Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Đồng phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp In Silico Microarray

Nhiệm vụ và nội dung: Xây dựng cây sinh loài từ toàn bộ trình tự 16S ribosomal RNA cũng như từ sự kết hợp của mộtsố vùng siêu biến đổi phù hợp nhất dé phát hiện các vi sinh vật gậy bệnh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

BÙI KHAC HOÀNG VŨ

DONG PHÁT HIEN VI SINH VAT GAY BỆNH TRONG

THUC PHAM BANG PHƯƠNG PHÁP

IN SILICO MICROARRAY

Chuyén nganh: Cong nghé sinh hoc

Mã số: 60 420 201

LUAN VAN THAC SI

TP HO CHI MINH, thang 08 nam 2015

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠITRUONG ĐẠI HOC BACH KHOA —DHQG -HCMCán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

2 TS Huỳnh Ngọc Oanh — Thư ký

3 PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn - Ủy viên4 PGS.TS Đỗ Phúc — Phản biện 1

5 TS Võ Đình Lệ Tâm — Phản biện 2

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUOC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập — Tự do- Hanh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VAN THẠC SĨHọ và tên học viên: Bùi Khắc Hoàng Vũ MSHV: 13310322Ngày, tháng, năm sinh: 21/01/1990 Nơi sinh: Lâm ĐồngChuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 420 201L Téndé tài:

“Đồng phát hién vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp in silico microarray”

H Nhiệm vụ và nội dung:

Xây dựng cây sinh loài từ toàn bộ trình tự 16S ribosomal RNA cũng như từ sự kết hợp của mộtsố vùng siêu biến đổi phù hợp nhất dé phát hiện các vi sinh vật gậy bệnh phổ biến trong thựcphẩm.

Lựa chọn hệ mẫu dò đặc hiệu cho các vùng biến đổi đã lựa chọn và đánh gia tác động của cácvùng biến đổi này đến đồng phát hiện các vi sinh vật gây phổ biến trong thực phẩm bằng

phương pháp microarray.

Thiết kế cặp môi chung phù hợp với các vùng siêu biến đổi lựa chọn được.

III Ngày giao nhiệm vu: 07/07/2014IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 10/05/2015.

V Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương.

Tp HCM ngày thang năm 2015

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MON ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠNLời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thay của tôi — PGS.TS Nguyễn Thúy Hương người đã không quản mọi khó khăn để hướng dẫn, giúp đỡvà tạo mọi điều kiện tốt nhất dé tôi có thể hoàn thành luận văn cũng như chương trình

cao học Tôi đã học được ở cô sự yêu nghè, nhiệt huyết, tinh thần trách nhiệm cũng

như sự bao dung và lòng vi tha.

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học, bộ mônCông nghệ thực phẩm- Trường Đại học Bách Khoa đã động viên va giúp đỡ tôi hoànthành luận văn tốt nghiệp

Xin cảm ơn anh Lê Thành Điền, chị Đỗ Thị Bich Phượng, bạn Nguyễn Minh Trí —

học viên cao học ngành Công nghệ sinh học khóa 2013 đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẽ

trong suốt quá trình học tập và làm luận văn tại trường.Xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến anh Võ Văn Giàu — Dai học Công nghiệp thực phẩm,anh Hà Minh Luân — Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, chị Trần Thị Như Hoa —Đại học Tự nhiên Thành phố H6 Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và chia sẽ

không chỉ về mặt chuyên môn mà còn về các khía cạnh khác của cuộc sông.

Cuỗi cùng, tôi xin bay tỏ lòng biệt ơn sâu sac đôi với gia đình đã luôn khích lệ,động viên tôi vê mặt vật chat lan tinh thân đê tôi vững tin thực hiện đê tài nghiên cứuvà đi theo con đường mình đã chọn.

TÓM TẮTĐề đảm bảo an toàn vệ sinh thực pham, kiếm nghiệm bằng phương pháp microarrayđang là một trong những hướng tiếp cận chủ yếu trong những năm gần đây Trình tựmã hóa cho 16S ribosomal RNA là một trong những gene thường dùng nhất trong địnhdanh vi sinh vật nói chung và trong kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trongthực phầm bằng phường pháp microarray nói riêng Trong nghiên cứu nay, chúng tôiphân tích vé mặt lý thuyết tác động của các vùng biến đối của gene 16S rRNA và sựkết hợp giữa chúng trong định danh một số vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực

phẩm Từ đó lựa chọn hệ mẫu dò đặc hiệu và thiết kế mỗi chung nhằm mục tiêu đồng

phát hiện 15 tác nhân gây bệnh trong thực phẩm chủ yếu Kết quả của nghiên cứu đãxác nhận gene 16S ribosomal RNA có thể phân biệt 9 tác nhân gây bệnh đến mức độ

loai (Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Campylobater jejuni,Escherichia coli, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Listeria monocytogenes,

Staphylococcus aureus va Yersinia enterocolitica) Cac tac nhân gây bệnh có thé phânbiệt đến mức độ dưới chi nhưng chưa đến loài bao gồm nhóm Bacillus cereus, nhóm

Campylobacter jejuni/Campylobacter coli và nhóm Yersinia pesfis/Yersima

pseudotuberculosis Các tác nhân khác hoàn toàn không thé phát hiện được do mức độtương đồng cao giữa chúng với các vi sinh vật cùng chỉ và loài bao gồm các loài thuộc

Salmonella spp., Shigella spp va Vibrio parahaemolyticus Nghiên cứu nay cũng xác

nhận sự kết hop giữa các vùng biến đổi V1-V2-V3 va các vùng biến đối V6-V7-V8 làtốt nhất trong phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm Có 35 mẫu dò đặc

hiệu được lựa chọn và 2 cặp môi chung được thiết kế nhằm sử dụng các vùng biến đôi

này vào phát hiện vi sinh vat gây chủ yếu trong thực phẩm bang kỹ thuật microarray

trên thực nghiệm.

To ensure food safety, detection by microarray method is one of the most trendingapproaches in recent years 16S ribosomal RNA gene is one of the most commongenes using in identification bacteria and detection major foodborne pathogens In thisresearch, we analyzed the effect of variable regions of 16S rRNA gene and thecombination between them on simultaneous detect foodbone pathogens Specificprobes and design primers were selected and designed from the suitable regions for thegoal of study In the output, we confirmed that 16S ribosomal RNA could distinguish 9pathogens to species level (including Clostridium perfringens, Clostridium botulinum,Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Listeriamonocytogenes, Staphylococcus aureus and Yersinia enterocolitica) The groups ofpathogens which could be differentiated to below genus level but still upper specieslevel were Bacillus cereus group, Campylobacter jejuni/Campylobacter coli group andYersinia enterolitica/ Yersinia pseudotuberculosis group Other pathogens which couldnot be distinguished to genus level or species level due to high similarities with theirrelated organisms are Salmonella spp., Shigella spp and Vibrio parahaemolyticus Thisstudy also shown that the combination between V1, V2 and V3 regions and betweenV6, V7 and V8 regions were the best options for foodborne pathogens detection.Finally, 35 specific probes were chosen and 2 pairs of primers were designed fordetection and identificarion of foodborne pathogens in practical situations.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện.

Các sô liệu, hình ảnh và kêt quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và

chưa từng được công bồ trong bat kỳ công trình nào khác

Tác giả

Bùi Khắc Hoàng Vũ

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNHH - 2 ° SE E9 994 g9 g0 3990 9 9022 i

DANH MỤC BÁNG 5-09 9090909 90808985 s56 iiiDANH MỤC VIET TAT < << << <9 6 3925 895559540 ivMỞ DAU unssssssssssssssssssssssscessscssscsssssssesssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssnssesseeseess 1

CHƯƠNG 1: TONG QUAN TALI LIỆỆU - 5 5° 5 s52 S2 sS2sessssssese 3

1.1 Tổng quan tình hình ngộ độc thực phẩm - + + 255252 5++x+x+£zzx+xerscxee 31⁄2 Các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm ¿2555255552 4

taiiadadđiidiiiiiiâaaiaẳâaẳaẳidddẳdddddddddddddddd 4[.2.l — EsferIChiA CỌH S000 nh 4l.2.2 SwlmonelÏA SG G0000 ng 6|.2.3 Snigell@l Q00 8L.2A = CQMPYIODACTHE oe eeeeeecccccccceeeeeesesssnnneccccceeeeeeeessssssnnaaaeeeeeeeeeeeseeeseeseesssnaaeeeeees 101.2.5 LiSf€FrIQ HOHOCVÍOĐ€HCS s S0 121.2.6 SfqDhyÏOCOCCHS (HFHA SG S300 131.2.7 — Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus va Vibrio VHÍH"fICHS 151.2.8 Clostridium botulinum va Clostridium D€FƒTIHB€HS ĂĂĂĂSĂSSSSS<<+2 191.2.9 Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis va Yersinia pestis 211.2.10 Bacillus C€T€HS G0 24

13 Các phương pháp chủ yếu trong kiểm nghiệm vi sinh vat gây bệnh trong thực

phẩm - Gọi 26

1.3.1 Phuong pháp sinh hĩa truyền thống - ¿+ 2+ 552222 £££E+ezezrrered 26

1.3.2 Phương pháp ELISIA -G G1 nen 261.3.3 Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) 7-5 +<<<5 271.3.4 Phương pháp ImICTOATTAV - - -G G1 nen 28

1.4 Tổng quan về 16S Ribosomal RNA -¿ 5-5-5252 2EcEvEzxrkerererrrrees 30

1.5 Tổng quan về các nghiên cứu liên quan - + 5+2 ++s+£+£++szxezszszsee 32CHUONG 2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

ZL Vat lIỆU Q9 vá 362.1.1 Trinh tự gene 16S ribosomal RNA của các vi sinh vật gây bệnh mục tiêu

¬ ỐốỐ 362.1.2 Các vùng biến đổi của gene 16S ribosomal RNA -. 5 -: 36

2.13 Các cơ sở di liệu dùng trong nghi€n CỨU «5755 5< essesss 37

2.1.4 Các phần mềm và công cụ tin sinh học sử dụng trong nghiên cứu 37

2.2 Phuong pháp nghiÊn CỨU - - ( - << 5 13101109 990 1n ngờ 4

2.2.1 Sơ đồ tổng quát :- 5522323 E2 231112121111 211 1111 cee 412.2.2 _ Bồ trí thí nghiệm -¿-©- - + 2 E21 E115 E5 121111515 1111111511111 y 42

CHƯƠNG 3: KET QUA VÀ THẢO LUẬN - 5 5-5 5 sssscsessssesessssese 49

3.1 Trinh tự 16S ribosomal RNA được sử dụng trong nghiên cứu 49

3.2 Kết quả sắp gióng cột đa trình tự và xác nhận các vùng bảo tổn, vùng biến doi

của 16S ribosomal RNA cọ nọ kh 50

3.3 Kết quả xây dựng cây sinh loài từ các vùng biến đối và so sánh với cây sinhloài từ toàn bộ trình tự 16S ribosomal RNA của tất cả các vi sinh vật mục tiêu 53

3.4 Kôt quả lựa chọn mâu dò đặc hiệu va ảnh hưởng của các vùng biên đôi đền

phát hiện các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm -. - 55+: 583.5 Kết quả thiết kế mỗi chung - + +5 +52 +E+E£EE+E£E£EE£EEEEEEEEEEkrrkrrrrrkrree 64CHƯƠNG 4: KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, 2-° 5s 2 sssssssssese 664.1 KẾT luận c1 2S 111011111 101110111111 111110111 ngu ng: 664.2 Kiến nghị -S CS TT 1111111112111 1111212111111 1111 111gr 67TÀI LIEU THAM KHAO <5 s° S9 S99 9s 95s se ssessE 68

3:18800 9002255 75

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Vi trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Escherichia coli O157:H7 6Hình 1.2: VỊ trí trình tu gene 16S ribosomal RNA cua Salmonella enterica 8Hình 1.3: VỊ trí trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Shigella fleXnert 10Hình 1.4: VỊ trí trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Campylobacter jejuni IIHình 1.5: VỊ trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Listeria monocytogenes 13Hình 1.6: VỊ trí trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Staphylococcus aureus 15Hình 1.7: Vi trí trình tự gene 16S ribosomal RNA Vibrio cholerae, Vibrio

parahaemolyticus Va Vibrio VULNIfiCUs: SG Q1 18Hình 1.8: VỊ trí trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Clostridium botulinum vaØ//23//;/77,,8: 2477/4208 — .Ề = 20Hình 1.9: VỊ trí trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Yersinia enterocolitica, YersiniapsSeudotuberculosis Và YerSinid DCSÍLS G9 0 ke 24Hình 1.10: VỊ trí trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Bacillus cereMsS 25Hình 1.11: Trinh tự các bước thực hiện căn bản của phương pháp microarray 29

Hình 1.12: Cây sinh lồi xây dựng dựa trên so sánh trình tự 16S, thể hiện mối quan hệgiữa ba nhánh chính trong tự nhiên bao gồm Archaea, Bacteria và Eucaya 30Hình 3.1: Vị trí các vùng biến đổi từ V1 đến V8 của 16S ribosomal RNA 53

Hình 3.2: Cây sinh lồi xây dựng từ tồn bộ trình tự gene 16S rRNA của các vi sinh vậtgây bệnh mục [OU G1990 0 0 55

Hình 3.3: Cây sinh lồi xây dung từ vùng V1 đến V3 của các vi sinh vật gây bệnh mục

Hình 3.5: Cây sinh loài xây dựng từ vùng V6 đến V8 của các vi sinh vật gây bệnh mục

Hình 3.6: VỊ trí SNP phân biệt Campylobacter jejuni với C.coli, C curvus và C fetusvà vi trí SNP phân biệt Vibrio vulnificus với V cholera và V parahaemolyticus 64

DANH MỤC BÁNGBang I.1: Tình hình ngộ độc tại Việt Nam từ năm 2007 (10) 4Bảng 2.1: Vi trí các vùng biến đối của gene 16S ribosomal RNA dựa trên Escherichia

COLL OIS TIT oo 36Bảng 3.1: Danh sách các trình tự được tài từ GenBank được sử dụng trong nghiên cứu

¬ ỐỔỐỔỐố.ốỐỐ 49Bảng 3.2: Vị trí các vùng bảo tồn cao của gene 16S ribosomal RNA 50Bảng 3.3: Vị tri các vùng biến đối của gene 16S ribosomal RNA - 50Bang 3.3: Kết qua lựa chọn mau dò đặc hiệu cho vùng biến đổi V1-V3 60Bảng 3.4: Kết quả lựa chọn mẫu dò đặc hiệu cho vùng biến đổi V6-V8 6lBang 3.5: Tác động của một số vùng biến doi đến phân biệt vi sinh vật gây bệnh trong

thực phầm băng MICTOAFTAY - G000 nọ re 63

Bảng 3.6: Kết quả thiết kế mỗi chung ¿+ ¿522525222 S£‡E+E£E‡EvErErkererererrees 65

DANH MUC VIET TAT

Basic Local Alignment Search Tool

European Centers for Disease and Control

European Food Safety Authority

Enzyme linked-immusorbemt assay

United States of America’s Food and Drug administration

Polymerase chain reaction

Ribosomal Database Project

Ribonucleic acid

ribosomal ribonucleic acid

World Health Organization

Single-nucleotide polymorphism

MỞ ĐẦU

MỞ ĐẦUÔ nhiễm thực phẩm hiện hiện diễn biến hết sức nghiêm trọng đặt ra nhu cầu phảicó phương pháp phát hiện nhanh cùng lúc nhiều vi sinh vật gây bệnh cùng lúc nhanh,

chính xác và có độ tin cậy cao.

Trong những năm gan day, sự phát triển của kỹ thuật microarray ngày càng dượcquan tâm do có thé đồng phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm nhanh

chóng với độ chính xác va độ nhạy cao với hai bước chính: (1) thực hiện phản ứng

PCR với mỗi chung, môi riêng, hoặc kết hợp môi chung với mỗi riêng: (2) lai sảnphẩm PCR với mẫu dò đặc hiệu cho từng chủng vi sinh vật cụ thể Điều này giúp chovề mặt lý thuyết, có thể phát hiện cùng lúc hàng chục các vi sinh vật khác nhau Do đómà phương pháp này hiện nay là một trong những hướng tiếp cận chủ yếu hiện naytrong đồng phát hiện các vi sinh vật gây bệnh Một trong những yếu t6 ảnh hưởng quantrọng nhất đến thành công của kỹ thuật microarray trong đồng phát hiện các vi sinh vậtgây bệnh trong thực phẩm là chọn ra trình tự phu hợp dé thiết kế mỗi và lựa chon mẫu

dò đặc hiệu Trong đó, gene mã hóa cho 16S ribosomal RNA hiện nay được xem là

tiêu chuẩn mới trong định danh vi sinh vật nói chung và vi sinh vật gây bệnh nói riêng.Lý do là cơ sở dit liệu vẻ trình tự này tương đối day đủ, trong khi các ứng viên khácnhư vùng trung gian 16S-23S tuy có mức độ biến đôi cao tuy nhiên lại quá ngắn Vùng23S được cho là có độ đa dạng cao nhất thì thông tin về trình tự này trên các cơ sở dữliệu vẫn chưa được đây đù Do đó gene 16S ribosomal RNA hiện vẫn là lựa chọn tốtnhất trong việc định danh và phát hiện vi sinh vật

Tuy nhiên, các nghiên cứu liên quan hiện vẫn chưa thống nhất được về khả năng vàsố lượng vi sinh vật có thé phân biệt bằng phương pháp microarray sử dụng trình tự16S ribosomal RNA Ngoài ra, do quá trình cập nhật, thay đổi, điều chỉnh các cơ sở dữliệu, hệ mẫu dò đặc hiệu của một số nghiên cứu trước đây không còn phù hợp nữa, và

có kha năng dân dén các kêt quả sai néu áp dụng vào thực tê Điêu nay đặt ra van đê

cần thiết phải đánh giá lại về mặt lý thuyết khả năng của gene 16S cũng như các vùngbiến đôi tiêu biểu của chúng đến đồng phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh chủyếu trong thực phẩm theo FDA bang phương pháp microarray nhằm ứng dụng vào thựctế đạt hiệu quả cao nhất.

Từ mục tiêu trên, chúng tôi tiễn hành nghiên cứu :“Đồng phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp

in silico microarray”

Nghiên cứu được tiễn hành cùng với những nội dung chính sau:

e Xây dựng cây sinh loài từ toàn bộ trình tự 16S ribosomal RNA cũng như từ

sự kết hợp của một số vùng siêu biến đối phù hợp nhất và so sánh chúng vớinhau nhằm tìm ra vùng siêu biến đôi phù hợp nhất dé phát hiện các vi sinh

vật gây bệnh mục tiêu.

e© Lựa chọn hệ mẫu dò đặc hiệu cho các vùng siêu biến đổi đã lựa chọn vàđánh giá tác động của các vùng siêu biến đổi này đến đồng phát hiện các visinh vật gây bệnh thường gặp trong thực phẩm băng phương pháp

microarray.e Thiết kê cặp môi chung phù hợp với các vùng siêu biên đôi lựa chọn được.

CHƯƠNG 1: TONG QUAN TÀI LIEU

1.1 Tống quan tình hình ngộ độc thực phẩmTheo Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (U.S Food and DrugAdministration — FDA), các tác nhân vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm baogôm: Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp., Yersinia

enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Vibrio chloerae, Vibrio parahaemolyticus,Vibrio vulnificus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,Clostridium perfringens va Clostridium botulinum |1|

Ở Mỹ, theo thống kê của Elain Scallan et al (2011) ở Mỹ thực hiện tại Trung tâmkiểm soát và phòng chồng dịch bệnh (Centers for Disease Control and Prevention),Aurora, Colorado thì hàng năm 31 chủng gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm gây ra 9.4

triệu ca ngộ độc, trong đó có 55,961 ca phải nhập viện va 1,351 trường hợp tử vong.

Trong đó khoảng 58% ca ngộ độc gây ra bởi virus, tiếp đó là Salmonella spp (11%),Clostridium perfringens (10%) va Campylobacter spp (9%) Trong số các ca phảinhập viện, nguyên nhân dẫn đầu là do nhiễm Salmonella spp (35%),tiép đến là virus(26%), Campylobacter spp (15%) va Toxoplasma gondii (8%) Trong số các ca tửvong, dẫn đầu vẫn là Salmonella spp (28%), tiép dén 1a T.gondii (24%), Listerichiamonocytogenes (19%) và các loại virus (11%) [2] Trong khi đó, tai Châu Au, theo báocáo của Co quan An toàn thực phẩm Châu Au (European Food Safety Authority -EFSA) và Trung tâm kiểm soát và phòng chống dịch bệnh Châu Âu (European Centre

for Disease Prevention and Control - ECDC) trong năm 2011, ghi nhận 5,648 ca ngộ

độc gây ra chủ yếu bởi Salmonella spp., các độc tố vi khuẩn, Campylobacter spp vacác loại virus, thực phẩm chủ yếu gây ngộ độc bao gồm trứng, thức ăn hỗn hợp và hải

sản [3].

Ở Việt Nam, theo số liệu thong kê đến năm 2012 của Cục An toàn thực phẩm, BộY tế, năm 2007 xảy ra nhiều nhất với tổng số 247 vụ với tong số ca ngộ độc là 7,329;số nhập viện là 5,584; gây tử vong 55 ca Năm 2008 giảm xuống còn 205 vụ nhưng số

ca ngộ độc, số nhập viện và số tir vong gia tang lần lượt là 7,829: 6,526 va 62 ca, cao

nhất trong cả giai đoạn Tu năm 2009 đến năm 2012, chỉ trừ năm 2010, xu hướng ngộ

độc thực phẩm nhìn chung có xu hướng giảm ở cả ba khía cạnh là tổng số vụ, số ca, sốnhập viện và số tử vong điều này cho thấy nỗ lực của các cơ quan có thắm quyền cũngnhư ý thức của người dân ngày một tốt hơn trong những năm gần đây Tuy nhiên tìnhhình ngộ độc ở Việt Nam vẫn hết sức nghiêm trọng, do đó van đề cần đặc biệt lưu tâmlà phải dé ra được chiến lược tốt nhất dé đảm bảo nguồn cung thực phẩm có chất lượng

cao và đảm bảo đủ an toàn trước khi đưa ra thị trường Bên cạnh đó, khi ngộ độc thực

phẩm xảy ra, cần phải có phương pháp nhanh chóng xác định chính xác tác nhân gâyngộ độc nhằm đưa ra phác đồ điều trị riêng cho từng bệnh nhận, tránh các biến chứng

nghiêm trọng do ngộ độc gây ra [4].

Bảng 1.1: Tình hình ngộ độc tại Việt Nam từ năm 2007 đến năm 2012 [4]STT Năm Tổng số vụ Số ca Số nhập viện | Số tử vong

| 2007 247 7329 5584 552 2008 205 7829 6525 623 2009 152 5212 4137 35+ 2010 175 5664 3978 515 2011 148 4700 3663 276 2012 168 5541 4335 34

1.2 Các vi sinh vat gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm

1.2.1 Esherichia coli

1.2.1.1 Đặc điểm phân loạiEscherichia coli là vi khuan Gram âm, hình que (1-2 chiều dài), hiếu khí và cókhả năng di động Một số chủng gây bệnh có khả năng chịu acid Da phan các chủng E

coli không gây độc và nguy hiểm cho con người và động vật E coli là đối tượng visinh vật chủ yếu trong nghiên cứu sinh lý học, trao đổi chất, quy luật di truyền, truyềntín hiệu và cấu trúc chức năng của vách tế bào Triệu chứng nhiễm các chủng E.coligây bệnh bao gồm viêm dạ dày, viêm ruột, ly, hội chứng nhiễm độc uré (hemolyticuremic syndorome - HUS), hội chứng nhiễm trùng đường tiết niệu (urinary tractinfection - UTI), nhiễm trùng máu, viêm phổi và viêm màng não Các ca ngộ độc giatăng trong các năm gan đây chủ yếu liên quan đến các chủng enterohemorrhagic E colichủ yếu do tiêu thụ thịt, rau quả thối.

E coli thuộc họ Enterobacteriacea, thường gặp trong nhóm vi sinh vật đường ruộtcủa động vật máu nóng Chúng được thải vào trong môi trường thông qua phân và gây

ô nhiễm đất và nước, có thé ảnh hưởng đến rau quả nếu phân sử dụng cho tưới tiêukhông được xử lý cân thận Thịt cũng có thé bị nhiễm E coli do quá trình giết m6 có

tiêp xúc với phân.

Lớp kháng nguyên O quyết định nhóm huyết thanh của E coli Kháng nguyên O cóchứa lipopolysaccharide (LPS), có tat cả 174 kháng nguyên O, được đánh số từ 1-181,bỏ qua các số 31, 47, 67, 72, 93, 94 và 122 Ngoài ra còn có 53 kháng nguyên kiêu Hhay kháng nguyên tiêm mao (flagellar antigens) (H1-H53) và 80 kháng nguyên kiêu K

hay kháng nguyên vo (capsular antigen) Chung không có tiêm mao và không có kha

năng di động E coli có thé có nhiều kiểu kết hop kháng nguyên khác nhau, trong đó

kháng nguyên “O” giúp xác định nhóm kháng nguyên trong khi “H” giúp xác địnhkháng nguyên.

Tuýp gây độc (virotype) hay tuýp gây bệnh (pathotype) được xác định dựa trên sự

hiện diện của các yếu tổ gây độc và tác động của chúng đối với tế bào hoặc mô độngvật như bám dính, xâm nhiễm và sản sinh độc tố Các chủng E coli gây độc chia làm 6tuýp gây độc bao gém: enterotoxigenic E coli (ETEC), enteropathogenic E coli

(EPEC), enterohemorrhagic EF coli (EHEC), enteroinvasive FE coli (EIEC),enteroaggregative E coli (EAEC) va diffusely adhering FE coli (DAEC) [5].

1.2.1.2 Thong tin di truyénTheo kết qua giải trình tự của Perna et al (2001), genome của Escherichia coli

O157:H7 dài 5,527,445bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Escherichia coli

O157:H7 dài 1,554bp., nam ở vị tri từ 227,103 đến 228 644 [6]

Escherichia coli O157:H7 EDL933, complete genome

GenBank: AE005174.2GenBank FASTA

Link To This Page | Feedback

chủ yếu ở cả các nước đang phát triển lẫn đã phát triển Thống kê toàn cầu đã ghi nhận

16 triệu ca nhiễm thương han, 1.3 ti ca viêm dạ day và ruột và 3 triệu ca tử vong liên

quan đến Salmonella Riêng ở Mỹ hang năm Salmonella gây ra 2-4 triệu ca, số tử vonglên đến 500-1000 và gây ton thất kinh tế vào khoảng 3 tỉ đô la.

Chi Salmonella thuộc ho Enterobacteriaceae, thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm,

không sinh bào tử Salmonellae di động (trừ Salmonella Pullorum và S Gallinarum) va

có tiêm mao Salmonella là vi khuẩn hiểu khí không bat buộc, có thé phát triển trongkhoảng nhiệt độ từ 5-45°C, nhiệt độ tối thích từ 35-37°C Chúng có thé phát triển trongđiều kiện pH thấp và nhạy cảm với sự gia tăng nồng độ muối trong môi trường nuôicay Salmonella có dạng nhiều sợi tiêm mao trong điều kiện khắc nghiệt từ 4-8°C hoặctừ 44°C và khi phát triển ở pH 4.4 hoặc 9.4

Salmonella có mặt trong đường ruột của chim, bò sát, rùa, côn trùng, gia súc và con

người Gia cầm là một trong những nguồn gây nhiễm Salmonella chủ yếu Khả năngnhiễm Salmonella có nguy cơ gia tăng do quá trình giết mỗ không hợp vệ sinh Trứngcũng là một trong những nguốn chứa Salmonella, đặc biệt là serovar Enteritidis do visinh vat này có thé xâm nhập vào buông trứng của gà mái Sự xâm nhiễm này khiếncho trứng bị nhiễm Salmonella trước cả khi vỏ trừng được hình thành Kết quả là,trứng được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thé chứa nồng độ Salmonella rat cao, có thélên đến 10!” tế bào/ qua

Các ca ngộ độc do nhiễm Salmonella chủ yếu do tiêu thụ các sản phẩm từ động vậtnhư thịt, sữa, thịt gia cầm và trứng Các sản phẩm sử dụng hàng ngày như phô mai vàkem cũng là một trong những nguồn gây ngộ độc Trong những năm trở lại đây, rauquả như rau diép, ca chua, rau mam, quả hạnh nhân cũng được ghi nhận như là mộttrong những nguôn lan truyền Salmonella Quá trình canh tác co hữu cũng làm gia tăngnguy cơ gây nhiễm các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm trong đó có Salmonella

Salmonella được xếp nhóm dựa trên kháng nguyên O, kháng nguyên tiêm mao (H)và kháng nguyên vỏ (Vi) Có tat cả 2,463 kiêu kháng nguyên Salmonella thuộc 2 loài:Salmonella enterica va Salmonella bongori, trong đó S enterica chứa 2443 kiêu

kháng nguyên và S bongori chứ 20 kiểu kháng nguyên S enterica có 6 dưới loài,được đánh số La mã từ I đến VI bao gdm: I (enterica), II (salamae), IIIa (arizonae), IIIb

(diarizonae), IV (houtenae) và VI (indica) [5].

1.2.2.2 Thong tin di truyénTheo kết quả giải trình tự của Deng et al (2003), genome của Salmonella enterica

subs Enterica serovar Typhy dai 4,791 ,96bp., trình tu gene 16S ribosomal RNA cua

Salmonella enterica dai 1 ,534bp., nam ở vị trí từ 287,477dén 289,010 [7]

Salmonella enterica subsp enterica serovar Typhi Ty2, complete genome

GenBank: AE014613.1GenBank FASTA

Link To This Page | Feedback

có khoảng 1.1 ca tử vong và 165 triệu ca bệnh ly hàng năm trên toàn thé giới, trong đótrẻ em dưới 5 tuối có nguy co mac bệnh ly cao Trẻ em bị suy dinh dưỡng dễ nhiễmShigella và Shigella khi nhiễm vào tiếp tục thúc day quá trình suy dinh dưỡng, gâynhiễm trùng định kỳ và làm chậm phát triển.

Shigella là vi khuẩn Gram âm, yếm khí tùy nghi và không di động Đặc điểm sinh

hóa chung cua Shigella là catalase (+), oxidase (-) va lactose (-) Shigella lên men

đường và không sinh khí Ngưỡng nhiệt độ ton tai của Shigella là từ 7 đến 46°C, nhiệtđộ tối ưu là 37°C Chúng có thé tồn tại qua nhiều ngày dưới những điều kiện bat lợi về

mặt vật ly và hóa học, như trong tủ lạnh, tủ đông, 5% NaCl hay môi trường có pH 4.5.

Shigella nhạy cảm với xử lý bằng nhiệt và có thể tiêu diệt bằng thanh trùng Pasteur.Shigella có đặc điểm sinh hóa và huyết thanh giống với enteroinvasive E coli (EIEC),dòng cũng gây ra bệnh tiêu chảy và kiết ly

Ho Shigella gồm có 4 loài: Shigella dysenteriae, S flexneri, S boydii và S sonnei,mỗi loài lại chứa nhiều kiểu huyết thanh khác nhau Trong 4 loài Shigella, S.dysenteriae và S flexneri thường gây ra ngộ độc ở các quốc gia phát triển, S sonni gâyra các ca ngộ độc rãi rác ở các quốc gia công nghiệp, do bị nhiễm vào trong nước hoặcthực phẩm chưa qua chế biến Tại Mỹ, S sooni chịu trách nhiệm cho 2/3 SỐ ca nghi

Shigella flexneri 2a str 2457T, complete genome

GenBank: AE014073.1

GenBank FASTA

Link To This Page | Feedback

cm ook , 2M OOK BM SOOK AM 4,599,354)

© AE014073.1: 213K 216K (3.1Kbp)~ | Find: x|| PO! - + ATs 3Toosy = | ##€onfgure @? 2 ~

thụ và sử dụng thịt gà.

Các loài thuộc Campylobacter là vi khuẩn Gram âm, uốn cong hình chữ S hay dạngque xoắn ốc dài khoảng 0.5-5.0um Campylobacter có roi ở một hoặc cả hai dau.Campylobacter là vi khuẩn vi hiếu khí, sống ở môi trường có nồng độ Op từ 3-5% vàCO; từ 3-10% Trong số các loài vi khuẩn thuộc ho Campylobacter, C coli, C jejuni,C upsaliensis và C lari là vi khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 42°C vàkhông phát triển ở ngưỡng dưới 30°C Hau hết các loài thuộc Campylobater sinhtrưởng kém ở môi trường có nồng độ muối cao (2% NaCl), khô và có độ pH thấp hon4.9 Chúng sử dụng amino acid là nguồn dự trữ năng lượng thay cho đường

Trong số 16 loài thuộc ho Campylobacter, 12 loài được xem là vi khuẩn gây bệnh,bao gom C fetus, C coli, C jejuni, C upsaliensis, C consisus, C curvus va C lari.Việc nhiễm những vi sinh vat này dẫn đến tiêu chảy C jejuni là vi khuẩn thuộc hoCampylobacter pho biến nhất, có mặt trong 95% số vụ ngộ độc.

Động vật là nguồn chứa đựng Campylobacter và có thé tìm thay ở thỏ, chim, cừu,ngựa, bò, heo, gia cầm và cả ở vật nuôi gia đình Vi sinh vật này cũng xuất hiện ở rau,động vật có vỏ và nước Tuy nhiên, nếu chỉ xét trên khía cạnh an toàn vệ sinh thựcphẩm, gia cầm được cho là nguồn gây bệnh chủ yếu bên cạnh việc sử dung sữa chưaqua thanh tiệt trùng hay lây nhiễm do quá trình chế biến thực phẩm Campylobacterspp ton tại ở manh tràng gà với nồng độ trung bình là từ 107-107 cfu.g”, trong đóchiếm chủ yếu 1a C jejuni và C coli [5]

1.2.4.2 Thông tin di truyềnTheo kết quả giải trình tự của Parkhill ef al (2000), genome của Campylobacter

jejuni dài l,641.48lbp Trình tự gene 16S ribosomal RNA của Campylobacter jejuni

dài 1,513bp., nam ở vi trí từ 39,249 đến 40,761 [9]

Campylobacter jejuni subsp jejuni NCTC 11168 complete genomeGenBank: AL111168.1

GenBank FASTA

Link To This Page | Feedback

| Tổ joo K |z00 K 300 K 400 K |E00 K 600 ¡700 K [800 K |300 K 1M 1,100 K JI,200 K JI,300 K (L400 K 1,641,48

Hình 1.4: Vi trí trình tự gene 16S ribosomal RNA cúa Campylobacter jejuni.

1.2.5 Listeria monocytogenes

1.2.5.1 Đặc điểm phân loạiListeria là nhóm vi khuẩn gram dương, hình que, không sinh bao tử Chúng cóchiều đài từ 1-2um, ton tại 6 dang đơn hoặc đôi tế bào Trong một số điều kiện nhấtđịnh về điều kiện sinh trưởng va phát triển, Listeria có thể tồn tại ở dạng chuỗi.Listeria pho biễn trong tự nhiên và có thể sống sót trong những điều kiện môi trường

khắc nghiệt, bao gồm khoảng pH rộng (4.1-9.6), nông độ muối cao (10%) và sự có mặt

của các yếu tố kháng sinh Chúng là vi sinh vật ưa lạnh và có thé sống ở khoảng nhiệt

độ rộng (từ 1-45°C).

Các loài thuộc Listeria có thé được tìm thay ở trong đất, nước, nước thai, thực vậtvà trong đường ruột của gia súc Một phần năm số người khỏe mạnh được cho là cómang Listeria Thịt, rau, cá và các thực phẩm hàng ngày là các nguồn gây bệnh tiêmtàng Thực phẩm được chế biến sẵn như hotdog, pate, cá xông khói, phô mai mềm vàphô mai được làm từ sữa chưa qua thanh tiệt trùng cũng là nguyên nhân gây ra nhiều ca

ngộ độc thực phẩm

Listeria monocytogenes là vi khuan gây bệnh nội bào va ảnh hưởng đến sức khỏe

cũng như làm suy giảm hệ miễn dịch của con người Tỷ lệ tử vong do nhiễm Listeria

monocytogenes có thé lên đến 20-30% Nông độ ô nhiễm Listeria monocytogenes cóthể gây tử vong vào khoảng từ 100 đến 10” tế bào phụ thuộc vào tình trạng miễn dịchcủa vật chủ Trong thử nghiệm ở chuột, chỉ cần một vài cho đến 10 tế bào vi khuẩn làđã có thé gây tử vong Quá trình ủ bệnh của Listeria monocytogenes là từ 3 ngày đến 3tháng phụ thuộc vào tình trạng miễn dịch và số tế bào vi sinh vật bị nhiễm [5]

1.2.5.2 Thông tin di truyềnTheo kết quả giải trình tự của Epie et al (2015), genome của Listeria

monocytogenes dai 2,904,662bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Listeria

monocytogenes dai 1,561bp., nam ở vị trí từ 242,730 đến 244.290 [10]

Listeria monocytogenes strain NE dc2014, complete genome

NCBI Reference Sequence: NZ_CP007492.1

GenBank FASTA

Link To This Page | Feedback

100 K 1h sox |400K JS00K 600K 700K |800K |900K {IM NOOK JJ200K |1300K {400K |1500K |1600K |,700K {800K |1,900K |2M 200K J2/200K |2,300K |2400K |2500K J2600K 2,904,662

© NZ_cP007492.1: 242K 245K (3.1Kbp) + | Find: y || | - + lb Roos» | чomgue @ ? +

242 K 242,200 242,400 242,688 242,880 243 K 243,200 243,400 243,688 243,880 244 k 244,200 244,400 244,600 244,800 245 K

Genes Lộ

>|] rRNA-238 ribosomal.

C82 _RSB1195rRNA-16S ribosomal » L2 » » » » »

Staphylococcus aureus là vi khuan yém khí tùy nghỉ, dương tinh với catalase, pháttriển tốt dưới điều kiện hiếu khí Sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đối glucosedưới điều kiện hiếu khí sẽ là acetoin Chúng có thể lên men manitol và gây ra hiện

tượng tụ huyết S aureus có thé chịu được muối ở nồng độ cao (10-15%) và chịu được

các điều kiện khắc nghiệt như khô và nóng

Staphylococcal nói chung va Staphylococcus nói riêng là một trong những vi sinh

vật gây bệnh trong thực phẩm pho biến nhất Trong những năm 1970 va 1980, mộtphân ba số ca ngộ độc thực phẩm được ghi nhận tại Mỹ có liên quan đến staphylococci.Hiện nay, chủ yếu các ca ngộ độc S aureus được ghi nhận tai Brazil, Ai Cập, Đài Loanvà Nhật Bản và các quốc gia đang phát triển Nguyên nhân gây bệnh thường là donhiễm phải độc tố Staphylococcal enterotoxin (SEs) có mặt trong thực phẩm NhiễmStaphylococcal thường liên quan dến các thực phẩm như sữa, salad, thịt, jambon, cá,động vật có vỏ và các sản phẩm có liên quan đến sữa Staphylococci có thể lây nhiễmthông qua dụng cụ chế biến thực phẩm như dao hoặc tay của người chế biến Độc tốcủa S aureus được sản xuất ở nhiệt độ từ 10 đến 40°C, do đó thực pham để ở nhiệt độphòng trong thời gian ngắn có thé gây ra ngộ độc SEs [5]

1.2.6.2 Thông tin di truyềnTheo kết quả giải trình tự của Holden ef al (2004), genome của Staphylococcus

aureus dai 2,902,619bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Staphylococcus aureus

dài 1,555bp., nam ở vi trí từ 514,251 đến 515,805 [11]

GenBank: BX571856.1GenBank FASTA

Link To This Page | Feedback

Hình 1.6: Vi trí trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Staphylococcus aureus.

1.2.7 Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus va Vibrio vulnificus1.2.7.1 Đặc điểm phân loại

Các loài thuộc chi Vibrio là các vì khuẩn Gram âm, hình que tròn, kích thước chiềudài khoảng từ 1.4 đến 2.6m và chiêu rộng từ 0.5 đến 0.8m Chúng di dộng và sở hữutiêm mao ở một cực của tế bào, là các vi sinh vật yếm khí tùy nghi, hau hết dương tinhvới oxidase và sử dụng D-glucose là nguồn carbon chính Vibrio sản xuất nhiềuenzyme ngoại bào như amylase, gelatinase, chitinase và DNase Một số loài thuộcVibrio là vi sinh vật ưa mặn (chịu được nông độ NaCL 10%) Vibrio phát triển tốttrong khoảng pH từ trung tính đến 9.0 và nhạy cảm với môi trường acid Khoảng pHtối thích là từ 8 đến 8.8 và nhiệt độ phát triển là từ 20 đến 37°C Vibrio có thé đượcphân lập từ nước ngọt, nước mặn cũng như nước lo Vibrio được tim thay ở dạng tự dohoặc liên kết với các bề mặt vô tri hoặc trên các động thực vật thủy sản Vibrio ở dạngliên kết với các sinh vật phù di hoặc động vật có vỏ có thé tồn tại lâu hơn so với dạng

tự do [5].

a Vibrio cholerae

Vibrio cholerae là một trong những vi sinh vật pho biến nhất thuộc chi Vibrio vớihai chủng gây bệnh chủ yếu thuộc hai kiểu huyết thanh O:1 và O:139 Vibrio cholera là

một trong những tác nhân chính gây bệnh tả, theo tổ chức Sức khỏe thế giới World

Health Organization (WHO), chỉ tính trong năm 2005, có khoảng 131,943 ca nhiễm

cholera trong đó có 2,272 ca tử vong ở 52 quốc gia khác nhau

Vibrio cholerae là vi sinh vật Gram âm, dạng que hoặc que tròn (0.7-1.0 x

1.5-3.0m) Chúng là các vi sinh vật yếm khí tùy nghi, khuẩn lạc màu vàng nhạt, trongsuốt, có đường kính từ 2-3mm trên môi trường thạch thiosulfate citrate bile saltssucrose (TCBS) V cholerae có thé phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 15-45°C,khoảng pH từ 6-10 và nồng độ muối khoảng 6% [5]

b Vibrio parahaemolyticus

Vibrio paprahaemolyticus là vi sinh vật gây bệnh ưa mặn, sống ở khoảng nhiệt độtừ 15°C đến 44C và có tiêm mao hai bên hoặc ở đầu Các chủng V parahaemolyticusđược xác định dựa trên kháng nguyên soma (O) hoặc kháng nguyên vỏ (K), kiểu huyếtthanh gây bệnh pho biến nhất là O3:K6

V parahaemolyticus phân bỗ nhiều ở vùng nước mặn ven biến khắp thé giới Mứcđộ xâm nhiễm của V parahaemolyticus phụ thuộc vào nhiệt độ nước, vi sinh vật phùdu và nồng độ oxy hòa tan Các quốc gia có khí hậu ôn đới có số ca mắc bệnh nhiềuhơn các quốc gia nhiệt đới vào mùa hè, còn ở các quốc gia nhiệt đới, do nhiệt độ 4m ápquanh năm, các ca mắc bệnh cũng rãi rác quanh năm chứ không tập trung theo mùa.Các ca ngộ độc do nhiễm V parahaemolyticus thường liên quan đến việc tiêu thụ hải

sản đặc biệt là là hau và các động vật có vỏ [5].

c Vibrio vulnificus

Trong sô các si sinh vật gây bệnh thuộc chi Vibrio, Vibrio vulnificus là loài gaybệnh nguy hiém nhat đôi với con người va dan dau sô ca tử vong liên quan dén hai sảntại Mỹ với trung bình 40 ca hăng năm Sô ca ngộ độc cũng rât cao ở Nhật Bản do bờbiên am ap va thói quen tiêu thụ hải sản tươi sông V vulnificus gây ra hội chứng

nhiêm khuân máu, nhiém khuân vét thương và viêm nhiêm đường tiêu hóa ở người.Hội chứng nhiém khuân máu và nhiêm khuân vết thương diễn tiên rat nhanh chóng và

có thé khiến người bệnh tử vong trong vòng 24h do sốc nội độc tố [5]

1.2.7.2 Thông tin di truyềnTheo kết quả giải trình tự của Folster et al (2015), genome của Vibrio cholerae dài3,043.139bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Vibrio cholerae dai 1,550bp., namở vi tri từ 235,186 đến 236,735 [12]

Theo kết quả giải trình tự của Mariko et al (2003), genome của Vibrio

parahaemolyticus dài 3,288,558bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Vibrio

parahaemolyticus dai 1 A71bp., nam ở vi tri từ 33,633 đến 35,103 [13].Theo kết quả giải trình tự của Lo et al (2014), genome của Vibrio vulnificus dài

3,315,989bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Vibrio vulnificus dai 1,554bp.,

nam 6 vi tri tir 25,292 dén 26,845 [14]

Vibrio cholerae strain 2012EL-2176 chromosome 1, complete sequenceNCBI Reference Sequence: NZ_CP007634.1

GenBank FASTA

Link To This Page | Feedback

] P ¡300 K JE00 K 800 K liàu [1,200 K (1,400 K [1,600 K (1,800 K 21 |2,200 K |2,400 K |2,e00 K | 3,043,139

© NZ_CP007634.1: 234K 238K (3.1Kbp)~ | Find: ~||<aod| - Ï + «ate PWTooisy = | ##Confgure G P ~

EH18_ES81858tRNA-Glu BESTS Markers

(B)Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome 1, complete sequence

NCBI Reference Sequence: NC_004603.1GenBank FASTA

Link To This Page | Feedback

|200 K 400 K E00 K 800 K [1M [1,200 K (1,400 K [1,600 K {1,800 K |2M |2.200K J2400K |2,600K |2/800K |3M 3,288,559

we of ee CS Oe) Ce ee CO ee [8 "„' ˆ' HH ' ane eee eee CE CG CCAM PCR ee eT

S NC_004603.1: 33K 36K (2.9Kbp)~ | Find: ~||<eo| -=— _i + đề Riools~ = | MEconfigure @ '2 ~b |33 K |2s.2aa |33.4aa [33.600 |33.800 |34 K |34.2aa |34.4aa [34.600 |34.800 |35 K [35,200 [35.498 |s.saa |35

Vibrio vulnificus strain 93U204 chromosome I, complete sequence

NCBI Reference Sequence: NZ_CP009261.1GenBank FASTA

Link To This Page | Feedbacka |200 K ¡200 K js00 K js00 K yim L200 K ¡1,400 K jL.S00 K jL.800 K j2m |2.200 K |2.400 K |2.600 K |2.800 K #1 3,315,989

& NZ_CP009261.1: 25K 28K (3.1Kbp)~ | Find: aloo - ——(i + «Te PRioots~ = | MEconfigure @’ 2 ~

Hình 1.7: Vi trí trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Vibrio cholerae (A),

Vibrio parahaemolyticus (B) va Vibrio vulnificus (C).

1.2.8 Clostridium botulinum và Clostridium perfringens1.2.8.1 Đặc điểm phân loại

a Clostridium botulinum

Clostridium botulinum là vi khuẩn Gram duong, ky khi bat buộc va có dang hinhque tròn Chúng sinh san trong ruột va bao tử có thé tìm thay trong đất và thực vật.Neurotoxin (chất độc thần kinh) ở C botulinum được sản xuất ở nhiệt độ thấp từ 3”Cđến 15°C C botulinum không thé phát triển ở khoảng pH dưới 4.6, bào tử của chúngnhạy cảm cao với nhiệt độ C.botulinum thông thường là vi sinh vật gây bệnh yếu dokha năng tôn tại trong cơ thé người là không cao Tuy nhiên, bào tử tôn tại trong thựcphẩm nếu chịu được nhiệt độ cao có thé chuyển sang dạng tế bao sinh dưỡng Ở dangtế bảo sinh dưỡng, chúng phát triển dưới điều kiện ky khí và sản sinh độc tố botulinumgây nguy hiểm cho con người [5]

b Clostridium perfringens

Clostridium perfringens là vi khuan Gram dương, dạng hình que tròn, phan lớnsống ky khí tuy nhiên một số chung là hiếu khí Chúng không di động va san sinh vòngphân giải đôi huyết tương khi nuôi trên môi trường thạch máu Vùng phân giải rõ là do

perfringolysin O (theta-toxin) và vùng không rõ ràng là do phospholipase C

(alpha-toxin) Nhiệt độ tôi tích của C perfringens là từ 43-45°C, chúng không thé phát triểndưới 15°C, pH tối thích là từ 5-9.0 C perfringens có thé tồn tại và phát triển trong môitrường có nồng độ muối cao (chứa 330ppm sodium nitrate và 4-6% NaCl).C.perfringens cần đến 12 amino acid và vitamin khác nhau dé có thé phát triển bìnhthường, do đó mà chúng thường được tìm thấy ở thực phẩm liên quan đến thịt

Từ năm 1992 đến năm 1997, có tổng cộng 248,520 số ca nhiễm C perfringensđược ghi nhận bởi CDC Riêng trong năm 1993, có đến 10,000 ca nhiễm C

perfringens với 100 ca tử vong được ghi nhận [5].

1.2.8.2 Thông tin di truyềnTheo kết quả giải trình tự của Sabaihia et al (2015), genome của Clostridium

botulinum dài 3,886,916bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Clostridium

botulinum dài 1 442bp., nam ở vị tri từ 9,294 đến 10,735 [15].Theo kết quả giải trình tự của Shimizu et al (2002), genome của Clostridium

perfringens dai 3,031,430bp., trinh tu gene 16S ribosomal RNA cua Clostridium

perfringens dài 1508bp, nam ở vi tri từ 10,173 đến 11,680 [16]

(A)

Clostridium botulinum A str ATCC 3502 complete genome

GenBank: AM412317.1GenBank FASTA

Link To This Page | Feedback[200K J400 K JB00K J800 K {IM {1,200 K {1,400 K {1,600 K [1,800 K Jzw 2/200 K J2,400 K J2,800 K J2,800 K 3 J3,200 K [3,400 K J3,800 K 3,886,316

ee ng er ee) vt Am W Tự ua Sa were TEE vit TY CC ng

———— rRNA-23S ribosomal BE

16S rRNArRNR-16S ribosomal [ERIE —

Repeat region *

(B)

Clostridium perfringens str 13 DNA, complete genome

GenBank: BA000016.3GenBank FASTA

Link To This Page | Feedback

a \200 K ¡400 K |S00 K |800 K I1 (1,200 K 1,400 K |1,600 K 1,800 K J21 J2,200 K J2,400 K |2,B00 K | 3,031,430S BA000046.3: 9.4K 12K (3.0Kbp)~ | Find: || a - + ate 3 Toos~ = | Á#Confgure @? 2 ~

488 |3.600 [9.800 |ta K [19,200 |ia,4aa [19,600 [19.800 |1 K [11.200 [11.400 [11.600 [11.800 |1z K {12,200 Jtz

Genes *%

rrnR-16S

rRNA > > > > > rRNA EE >>ees

Hình 1.8: Vi trí trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Clostridium botulinum

(A), Clostridium perfringens (B).

1.2.9 Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis va Yersinia pestis1.2.9.1 Đặc điểm phân loại

a Yersinia enterocolitica

Yersinia enterocolitica là vi khuẩn Gram âm, dạng que ngăn, sống yếm khí tùy nghi.Y enterocolitica phát triển ở khoảng nhiệt độ từ 0 đến 44°C, nhiệt độ tối ưu là từ 25đến 29°C Chúng có thể phát triển trong sữa hoặc thịt sống ở ngưỡng I°C với tốc độchậm Y enterocolitica có thé phát triển ở 5% NaCl và pH dưới 4.6, khoảng pH tôn tạicủa chúng là từ 4-10 Yersinia phát triển chậm, khuẩn lạc thường xuất hiện sau 24hnuôi cây trên môi trường thạch máu cừu, thạch MacConkey và thạch Hektoen-Enteric

Chúng lên men đường sucrose nhưng không lên men được lactose.

Yersinia enterocolitica tôn tại phố bién trong tự nhiên, bao gồm nước, nước thải,thực phẩm và động vật Trong đó, heo là nguồn mang chủ yếu các chủng gây bệnh cóthé lây nhiễm cho con người Có đến 35-70% số đàn heo chứa cá thé mang chủng gâybệnh thuộc Yersinia enterocolitica Các chủng phân lập từ tự nhiên thì hầu hết khônggây bệnh và thuộc nhóm 1A Dịch bệnh đầu tiên gây ra bởi Y enterocolitica phát hiệnở Mỹ ảnh hưởng đến 222 trẻ em do sử dụng sữa sô cô la nhiễm bắn, kiểu kháng nguyên

phát hiện chịu trách nhiệm là O:8 [5].

b Yersinia pestis

Yersinia pestis là vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Bệnh dịch hạch lần dau tiên ghi

nhận vào khoảng năm 430 trước công nguyên tại Athens, bệnh dịch hạch cũng là

nguyên nhân gây ra “cái chết đen” thời trung cô tại châu Âu Y pestis chịu trách nhiệmcho ba ca đại dịch lớn nhất trong lịch sử nhân loại, với hơn 200 triệu ca tử vong trongvòng 1,500 năm Y pestis lây sang người chủ yếu do nguyên nhân tiếp xúc với độngvật gặm nhắm và bọ chét được coi là vật chủ trung gian Y.pesfis tấn công các tế bào

lympho và gây viêm, nhiêm, áp xe và hình thành nên các hạch nôi.

Yersinia pestis không di động, không sinh bào tử Nhiệt độ tối thích của chúng là28°C, khoảng nhiệt độ sinh trưởng và phát triển là từ 4-40°C Yersinia pestis là vikhuẩn tùy nghi và tổn tại ở 3 dạng: antiqua, medievalis va orientalis Các dạng tổn tạicủa chúng được phân biệt dựa trên khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau Antiqua

dương tính với glycerol, arabinose và nitrate; medievalis cũng dương tính với glycerol,arabinose nhưng âm tinh với nitrate trong khi orientalis âm tính với glycerol, arabinose

nhưng dương tinh với nitrate Cac dạng tồn tại khác của Y pesfis được xếp vào dạngmicrotus, dang này thường có đặc điểm dương tính với glycerol nhưng âm tính với

arabinose va nitrate [5].

c Yersinia pseudotuberculosis

Yersinia pseudotuberculosis là vi khuân Gram âm gây ra bệnh sot Viên Đông ở

người, lây nhiễm chủ yếu qua con đường thực phẩm.Ở người, triệu chứng sốt Viễn Đông tương tự với triệu chứng nhiễm Yersiniaenterocolitica là sốt và đau bụng phía bên phải, trừ triệu chứng tiêu chảy thường khôngxuất hiện Việc nhiễm Yersinia pseudotuberculosis có thé gây nên những triệu chứnggiống với triệu chứng viêm ruột thừa, đặc biệt là trẻ em và trẻ vị thành niên Trong mộtsố trường hợp đặc biệt, việc nhiễm tác nhân gây bệnh này có thé gây ra tình trạng viêm

da, cứng, đau khớp hoặc nhiễm trùng máu

Các triệu chứng của bệnh sốt Viễn Đông thường xuất hiện sau 5 đến 10 ngày ủbệnh, và thường kéo dài từ 1 đến 3 tuần nếu không chữa trị Đối với những bệnh nhânbị suy giảm hệ miễn dịch, phải được chữa trị băng các kháng sinh amplicillin,

aminoglycosides, tetracycline, chloramphenicol hoặc cephalosporin mới có hiệu qua.

Về mặt di truyền, Yersinia pseudotuberculosis rat tương đồng với Yersinia pestis.Yersinia pestis được cho là phát triển từ Yersinia pseudotuberculosis khoảng 1,500 đến

2,000 năm trước [17, 18].

1.2.9.2 Thơng tin di truyềnTheo kết quả giải trình tự của Thomson et al (2006), genome của Yersinia

enterocolitica dài 4,615 ,899bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Yersinia

enterocolitica dai | A89bp, nằm ở vị trí từ 17,506 đến 18,994 [19].Theo kết quả giải trình tự của Johnson et al (2015), genome của Yersinia

pseudotuberculosis dai 4,728 ,337bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Yersinia

pseudotuberculosis dai 1,531bp., nằm ở vi trí từ 429,951 đến 431 481 [20].Theo kết quả giải trình tự của Song er al (2004), genome của Yersinia pestis dài4.695 065bp trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Yersinia pestis dài 1.439bp., namở vị trí từ 12,057 đến 13,545 [21]

(A)Yersinia enterocolitica subsp enterocolitica 8081 complete genome

GenBank: AM286415.1GenBank FASTA

Link To This Page | Feedback

hÌ Je00 K jm |.500 K 21 \2,500 K 31 ¡3,600 K J4 1 4,515,899

S&S AM286415.1: 17K 20K (3.0Kbp)~ | Find: ~|| | - | + dle 3 Toos- = | KEConfigure @? 2 ~

[16.800 \t7_k [17,200 |17,.400 |17,saa |1?.eaa |18 K |is.zaa |is.4øa |18,sà |is.saa |1 K |i2,2aa |is.4øa |i2.saa

Genes *

16S rRNArRNA-16S ribosomal > > 5 > > rRNA-23S ribosomal HE

tRNA-Glu (TTC)

MS cricica.i tRNA-Glu BERepeat region *

(B)

Yersinia pseudotuberculosis strain 1, complete genome

GenBank: CP009786.1GenBank FASTA

Link To This Page | Feedback

} om K ym ¡so K 21 |2,500 K J2 t1 |3,500 K jam 4,728,337)

S&S CP009786.1: 429K 432K (3.1Kbp)x | Find: >x.|l Œa¬E>I - I + «ate PToots~ = | ##tConfigure D P~

Yersinia pestis biovar Microtus str 91001, complete genome

GenBank: AE017042.1GenBank FASTA

Link To This Page | Feedback

Fi S00 K 1M 1,500 K 2M |2,500 K 3M 3,500 K 4 P1 4,595,065

AE017042.1: 11K 14K (3.0Kbp) ~ Find: v - + Ate Tools~y = Configure ge 2 voe = x ¢

[11.466 11.668 11,866 12 K |i2.2aa 12,408 12,668 j12,800 |13 K 13.200 13,408 [13,606 13,800 14 K |I4,28EGenes *

YP.ri

rRNA-16S ribosomal ES rRNA-23S ribosomal BE

YP_t1——= 1 ` *RNA-GluRepeat region *

Hình 1.9: Vi trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Yersinia enterocolitica

(A), Yersinia pseudotuberculosis (B) va Yersinia pestis (C).

1.2.10 Bacillus cereus

1.2.10.1 Đặc điểm phân loạiBaciluus cereus là vi khuẩn Gram dương, dương tính với thử nghiệm phân giải ureavà nhạy với penicillin Bacillus cereus là vi sinh vật phô biến trong tự nhiên, là vi sinhvật cơ hội và gây ngộ độc cho co thé người qua con đường ăn uống với các triệu chứngtiêu chảy và đầy hơi hoặc nôn và buồn nôn Ở cơ thé người khỏe mạnh nhưng hau hết

là ở những người bị suy giảm hệ miễn dịch hoặc bệnh nhân sau phẫu thuật, B cereus

gây nên các triệu chứng nhiễm trùng máu, viêm nội mac, nhiễm trùng da, viêm phôi vaviêm màng não B cereus tuy được tìm thay trong nhiều loại thực phẩm, chúng cũng làthành phan quan trọng trong hệ sinh thái đất B cereus cũng được tìm thấy trong hệđường ruột của động vật không xương sống, không chỉ ở dạng bào tử mà còn ở dạng tếbào sinh dưỡng B cereus cũng mang gene Cry giống với B thuringiensis Không cóyếu tô gây độc nào được tìm thay đặc trưng cho B cereus, một số protein vốn được cholà đặc trưng cho B cereus cũng được tìm thay ở B thuringiensis

Các ca nhiễm Bacillus cereus liên quan đến việc sử dụng ngũ cốc hay soup Triệuchứng nôn và buôn nôn thường liên quan có liên quan đến pasta, gạo, thịt bò, thịt giacầm, sốt vanilla và hay bắt gặp ở trẻ sơ sinh Trong khi triệu chứng tiêu chảy thườngchủ yếu liên quan đến sử dụng thịt, cá, soup, các loại rau như ngô, bột ngô, khoai tâynghiền cũng như các thực phẩm từ sữa B cereus có thé tạo nên lớp kem ở sữa do hoạt

động cua lecithinase B cereus có thể kết tụ lại ở sữa có pH thấp Sữa tươi có thể bị

nhiễm B cereus từ trang trại nếu vú sữa của bò không được vệ sinh sạch sẽ Bên cạnhđó, bao tử chịu nhiệt của B cereus có thé sống sót qua thanh trùng Pasteur [5]

1.2.10.2 Thông tin di truyềnTheo kết quả giải trình tự của Takeno e al (2012), genome của Bacillus cereus dai

khoáng 5,221,581bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Bacillus cereus đài

BCN_J6SrRNAGL BCN_tRNAGOL

rRNA-16S ribosomal tRNA-Ile BE

BCN_tRNAGBZtRNA-Alo BE

Hình 1.10: Vi trí trình tự gene 16S ribosomal RNA cua Bacillus cereus.