các hợp chấtepigallocatechin gallate (EGCG) có khả năng giảm nguy cơ mac bệnh ung thư [49]

Hoạt tính chống oxy hóa trong trà chủ yếu là do các hợp chat polyphenol, đặcbiệt là catechin và gallic acid Trong số các catechin, EGCG có hoạt tính mạnh nhất,nó có thể tạo phức với các I1on kim loại và vô hiệu hóa hoạt động các sốc hóa học tựdo gây bệnh Các polyphenol có tác dụng bảo vệ các noron thần kinh chống lại bệnh

Paskinson.

Nhiều quan sát dịch tễ học nghiên cứu về việc tiêu thụ trà xanh có tác độngđáng kế đến các bệnh ung thư ở người Theo đánh giá của Carmen Cabrera và cộngsự về việc sử dụng trà xanh ngăn ngừa các bệnh ung thư như sau: ung thư đường tiêuhóa, tuyến tụy ở Nhật Bản, ung thư buông trứng ở Trung Quốc; ung thư miệng, họngvà thanh quản ở phía bắc Italy, Thượng Hải; ung thư da day, ở Nhật Bản, phía namThổ Nhĩ Kỳ và Thụy Điển Tại Nhật Bản cũng đã nghiên cứu, những người tiêu thụhơn 10 tách trà mỗi ngày sẽ giảm thiểu được các nguy cơ về ung thư phôi, gan, ruộtkết, ung thư vú ở phụ nữ va ung thư tuyến tiền liệt ở nam giới [50]

1.2 Enzyme polyphenol oxidase (PPO)

Polyphenol oxidase (PPO) là một metalloprotein có chứa nguyên tô đồng vathuộc nhóm enzyme oxi hóa khử, xúc tác phản ứng oxi hóa hợp chất phenolic tạo sảnphẩm quinone, hình thành màu nâu trong trái cây và rau củ bị tốn thương [51] PPOcó liên quan đến sự hình thành các sắc tố, sự loại phân tử oxy và cơ chế phòng thủchống lại các tác nhân gây bệnh và côn trùng ở thực vật Vì cơ chat phenolic của

GVHD: TS Huynh Ngọc Oanh 17

PPO là những tiền chất quan trọng hình thành nên rào cản vật lý, hạn chế sự lây lanmâm bệnh Ngoài ra, các hợp chất quinone hình thành sau xúc tác của PPO có théliên kết với các protein thực vật, làm giảm sự tiêu hóa protein từ đó làm giảm giá trị

dinh dưỡng của các loại động vat ăn có PPO được coi là một enzyme quan trọng

trong ngành công nghệp thực phẩm, đã và đang được nghiên cứu rất nhiều trong mộtsố loài thực vật Sự oxy hóa các hợp chất phenol là nguyên nhân chính gây ra sự nâuhóa ở nhiêu loại trái cây và rau quả trong quá trình chín, thu hoạch, bảo quản vả vậnchuyển [51, 52] Điều nay làm ảnh hưởng đến chất lượng dinh dưỡng, làm giảm sứcmua người tiêu dùng và ảnh hưởng đến ngành công nghiệp sản xuất và chế biến thựcphẩm

OH

or

H 0 ae

va ‘OHhe

TikeOH :

CatechinsOa Oa

Theaflavins Polymerization Theasinensins

Hình | - 7: Su chuyén hoá catechin va sự hình thành TF, TR dưới tác dụng của

enzyme polyphenol oxidase

Người ta ước tính thiệt hai từ các enzyme gây nâu hóa lên tới hơn 50% Hàng

năm gan | triệu đô la thiệt hại cây trồng do enzyme hóa nâu gây ra [52] Chính vì tácđộng kinh tế của PPO nên đòi hỏi phải có những biện pháp kiểm soát hoạt động củaenzyme PPO để duy trì chất lượng sản phẩm và kéo dải thời gian sử dụng Nhiềunghiên cứu thực nghiệm để làm giảm hoặc ngăn chặn sự hóa nâu ở những mô bịthương tim ra 6 nhóm có kha năng gây ức chế enzyme PPO [53]

- Cac tác nhân khử (ascorbic acid va sulfite).- Cac tac nhan kim kep (ethylenediaminetetraacetate (EDTA), sodium-

diethyldithiocarbamate (DIECA), sodium azide).- Cac tac nhân phức hop (cyclodextrin, chitosan).

- Cac chat lam diu (ascorbic acid, citric acid, malic acid, phosphoric acid).- Chat ức chế enzyme (các co chất tương tự, các hop chat halogen)

- Xt lý bang enzyme (protease, o-methyltransferase).Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp chế biến tra — đặt biệt là tra Oolong,enzyme PPO đã được sử dụng trong nghiên cứu này để thu dịch trích enzyme từ látrà nguyên PPO lai đóng vai trò hết sức quan trọng PPO xúc tác oxy hóa thành phantannin đến sản phẩm cuối là theaflavin và thearubigin, là các cau tử tạo ra mau vàng

và màu đỏ và hương vi của nước pha trà Theo nghiên cứu cua Subramanian và cộng

sự (1999), có 3 loại isoenzyme của PPO (là những dạng phân tử khác nhau về mặtcấu trúc của một hệ enzyme với cùng một chức năng xúc tác) được tinh sạch bangphương pháp điện di với catechin là cơ chất nhận diện Chúng được đánh số lần lượtlà PPO 1, PPO 2 va PPO 3 Trong đó, khối lượng phân tử của PPO 1, PPO 2 và PPO3 lần lượt là 75 kDa, 100 kDa và 75 kDa Giá tri pI của chúng tương ứng là 5,0 (PPO1), 7,5 (PPO 2), 9,6 (PPO 3) Các isoenzyme này có nhiệt độ tối ưu là 40°C Dựa trên

điểm đăng điện pI được công bố, pH liệu Mặt khác, nhiệt độ tôi ưu được sử dụng để

khảo sát hoạt tính PPO là 40°C.

1.2.1 Phân loại

PPO có 3 dạng chính tùy thuộc vào cơ chất đặc hiệu và cơ chế phản ứng của

enzyme bao gôm tyrosinase, catechol oxidase và laccase.

GVHD: TS Huynh Ngọc Oanh 19

1.2.1.1 Tyrosinase

Tyrosinase (E.C.1.14.18.1) là enzyme monooxygenase có chứa nguyên tốđồng, xúc tac 2 phản ứng khác nhau với sự có mặt phân tử oxy: o-hydroxyl hóa cơchất monophenol thành o-diphenol (hoạt tính monophenolase hoặc cresolase) va quátrình oxy hóa tiếp theo chuyên o-diphenol thành o-quinone nhờ enzyme diphenolase

monophenol o-diphenol o-quinone

Cresolase activity Catecholase activity

Hình 1 - 8: Co chế phan ứng của tyrosinaseTyrosinase chủ yếu liên quan đến quá trình sinh tong hop melanin và có vai tròtrong những bước dau của sự tông hop melanin từ L-tyrosine dẫn đến hình thành L-dopauinone và L-dopachrome Nhờ những nghiên cứu hóa hoc và quang pho củatyrosinase cho ta biết được vị trí tâm xúc tác gồm 1 cặp ion đồng CuA và CuB Cặpion Cu liên kết với phan du ra của phân tử histidine (His) tạo thành vị trí tương tácgiữa tyrosinase với phân tử oxy và cơ chat phenolic [54]

1.2.1.2 Catechol oxidase

Catechol oxidase (E.C.1.10.3.1) được biết với tên khác là o-diphenol oxidase,

xúc tác phản ứng oxy hóa o - diphenol thành o-quinone tương ứng với sự tham giaphân tử oxy Tương tự như enyzme tyrosinase, vi tri tâm xúc tác của enzyme

catechol oxidase cũng gồm cặp ion Cu (CuA và CuB) Chính đặc điểm đó nênenzyme catechol oxidase được xếp vào nhóm protein đồng “type-3” bao gồm cảtyrosinase và heamocyanin Tuy nhiên không giống như tyrosinase, enzyme catecholoxidase thiếu hoạt tính hydroxylase nên vì thế không sử dụng monophenol làm cơchất [54]

Laccase (E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme oxidase có phố cơ chat rất đa dạng,xúc tác loại bỏ hydro từ nhóm hydroxil của monophenol, diphenol, polyphenol, dẫnxuất phenol, hợp chất phi phenol.

OH oOH ‘9

chứa khoảng 500 aminoacid và có trọng lượng phân tử khoảng 50-100 kDa Laccase

có chứa 4 nguyên tử đồng ở trung tâm hoạt động có vai trò quan trọng trong hoạtđộng xúc tác, các nguyên tử đồng được chia làm ba nhóm thành ba vùng oxi hóa khửlà vùng nguyên tử đồng T¡, T›, Tạ Vùng nguyên tử đông T; liên kết với đoạn peptidgôm 2 gốc histidine va 1 gốc cystein hap thu mạnh bước sóng 610 nm nên có màuxanh Vùng nguyên tử đồng T, liên kết với hai gốc histidine và không có mau xanh.Vùng nguyên tử đồng T; gồm hai nguyên tử đồng nối với nhau băng cau nốihydroxil nam gan nhau hap thụ tia cực tím yếu ở bước sóng 330nm [54]

Vùng nguyên tử đồng T; tham gia chủ yếu trong việc nhận điện tử và truyềnđến các vị trí khác Vùng nguyên tử đông Ta, T: hình thành trung tâm gồm 3 nguyêntử đông làm nhiệm vụ kích hoạt liên kết và chuyền điện tử với Os tạo thành nước

1.2.2 Trích ly enzyme polyphenol oxidase (PPO)Trích ly enzyme PPO đã được các tác gia nước ngoài nghiên cứu từ lâu, hướng

nghiên cứu chính là tìm ra phương pháp tối ưu hóa quá trình trích ly và thu nhận

GVHD: TS Huynh Ngọc Oanh 21

enzyme PPO — xác định hoạt tinh enzyme PPO, tìm ra pH, nhiệt độ tối ưu, nghiêncứu ảnh hưởng các chất ức chế enzyme PPO hoặc polyphenol trong quá trình tríchly Các đối tượng được dùng dé trích ly enzyme PPO rất đa dạng như táo, chuối, nho

và lá trà Nghiên cứu của tac gia Thomas C.Wrong và cộng sự (1970) trích ly PPO

từ quả Clingstone Peach bằng dung môi acetone có bố sung polyethylen glycol

(PEG) trong môi trường trích ly, M Umit va cộng sự (2011) cũng sử dung dung môi

acetone để trích ly PPO từ lá trà Pradip K Mahanta (1993) thì sử dụng đệmphosphate pH 7,0 để trích ly enzyme PPO từ cacao Peigen Zhou và cộng sự (1973)sử dụng dung môi trích ly đệm phosphate pH 6,0 có bố sung Triton X-100 và PVPP(polyvinylpyrrolidone), các tác giả Harel et al (1965); Stezig et al (1965) thì bố sung

Tween-80 vào môi trường trích ly [51] Nhìn chung, các nghiên cứu đã su dung

các dung môi trích là đệm, acetone va bỗ sung thêm một số chất trong dung môi tríchnhư PEG, PVPP (hoặc PVP), Triton, Tween §0 để bước đầu của việc thu nhận

enzyme PPO.

Bảng 1 - 7: Các chat được dé nghị thêm vào môi trường dịch trích ly [55-58]

Nhóm chất Chất Tài liệu tham khảo

Hulme (1964); Loomis và BattailePVP hoặc PVPP (1965)

Polymer

Polyethylen glycol Badran, E.Jones (1965)Polycaprolactam Sanderson (1964)DIECA Harrison va Pierpoin (1963)

C etc nhân kiềm

Cyanide Anderson va Rowan (1965)

kep

Mercaptobenzothiazole | Palmer va Robert (1967)

Cysteine Bradfield (1947)

Thiol

Thioglycollate Anderson va Rowan (1965)

Các van dé chính cần phải quyết dé tối ưu hóa quá trình trích ly PPO:

e Khó khăn trong việc hòa tan các liên kết rang buộc PPO và màng tế bảo thực

vật

e Tránh sự oxy hóa hợp chat phenolic xảy ra trong quá trình trích ly.Dé giải quyết van dé đầu tiên, thường dùng các chất tay hay các chat làm tăngtính thấm thấu qua màng như Triton X100 hoặc Tween-80 (Galeazzi và Sgarbieri,1981: Zhou, Smith & Lee, 1993) Nghiên cứu của Stelzig (1965) cho thấy trích lybutanol giúp loại bỏ lipoprotein là nơi protein enzyme có thé bị ràng buộc Tuy nhiênvan dé khó khăn nhất dé thu được dịch enzyme PPO là cần hạn chế sự oxy hóa hợpchất polyphenol và quá trình hình thành các hợp chất màu trong dịch trích ly Trongquá trình trích ly, các phenol nội bảo bị oxy hóa nhanh, hình thành nên các hợp chấtquinone, tannin ngưng tụ và các hợp chất màu (hóa nâu) Vì trong quá trình trích ly,việc phá vỡ tế bảo làm cho enzyme PPO thoát ra (từ sắc lạp) và xúc tác phản ứng.Các hợp chất phenol và các sản phẩm bị oxy hóa của nó (quinone) phản ứng rấtnhanh với protein (trong đó có enzyme) Chúng loại bỏ liên kết H với protein vàthêm vào đó các nhóm chất vào liên kết peptide Vì thé, trung tâm hoạt động củaPPO ít nhiều bị thay đổi và dẫn đến enzyme bị mất hoạt tính Nhiều nghiên cứu của

Loomis va Battile (1965); Hulme và cộng sự (1964) va Sanderson và cộng sự (1965)

đã dé nghị ba cách sau nhằm ngăn chặn phan ứng cua protein với hop chat phenolichoặc sản phẩm từ sự oxi hóa từ chúng [55-58]

e Loại bỏ các hợp chất phenolic: ví dụ sử dụng phương pháp hấp thue Ức chế hoạt tính enzyme PPO

eLoại bỏ quinone (hình thành sau phản ứng oxi hóa hợp chất phenol) băngcách khử quinone lại thành o-diphenol hoặc quinone có thé được loại bỏ bằng cáchcho ngưng tụ với một hợp chất khác dé hình thành sản phẩm không phan ứng với

Ngoài ra môt số chất khác cũng được quan tâm nghiên cứu như ascorbate,

metabisulphite, Bovine serum Albumin — BS hay các dung môi hữu cơ như acetone,

methanol Tuy nhiên để tối ưu hóa việc thu nhân enzyme PPO thì các bước trích lyphải được tiến hành lạnh (nếu có điều kiện nên tiến hành từ -20°C đến -30°C) [7].hạn chế ánh sáng tự nhiên và phải nghiền va đồng nhất mẫu trong nitơ lỏng hoặctrong môi trường nitơ không khí Ngoài ra, một sô tác giả còn dé nghị sử dụngphương pháp lạnh đông trong bước đâu của việc trích ly Các yếu tô khác như: pH,tính trương, lực ion và hàm lượng các tác chất b6 sung vào môi trường trích ly cũngphải được quan tâm và chú ý đến [51]

1.3 Trích ly polyphenol từ lá trà xanh

Polyphenol trong trà được trích ly băng nhiều kĩ thuật khác nhau [59]: trích lyran lỏng (SLE), trích ly bang cách nén chat long (PLE) [60], trích ly có hé trợ siêuâm UAE) [61], trích ly có hỗ trợ vi sóng (MAE) [62]

Hiện nay, kĩ thuật trích ly truyền thống bang dung môi vẫn được sử dung rộngrãi với ưu điểm là thiết bị đơn giản, hiệu quả kinh tế, có thé xử lý một lượng rat lớn

nguyên liệu và quy trình thực hiện liên tục.

1.3.1 Cơ sở kĩ thuật của quá trình trích ly rắn longQuá trình hòa tan một hoặc một số cau tử của chất ran băng một chất lỏng(dung môi) gọi là quá trình trích ly ran lỏng Quá trình trích ly dựa vào tinh chat củacác chất có nồng độ khác nhau, khi chúng tiếp xúc thì khuếch tán lẫn nhau nghĩa là

thâm nhập từ pha này sang pha khác.

Quá trình khuếch tán tuân theo định luật Fick I và II Theo định luật Fick I thìkhuếch tán là một quá trình chuyên chất trong không gian dẫn đến cân băng nông độtrong toàn hệ Khuếch tán xảy ra một cách tự diễn bién khi có sự chênh lệch nôngđộ Dòng chat sé đi từ miền có nồng độ cao đến miền có nông độ thấp Động lực củakhuếch tán là gradient nông độ Định luật Fick II cho biết mối quan hệ giữa nông độ,thời gian và khoảng cách khuếch tán băng cách xét sự khuếch tán qua tiết diện theotrục x, S, cách S, một khoảng dx: S; = S.= lem?

Trong thực tế, trích ly là sự hòa tan giữa các chat trong vật liệu vào trong dungmôi, quá trình hòa tan đó xảy ra cho đến khi đạt đến sự cân băng nông độ chất trích