Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của rễ thương lục (Phytolacca Americana)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA THÁI THỊ NGUYÊN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA RỄ THƯƠNG LỤC PHYTOLACCA... NHIỆM VỤ VÀ NỘ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

THÁI THỊ NGUYÊN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ HOẠT

TÍNH SINH HỌC CỦA RỄ THƯƠNG LỤC (PHYTOLACCA

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS TS TRẦN CÔNG LUẬN

2 Thư ký hội đồng: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG 3 Ủy viên Phản biện 1: TS TRẦN TRUNG HIẾU

4 Ủy viên Phản biện 2: TS HOÀNG MỸ DUNG 5 Ủy viên Hội đồng: PGS TS LÊ PHI NGA

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH

KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: THÁI THỊ NGUYÊN MSHV: 12310741 Ngày, tháng, năm sinh: 28/06/1983 Nơi sinh: Tỉnh Quảng Trị Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 60 42 80

I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của rễ

thương lục (Phytolacca americana)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Khảo sát hóa thực vật của rễ cây thương lục, xác

định hoạt tính kháng vi sinh vật, hoạt tính kháng oxy hóa ở các phân đoạn cao, độc tố từ rễ thương lục Tách chiết hợp chất ở phân đoạn cao n butanol

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 11/01/2016 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2016 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS TS Trần Công Luận

Tp HCM, ngày tháng năm 2016

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên và chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA….……… (Họ tên và chữ ký)

 Các thầy cô, anh chị và các bạn ở Trung tâm Sâm và Dược liệu TP HCM đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi và môi trường làm việc vui vẻ trong thời gian tôi thực hiện đề tài ở đây

 Anh Phùng Văn Trung trưởng phòng hóa học các hợp chất thiên nhiên ở viện Công nghệ hóa học đã giúp tôi trong quá trình tách các hợp chất hóa học

 Các thầy cô và các anh chị ở phòng vi sinh và phòng ký sinh trùng Khoa dược Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện luận văn này

 Cuối cùng tôi xin chân thành cám ơn gia đình và bạn bè tôi, những người đã luôn bên tôi động viên giúp đở để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2016

TÓM TẮT

Thương lục (Phytolacca ameriacana) là loài cây có khả năng trị các bệnh như

phù thủng, u nhọt, bệnh ngoài da Tuy nhiên, đây lại là loài cây có độc tính, việc sử dụng nhiều có thể gây ngộ độc, dẫn tới tử vong Trong một nghiên cứu nhằm xác định các thành phần hóa học cũng như các đặc tính sinh học của loài thực vật này, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của rễ

thương lục (Phytolacca ameriacana)”

Nghiên cứu của chúng tôi gồm hai nội dung chính Trước tiên, chúng tôi xác định một số chỉ tiêu cơ bản của dược liệu Giai đoạn hai, chúng tôi xác định một số đặc tính sinh học như: khả năng chống oxy hóa và nồng độ ức chế tối thiểu các vi sinh vật, phân đoạn có khả năng kháng vi sinh tốt được tiến hành sắc ký cột để cô lập và xác định cấu trúc hóa học một số hợp chất

Kết quả nghiên cứu cho thấy rễ cây thương lục chứa các nhóm chất như triterpenoid, saponin, chất khử, polyuronic với hàm lượng tương đối cao Trong đó, hàm lượng saponin toàn phần khoảng 2,95% Kết quả thử độc cấp tính cũng cho thấy rễ cây thương lục có độc tính khá cao với liều LD50 trên chuột đạt 11,38 g/kg Khả năng kháng vi sinh vật không phải là ưu điểm của rễ cây thương lục Trong số 5 loại cao chiết khảo sát, chỉ có cao n butanol là có khả năng kháng tất các các vi sinh vật

khảo sát (Staphylococcus aureus, E coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa,

Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Aspergillus niger với chỉ số MIC lần

lượt là 60; 30; 3,75; 30; 0,256; 2,048 và 2,048 mg/ml) Khả năng chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự cao etyl acetate, cao n hexan, cao metanol, cao n butanol và cao nước với giá trị IC50 lần lượt đạt 337,728; 578,118; 815,718; 833,775 và 1608,565 (µg/ml) Tiến hành sắc ký cột và phân tích dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, chúng tôi xác định được trong cao n butanol có chứa 2 hợp chất là Adenosine

và Phytolaccoside E

ABSTRACT

Phytolacca ameriacana is a plant which can treat some diseases such as oedema,

pimple, skin However, this plant has toxicity, using it a lot can be poisoned and lead to death In a study aim to define chemical components and biology characteristics of this plant, we carried out the thesis: “Researching chemical components and testing

biology characteristic of the root of Phytolacca ameriacana”

The study consisted of 2 main parts Firstly, we determined some basic specifications of medicine Secondly, we determined some biology characteristics such as: the ability of oxidation resistance and MIC The fragment can resist well microbiology will be extracted by chromatography column

The results showed that the root of Phytolacca ameriacana contains some

compounds with high content such as triterpenoid, saponin, polyuronic Among that, the quantity of total saponin is about 2,95% The result of testing acute toxicity also showed that the root of this plant contains high toxicity with dose LD50 on mouse is

11,38 g/kg The ability of microbiology resistance was not the strength of Phytolacca

ameriacana Among 5 fragment extracts were surveyed, only n butanol extract had

ability to resist all given microbiology (Staphylococcus aureus, E coli, Bacillus

subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Sacchromyces cerevisiae, Candida albicans, Aspergillus niger with MIC indicator respectively was 60; 30; 3,75; 30; 0,256; 2,048

và 2,048 ( mg/ml) The ability of oxidation resistance in descending order was ethyl acetate extract, n hexan extract, methanol extract and n butanol extract with IC50 values archived 337,728; 578,118; 815,718; 833,775 and 1608,565 (µg/ml) respectively Carrying out chromatography columm and analyzing the data of 1H, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC and HMBC spectrogram, we found that n butanol extract contains

Adenosine and Phytolaccoside E

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả của luận văn là do tôi làm không sao chép lấy kết quả từ một nguồn khác

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CFU: (Colony forming unit) đơn vị tạo khuẩn lạc EtOAc: Etyl acetate

DPPH: 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl DMSO: Dimethylsulphoxide

HPLC: High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

MHA: Mueller Hinton Agar (Môi trường Mueller Hinton) MIC: Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)SDA: Sabrouraud Dextrose Agar

SKLM: Sắc ký lớp mỏng TSA: Tryptic Soy Agar

Hình 3.2: Sắc ký lớp mỏng cao metanol tổng và các phân đoạn Hình 3.3: Định tính hoạt tính kháng oxy hóa các phân đoạn cao Hình 3.4: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao metanol Hình 3.5: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao n hexan Hình 3.6: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao etyl acetate Hình 3.7: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao n butanol Hình 3.8: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao nước Hình 3.9: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của chứng dương vitamin C Hình 3.10: Kết tinh của hợp chất MN1

Hình 3.11: Sắc ký lớp mỏng chất MN1 hệ 1Hình 3.12: Sắc ký lớp mỏng chất MN1 hệ 2Hình 3.13: Sắc ký lớp mỏng chất M2 hệ 1 Hình 3.14: Sắc ký lớp mỏng chất M2 hệ 2 Hình 3.15: Các tương tác HMBC chính và cấu trúc của hợp chất MN1 Hình 3.16: Các tương tác HMBC chính và cấu trúc của hợp chất M2

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các phytolaccoside trong rễ thương lục Bảng 2.1: Các phản ứng hóa học định tính những nhóm hợp chất Bảng 2.2: Thể tích các hóa chất và mẫu thử sử dụng

Bảng 3.1: Độ ẩm bột dược liệu Bảng 3.2: Độ tro toàn phần Bảng 3.3: Độ tro không tan trong HCl Bảng 3.4: Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật trong rễ thương lục Bảng 3.5: Kết quả định lượng saponin toàn phần trong rễ thương lục Bảng 3.6: Bảng kết quả độc tính cấp cao metanol rễ thương lụcBảng 3.7: Kết quả thu cao toàn phần từ rễ thương lục

Bảng 3.8: Kết quả thu cao phân đoạn bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng Bảng 3.9: MIC (mg/ml) của các mẫu cao trên các vi khuẩn

Bảng 3.10: MIC (μg/ml) của các mẫu cao trên các nấm Bảng 3.11: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao chiết metanol Bảng 3.12: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao chiết n hexanBảng 3.13: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao chiết etyl acetateBảng 3.14: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao chiết n butanol Bảng 3.15: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao nước

Bảng 3.16: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH của chứng dương vitamin CBảng 3.17: Giá trị IC 50 của các phân đoạn cao

Bảng 3.18: Kết quả sắc ký qua cột cổ điển

Bảng 3.19: Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR, HMBC của MN1 và so sánh với tài liệu tham khảo

Bảng 3.20: Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR, HMBC của MN1 và so sánh với tài liệu tham khảo

MỤC LỤC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ii

LỜI CÁM ƠN iii

TÓM TẮT iv

ABSTRACT v

LỜI CAM ĐOAN vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG ix

MỤC LỤC xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về cây thương lục: 3

1.1.1 Danh pháp và phân loại: 3

1.2 Tình hình nghiên cứu thương lục: 9

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới: 9

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam: 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu 20

2.2.1.1 Xác định độ ẩm dược liệu 20

2.2.1.2 Xác định tro toàn phần: 20

2.2.1.3 Xác định tro không tan trong acid clohydric 21

2.2.1.4 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học: 21

2.2.2 Định tính và định lượng saponin chứa trong nguyên liệu: 24

2.2.2.1 Định tính saponin trong nguyên liệu: 24

2.2.2.2 Định lượng saponin bằng phương pháp Namba: 25

2.2.3 Khảo sát độc tính cấp 25

2.2.4 Phương pháp chiết xuất dược liệu và thu phân đoạn cao 27

2.2.4.1 Chiết xuất cao toàn phần 27

2.2.4.2 Chiết các phân đoạn cao từ cao toàn phần 27

2.2.4.3 Sắc ký lớp mỏng (SKLM) 30

2.2.5 Khảo sát hoạt tính sinh học: 30

2.2.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật 30

2.2.5.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa: 31

2.2.6 Phân lập các hợp chất: 35

2.2.6.1 Sắc ký cột cổ điển: 35

2.2.6.2 Sắc ký trung áp: 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 38

3.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu: 38

3.1.1 Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu 38

3.1.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật: 39

3.1.3 Kết quả định tính và định lượng saponin: 40

3.1.4 Kết quả độc tính cấp: 42

3.2 Chiết xuất dược liệu và thu cao phân đoạn: 43

3.2.1 Kết quả chiết xuất cao toàn phần: 43

3.2.2 Kết quả chiết cao phân đoạn 43

3.2.3 Kết quả sắc ký lớp mỏng phân đoạn cao: 44

3.3 Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học của rễ thương lục: 46

3.3.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật: 47

3.3.2 Kết quả kháng oxy hóa: 49

3.3.2.1 Định tính hoạt tính kháng oxy hóa: 49

3.3.2.2.Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa trên các phân đoạn cao: 50

3.4 Kết quả phân lập hợp chất: 57

3.4.1 Phân lập các hợp chất: 57

3.4.2 Xác định cấu trúc của các hợp chất: 63

3.5 Đánh giá về hai hợp chất MN1 và M2: 71

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72

4.1 Kết luận: 72

4.2 Kiến nghị: 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

PHỤ LỤC 79

MỞ ĐẦU

Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, khoa học kỹ thuật ngày càng phát triễn để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con người Song song với những tiện lợi của cuộc sống hiện đại thì vấn đề về môi trường, sức khỏe cũng đặt ra nhiều thách thức Chất lượng cuộc sống ngày càng cao thì vấn đề sức khỏe ngày càng được quan tâm trong xã hội Con người từ xưa đến nay đã biết sử dụng thuốc để chống chọi bệnh tật và phục hồi sức khỏe cho con người Khi dùng thuốc điều mà ta quan tâm là hiểu rỏ về tác dụng của nó để tránh những trường hợp ngộ độc hay những tác dụng phụ của thuốc Ngày nay khi mà hầu hết các bệnh thông dụng đều có các loại thuốc thông dụng để điều trị thì điều được quan tâm là tác dụng phụ của thuốc, để đáp ứng vấn đề này thì các thuốc có nguồn gốc tự nhiên đang được nghiên cứu để có những ứng dụng nhiều hơn Một trong những nguyên liệu có nguồn gốc thiên nhiên đáng được quan tâm đó là thực vật

Thương lục (Phytolacca acinosa Roxb, thương lục Mỹ Phytolacca

americana) là một cây thuốc có nguồn góc từ vùng Bắc Mỹ được du nhập vào Việt

Nam Đây là loại cây có củ nhìn giống củ nhân sâm nhưng công dụng dược lý của nó thì hoàn toàn khác, trong dân gian thương lục dùng để trị những bệnh như phù thũng, mụn nhọt, bệnh ngoài da với liều lượng nhỏ Một điều đáng lưu ý ở đây mặc dù là một cây thuốc nhưng thương lục có tính độc có thê gây ngộ độc có thể dẫn tới tử vong nếu uống quá liều lượng

Ở Việt Nam những năm gần đây cũng có những trường hợp ngộ độc đáng tiếc xảy ra khi người dân nhầm tưởng thương lục với nhân sâm Để giúp hiểu rỏ hơn về thương lục cũng như tránh sự nhầm lẫn giữa thương lục với nhân sâm mà tôi

chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của rễ

thương lục (Phytolacca ameriacana)” Với mong muốn đưa ra những hình ảnh,

một số công dụng của cây thương lục cũng như biết được độc tính của thương lục, giúp mọi người thận trọng hơn khi sử dụng những bài thuốc có sử dụng thương lục với những liều lượng phù hợp

Đề tài xây dựng với những nội dung sau:

- Xác định được độc tính cấp trên chuột của rễ thương lục - Xác định được hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng oxy hóa của rễ thương

lục

- Phân lập được một số hợp chất chứa trong rễ thương lục

Nhằm mục đích biết được thành phần một số hợp chất chứa trong rễ thương lục, cẩn thận với liều lượng sử dụng thương lục khi sử dụng làm thuốc chữa bệnh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cây thương lục:

1.1.1 Danh pháp và phân loại: [9], [15], [22], [26]

Cây thương lục còn được biết đến với các tên gọi khác thủy la bặc, sơn la bặc, trưởng bất lão, kim thất nương, … tên tiếng Anh pokeweed, pokesallet, pokeberry,

Thương lục Mỹ có tên khoa học là Phytolacca americana (còn có tên khác

Phytolacca decandra) nằm trong hệ thống phân loại như sau:

Cây thương lục Mỹ cao 2 ÷ 3 mét, cành thường có màu đỏ tía Hoa mọc thành chùm màu trắng sau chuyển sang hồng

Quả có tới 10 múi trong đó có hạt Cây thương lục Mỹ được trồng làm cảnh và làm thuốc Trồng bằng hạt hay mầm rễ

1.1.3 Sinh thái học và phân bố:

Thương lục là cây ưa ẩm và có thể hơi chịu bóng Cây sinh trưởng và phát triễn tốt trong điều kiện ẩm mát quanh năm; với nhiệt độ không khí trung bình là 15

(c) (a)

(d)

(b)

÷ 18 0C Thương lục ra hoa quả nhiều hàng năm Dưới gốc cây mẹ, thường thấy các cây con mộc từ hạt và sẽ có hoa quả ngay trong năm đầu tiên [9]

Thương lục có nguồn gốc từ Bắc Mỹ sau đó du nhập vào châu Âu (Sauer 1952) Sau đó lan sang các châu lục khác và bây giờ có mặt ở Nam Phi, Nhật Bản, Australia, New Zealand, Argentina, … (Edwards et al 1988) [21]

 Flavonoid trong lá kaempferol và quercetin

 Kaempferol bao gồm các hợp chất: ᴅ-glucopyranoside,

3-O-α-ᴌ-rhamnopyranosyl (1→2) β-ᴅ-glucopyranoside, 3-O-diglucoside

 Quercetin có 3-O-glucoside Acid phenolic bao gồm các chất: p-hydroxybenzoic, vanillic, sinapic, p-coumaric, ferrulic và caffeic

24-methylenedammarenol, α-amyrin, β-amyrin, lupeol, germanicol, taraxasterol,

ψ-taraxasterol, taraxerol và myricadiol.[43]

Bên cạnh đó những neolignans có tên americanins A, B, D và isoamericanin A cũng được tìm thấy trong hạt thương lục

 Một thành phần đang được quan tâm là protein thương lục, protein thương lục được gọi là PAP (pokeweed antiviral protein) là một loại protein có tính kháng virus được biết đến năm 1925 (Duggar and Amstrong 1925) Chiết suất của thương lục cho thấy hoạt động ức chế truyền virus ở thực vật (Wyatt và Sheperd 1969), sự sao chép virus cúm (Tomlinson et al 1974) và virus bại liệt (Ussery et al 1977) trong tế bào động vật [22]

 PAP là một loạt các đồng vị các PAP khác nhau, protein PAP đầu tiên được báo cáo là một protein 13 kDa (Wyatt và Schepherd 1969), sau đó các đồng vị khác được tìm thấy PAP II 30 kDa (Irvin et al 1980), PAP – S (31 kDa) (Barbieri et al 1982) và PAP – R 30 kDa được phân lập từ rễ (Bolognesiet al 1990) Tất cả các PAP thuộc lại protein – ribosom bất hoạt gọi tắt là RIP

1.1.5 Công dụng và bộ phận dụng: [1], [8], [30], [33]

 Thân và lá:

Thân và lá luộc chín thì được dùng như một loại rau thực phẩm

 Quả:

Quả được sử dụng làm một loại bánh và ngày xưa người châu Âu dùng quả

như một loại màu thực phẩm để nhuộm rượu vang

Quả thương lục cũng được dùng để chữa bệnh thấp khớp, viêm khớp

 Rễ:

Rễ thương lục trong dân gian được sử dụng như một loại thuốc để chữa các bệnh như viêm kết mạc, thấp khớp mãn tính, rối loạn tiêu hóa, ung thư, các bệnh ngoài da như nấm, ghẻ lở

Trong y học cổ truyền dùng để chữa các bệnh phù thũng, trương mãn, cước khí, mụn nhọt, đầu đinh, vàng da Liều dùng: 4,5 – 10 g/ ngày, dưới dạng nước sắc

hoặc thuốc bột Dùng ngoài, đắp tại chổ

Dịch chiết rễ thương lục dùng như một loại thuốc trị bệnh ngoài da Saponin trong thương lục được biết đến với tác dụng kháng viêm Ngoài ra thương lục còn kết hợp với một số vị thuốc khác để chữa một số bệnh mỏi mệt toàn thân, đi tiểu ít và bệnh thận

 Một số bài thuốc chữa bệnh có thương lục:

 Chữa phù toàn thân, thở gấp, khát, đại tiểu tiện không thông:

 Thương lục  Trạch tả  Xích tiểu đậu (sao)  Khương hoạt  Đại phúc bì  Mộc thông  Tần cửu  Thổ phục linh  Hạt cau Các vị lượng bằng nhau Mỗi lần dùng 12 g, thêm gừng tươi 3 nhát, sắc nước uống

Sắc nước rửa  Chữa bụng trướng bí đái:

 Rễ thương lục tươi 100 g

 Tỏi ta tươi 500 g Giả nát đắp ở rốn

1.1.6 Độc tính của thương lục:

Thương lục có độc tính mãnh liệt có thể gây sẩy thai [9] Phần độc nhất của thương lục là rễ của nó Ngộ độc thương lục có triệu chứng đầu tiên là triệu chứng trong cổ họng tiếp theo là buồn nôn, tiết nước bọt, toát mồ hôi, đau bụng, tiêu chảy ra máu, nhức đầu, chống mặt, hạ huyết áp và nhịp tim nhanh Tiểu không kiểm soát, hôn mê, run chân tay; đôi khi thị giác bị rối loạn, suy yếu hô hấp, co giật [33]

Rễ thương lục có chứa một chất độc đắng tên là phytolaccatoxin là một saponin có thể gây kích thích niêm mạc, dung huyết Liều cao gây dãn đồng tử, co giật răng cắn chặt, có thể gây chết người [8]

Có một số trường hợp ngộ độc thương lục được ghi nhận:

- Ngộ độc do ăn, uống những bộ phận trên cây thương lục Trường hợp ghi

nhận là 20 trong số 46 người tham gia trại chiếm 43% đã ăn salad chế biến từ lá thương lục non được nấu chín đã có triệu chứng bị ngộ độc như buồn nôn, đau bụng, nôn mữa, nóng trong dạ dày và tiêu chảy (Anonymous, 1981) Bệnh xuất hiện sau 30 phút đến 5 giờ khi dùng hơn 1 muỗng salad, kéo dài 1 – 48 giờ điều trị

- Năm 1900 tiến sĩ Dr Cecil French D.V.S đã ghi nhận trường hợp ngộ độc

của chính mình khi ăn nhầm thương lục Các triệu chứng của ông sau đó cũng là khô rát cổ họng, rối loạn thị lực, tiết nước bọt, đau bụng dữ dội Sau đó ông phải nhập viện để điều trị

1.2 Tình hình nghiên cứu thương lục:

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới:

Tác dụng kháng vi sinh vật:

Nghiên cứu tại đại học Yeungnam, Hàn Quốc đã nghiên cứu khả năng kháng hai vi khuẩn gây bệnh răng miệng Vi khuẩn được thử nghiệm là hai vi khuẩn gây bệnh nha chu Porphyromonas gingivalis và Streptococcus mutans và một vi khuẩn

gây bệnh khác là E coli Bộ phận thử nghiệm là phần trên mặt đất (thân, lá)

Thương lục được chiết bằng metanol 80% sau đó các chất có độ phân cực khác nhau được chiết bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần n hexan, chloroform,

etanol và n butanol Các hợp chất hiện diện trong cây (Phytolacca americana) như

kaempferol, quercetin, quercetin 3-glucoside, isoqueritrin và acid ferulic được sử dụng thử hoạt tính kháng khuẩn chuẩn Kết quả thu được dịch chiết thô có tính

kháng khuẩn rất mạnh 100% với Porphyromonas gingivalis và 44% với

Streptococcus mutans ở nồng độ 1,8 mg/ml Dịch chiết các phân đoạn thì có n

hexan và chloroform kháng Porphyromonas gingivalis mạnh với lần lượt là 92% và 91% ở nồng độ 0,2 mg/ml Với các hợp chất tự nhiên thì Kaempferol ức chế mạnh cả hai vi khuẩn gây bệnh còn quercetin chỉ ức chế Streptococcus mutans mà còn tùy thuộc nhiệt độ Với vi khuẩn gây bệnh khác là E.coli thì dịch chiết ít có tác

dụng Từ điều này cho thấy dịch chiết cây thương lục có thể ứng dụng để làm thuốc chống các bệnh về răng miệng [25]

Chiết xuất metanol của phần trên mặt đất của thương lục (Phytolacca

americana) có thể chống lại một số bệnh ở thực vật Trong thí nghiệm này khả năng

chống lại một số bệnh như bệnh đạo ôn (rice blast) (do Magnaporthe oryzae gây ra), lúa khô vằn (rice sheath blight) (do Rhizoctonia solani), mốc xám cà chua (tomato gray mold) (do Botrytis cinerea), cà chua mốc sương (tomato late blight) (do Phytophthora infestans), lúa mì rỉ (wheat leaf rust) (do Puccinia recondita), barley powdery mildew (Blumeria graminis f sp hordei), và pepper anthracnose (do Colletotrichum coccodes) Kết quả cho thấy chiết xuất metanol của thương lục

có hiệu quả lên 3 bệnh đó là bệnh đạo ôn, mốc xám cà chua và ca chua mốc sương Với nồng độ 3000 ppm thì dịch chiết metanol thương lục có thể ức chế các bệnh đạo ôn, cà chua mốc xám và cà chua mốc sương lần lượt là 62,5%; 85,0% và 82,1% [21]

Một nghiên cứu ở Canada cho thấy thương lục kết hợp với cây thủy tùng

(Taxus brevifolia) để chữa bệnh ung thư ung thư hạch lympho và bệnh bạch cầu

lympho mãn tính (Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL) Liều dùng: viên nang 600 mg lá thủy tùng, mỗi ngày dùng 5 viên chia làm 2 lần và tỉ lệ 1: 2 nước chiết rễ thương lục với cồn và nước uống 2 muỗng café mỗi ngày Tiến hành điều trị cho bệnh nhân sau 3 năm và sau 1 – 3 tháng đầu điều trị kiểm tra 1 lần Sau 3 năm số lượng bạch cầu (white blood cell) tăng từ 3,3x109 tế bào/l lên 8,5x109 tế bào/l, bạch cầu trung tính tăng từ 0,5x109 tế bào/l lên 1,15x109 tế bào/l và tế bào lympho không điển hình giảm từ 8% xuống 0% [32]

Tác dụng với một số côn trùng:

Năm 2007 Vito et al., đã thực hiện nghiên cứu về sự ảnh hưởng của dịch

chiết từ quả của cây thương lục đến quá trình nở trứng của hai tuyến trùng

Globodera rostochiensis và Meloidogyne spp Nghiên cứu được thực hiện ở phòng

thí nghiệm ở Ý và các chủng được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 20 ± 1 0C , các tác

giã đã thực hiện nghiên cứu khi thử nghiệm ở các mức nồng độ khác nhau là 0,01;

0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1 ml Đối với thử nghiệm trên Globodera

rostochiensis thì ở các nồng độ này còn thêm 3ml sodium metavanadate 0,6 mM

(NaVO3) và kết quả thu được là ở nồng độ 0,2 ÷ 0,8ml thì đã kích thích quá trình nở

trứng và ở nồng độ 1ml thì bị kìm hãm Với Meloidogyne artiellia thì thêm vào 3ml

nước và kết quả thu được ở nồng độ 0,4 ÷ 1ml thì ức chế quá trình nở trứng Trong nghiên cứu này tác giả còn thực hiện thử nghiệm lấy thương lục làm nhà máy chủ

cho các tuyến trùng thì thấy thương lục là nhà máy chủ tốt cho Meloidogyne

incognita, Meloidogyne javanica không tốt cho Meloidogyne artiellia [31]

Năm 2012 Li-Juan Ding et al., đã nghiên cứu khả năng kháng lại loài nhện đỏ son (Tetranychus cinnabarinus) của esculentoside P một saponin phân lập từ

Phytolacca americana Trong nghiên cứu này tác giả đã tiến hành lấy chiết suất từ

các bộ phận khác nhau của thương lục để xem khả năng tiêu diệt nhện đỏ son

(Tetranychus cinnabarinus) Từ các bộ phận khác nhau trên cây thương lục tác giả

đã chiết qua các dung môi có độ phân cực tăng dần petroleum ether, aceton và metanol Các dịch chiết có độ phân cực khác nhau này sau đó đem đi thử hoạt tính kháng nhện đỏ son, kết quả được ghi lại sau 24h, 48h và 72h Kết quả thu được thì thấy dịch chiết aceton có hoạt tính kháng nhện đỏ son mạnh nhất, và hoạt tính này mạnh nhất là ở phần rễ của cây Sau đó phần rễ này được đem đi phân lập chất và thu được chất có hoạt tính kháng nhện đỏ son mạnh nhất đó là một saponin có tên gọi là esculentoside P [28]

Một nghiên cứu ở trường đại học Clemson cho thấy dịch chiết từ lá và quả

thương lục có tác dụng lên 3 loài tuyến trùng: tuyến trùng lá (Aphlenchoides

fragariae), tuyến trùng thân (Ditylenchus dipsaci) và tuyến trùng (Pratylenchus penetrans) gây bệnh cho cây trồng Chiết xuất nước cất lá thương lục ở nhiệt độ

phòng đã cho ra LD50 đối với 3 loài tuyến trùng: với Aphlenchoides fragariae và

Pratylenchus penetrans lần lượt là 8765,8 và 8515(mg/l), với Ditylenchus dipsaci

LD50 lớn hơn 1,8x104 (mg/ml) [35]

Nghiên cứu một số chức năng của Phytolaccoside:

Một nghiên cứu ở Mỹ về khả năng nâng cao khả năng hấp thụ của thuốc heparin (một loại thuốc chống đông máu) và disaccharide heparin của các phytolaccoside cả trong điều kiện in vitro và in vivo Khi nghiên cứu in vitro thì thấy các phytolaccoside B, D2 và F thể hiện tăng đáng kể hoạt động hấp thu heparin và disaccharide heparin thông qua màng đơn bào của tế bào Caco – 2, phytolaccoside F và I thì hoạt tính nhẹ Trong in vivo thì phytolaccoside E làm tăng thời gian của thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa APTT (Activated Partial Thromboplastin Time) là xét nghiệm huyết học về thời gian đông máu Trong đường ruột phytolaccoside E có tác dụng điều chỉnh sự vận chuyển của heparin [39]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam:

Ở Việt Nam hiện nay hầu như chưa có một nghiên cứu cụ thể nào liên quan đến thương lục

1.3 Gốc tự do và sự oxy hóa

1.3.1 Gốc tự do:

Khái niệm về gốc tự do lần đầu tiên được đề xướng vào năm 1954 do bác sĩ người Mỹ Denham Harman đưa ra trong luận thuyết về cơ chế tích tuổi Gốc tự do là những phần tử hay những mảnh vỡ của phân tử có một điện tử đơn lẻ ở quỹ đạo vòng ngoài Do sự có mặt của điện tử đơn lẻ này, các gốc tự do nhận được một thuộc tính đặc biệt quan trọng đó là có khả năng oxy hóa rất cao Chúng có thể khởi động phản ứng dây chuyền một chuỗi các phản ứng, tạo ra hàng loạt các gốc tự do mới, làm biến đổi cấu trúc hóa học các chất nền mà chúng tiếp xúc

1 Khơi mào

2 Phát triển mạch

3 Tắt mạch

Hình 1.2: Cơ chế chung của một phản ứng gốc tự do

Đối với cơ thể con người, nếu số lượng các gốc tự do tăng cao bất thường, vượt ra khỏi tầm kiểm soát của hàng rào cơ thể, chúng sẽ dễ dàng kích hoạt các phản ứng oxy hóa phá hủy cấu trúc màng tế bào Các gốc tự do sau khi gây tổn thương màng tế bào sẽ dẫn đến nhiều thương tổn khác như biến đổi cấu trúc các protein, ức chế hoạt động của các enzyme, biến đổi cấu trúc và thuộc tính của các nội tiết tố trong cơ thể Đối với những người có tuổi, sự dư thừa các gốc tự do có thể dẫn đến nhiều vấn đề nguy hiểm đến sức khỏe như xơ vữa động mạch, đái tháo đường, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể và đặc biệt là ung thư

Gốc tự do có thể sinh ra do quá trình chuyển hóa tự nhiên bên trong cơ thể như hô hấp tế bào, diệt khuẩn trong quá trình thực bào, tổn thương các tế bào, cũng có thể được hình thành bởi các yếu tố bên ngoài như ô nhiễm môi trường, uống rượu bia, hút thuốc lá, sử dụng thực phẩm không an toàn Trong cơ thể có nhiều loại gốc tự do, nguy hiểm hơn cả là các gốc superoxid, ozon, hydro peroxid, lipid peroxid, nhất là hydroxyl, một gốc hoạt động rất mạnh và gây ra nhiều tổn thương

Tuy nhiên, không phải gốc tự do chỉ có hại, đôi khi cũng có một vài tác dụng

hữu ích Nếu được kiềm chế, nó sẽ là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melanin cần cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandin có công dụng

ngừa nhiễm trùng, tăng cường tính miễn dịch, giúp sự truyền đạt tín hiệu thần kinh diễn ra dễ dàng, giúp phản ứng co bóp cơ thịt

Trong tự nhiên có nhiều hợp chất có chức năng kháng oxy hóa rất tốt như: carotenoid, flavonoid, isothiocyanat, anthocyanin, polyphenol, các vitamin Chúng có khả năng biến đổi các gốc tự do không ổn định về mặt hóa học thành những chất ổn định về mặt hóa học, không còn khả năng gây độc cho cơ thể Vì vậy sử dụng chất kháng oxy hóa sẽ có tác dụng kháng lão hóa, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng, làm bền thành mạch, kháng viêm, hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư, giảm tác hại của các tia phóng xạ

1.4 Saponin [10]

1.4.1 Định nghĩa:

Saponin là một nhóm glucosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo có nghĩa là xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng)

 Cấu trúc của saponin

Saponin là một nhóm glucosid lớn có cấu trúc hóa học gồm có hai phần: phần đường và phần không đường thường được gọi là aglycon

Phần đường của glycosid:

Phần đường phổ biến là D - glucose, D - galactose, L - arabinose, L - rhamnose, D - xylose, acid glucuronic, cid galacturonic và một số đường khác

Phần aglycon của glucosid:

Phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các loại hợp chất tự nhiên như: monoterpen, sequiterpen, diterpen, triterpen, steroid, iridoid, flavonoid, alcaloid, quinonoid, polyphenol

 Saponin có một số tính chất đặc biệt

- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch

- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng, tính chất này được gọi là tính phá huyết

- Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; liều cao gây nôn mửa , đi lỏng

- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3 - b -

hydroxysteroid khác  Đặc điểm lý tính của saponin

- Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng - Saponin tan trong nước, cồn methylic, ethylic loãng, khó tan trong

cồn cao độ, rất ít tan trong aceton, không tan trong ether, hexan - Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao từ 200oC trở lên và

có thể cao hơn 300oC - Saponin bị tủa bởi acetate chì, hydroxid barium, sunfat monium - Các saponin đều là các chất quang hoạt

- Về mặt phân loại, dự theo cấu trúc aglycon có thể chia thành hai nhóm lớn là saponin triterpenoid và saponin steroid

1.4.2 Phân loại:

Dự vào phần aglycon, saponin được chia thành 2 nhóm chính: Saponin triterpenoid và saponin steroid

Saponin triterpenoid

Phần aglycon của saponin triterpenoid có một khung hydrocacbon với 30 carbon, có thể chia thành 6 nhóm hemiterpen sắp xếp theo “quy tắc đầu đuôi” Được chia làm 2 nhóm: Saponin triterpenoid pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic

Saponin triterpenoid pentacyclic: Phần aglycon của nhóm này có cấu trúc 5 vòng và chia ra các nhóm: olean, ursan, lupan, hopan

Nhóm olean (I): Đây là nhóm quan trọng, chiếm phần lớn so với các saponin

triterpenoid pentacyclic Cấu trúc của olean gồm 5 vòng A, B, C, D, E và sự nối vòng hầu hết sắp xếp theo thứ tự trans – anti – trans – syn - cis Mạch đường có thể nối vào C-3 theo dây nối acetal, có khi mạch đường nối vào C-28 theo dây nối ester

Nhóm ursan (II): Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm olean,

chỉ khác là nhóm methyl ở C (30) không đính vào vị trí 20 mà lại đính ở vị trí 19 Những saponin của nhóm này ít gặp hơn nhóm olean

C-Nhóm lupan (III): C-Nhóm này ít gặp hơn trong tự nhiên Cấu trúc có 5 vòng

và sự nối vòng sắp xếp theo thứ tự: trans – anti – trans – anti - trans Vòng E là vòng 5 cạnh, cacbon ở C (20) nằm ở ngoài vòng

Nhóm hopan (IV): Cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A, B, C, D giống

như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-22 ở ngoài vòng và nhóm methyl góc đính ở C - 18 thay vì ở C-17

Saponin triterpenoid tetracyclic: có 3 nhóm chính là dammaran, lanostan, cucurbitan

Nhóm dammaran (V): Ðại diện là các saponin của nhân sâm Phần aglycon

gồm 4 vòng và một mạch nhánh Số cacbon của nhân cũng là 30 và cũng do 6 nhóm hemiterpen ghép lại theo “quy tắc đầu đuôi Hai genin chính là : protopanaxadiol và protopanaxatriol Phần đường nối vào -OH ở cacbon số 3 hoặc có khi thêm 1 mạch nữa nối vào -OH ở mạch nhánh

Nhóm lanostan (VI): Holothurin A, một trong những saponin có trong các

loài hải sâm - Holothuria spp Là một ví dụ của nhóm này

Cucurbitaceae Ở đây nhóm CH3 góc thay vì ở vị trí C -10 lại đính ở C – 9

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

Rễ thương lục được thu nhận vào tháng 12/2014 ở Lâm Hà, Lâm Đồng Rễ sau khi thu đem về rửa sạch để loại các tạp chất rắn, đất rồi đem thái nhỏ thành lát khoãng 2 – 3 cm sau đó phơi khô ở nhiệt độ khoảng 400C rồi xay nhỏ Mẫu được lưu giữ ở trung tâm sâm và dược liệu thành phố Hồ Chí Minh

2.1.2 Dung môi, hóa chất - Dung môi: dietyl eter, cloroform, etyl acetate, metanol, n butanol, … - Hóa chất: acid fomix, acid acetic, NH4OH, FeCl3, HCl, H2SO4, KOH, Mg,

NaOH, DMSO, Na2CO3

- Các thuốc thử Fehling, Mayer, Dragendorff, Bouchardat, DPPH, Liebermanm –

Burchard

- Chất chuẩn: vitamin C - Bản mỏng tráng sẵn (Silicagel- Merck) - Silicagel hạt vừa

2.1.3 Thiết bị - Tủ sấy Sanyo Mow-112 - Cân kĩ thuật Mettler Toledo Ab-204 - Máy cô giảm áp Buchi- 114

- Bồn chiết siêu âm Ultrasonic Branson 3510 - Đèn soi UV-VIS Desaga Sarstedt Gruppe - Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến Unicam, HE λ 10 SY Thermo Spectrorius

- Bếp cách thủy Memmert - Nồi hấp autoclave

- Tủ cấy vô trùng

2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Xây dựng tiêu chẩn nguyên liệu

2.2.1.1 Xác định độ ẩm dược liệu: [11]

 Cân trọng lượng bì  Cân chính xác vào bì khoảng 2 g mẫu  Sấy mẫu ở áp suất thường, 105oC trong 4 giờ, lấy ra để trong bình hút ẩm và

đem cân trọng lượng sau khi sấy Ghi lại lượng cân  Tiếp tục sấy mẫu ở áp suất thường, 105oC trong 2 giờ, để vào bình hút ẩm

chờ nguội và cân lại trọng lượng sau khi sấy Lặp lại nhiều lần, mỗi lần sấy 2 giờ, cho đến khi khối lượng không thay đổi

 Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức sau:

%100)(  



acbaX

X: Độ ẩm mẫu thử (%) a: Khối lượng ban đầu của mẫu thử (g) b: Khối lượng sau cùng của mẫu thử (g) c: Khối lượng bì (g)

2.2.1.2 Xác định tro toàn phần: [11]

 Nung một chén nung bằng sứ cho đến khi khối lượng không đổi, để nguội

trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén không

 Cân chính xác 2 g mẫu cho vào chén nung Trải đều mẫu dưới đáy chén và

đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi mẫu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói

 Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở 500oC cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen) Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm Cân và ghi lại lượng cân

 Đặt chén đựng tro vào lò nung và tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ

nữa Lấy chén ra, để nguội trong bình hút ẩm Cân

 Tiếp tục làm như vậy cho đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chén

tro không chênh lệch quá 0,5 mg

 Tro toàn phần được tính theo công thức:

 ) 100%





hcc

baA

A: Độ tro toàn phần (%) a: Khối lượng chén có tro (g) b: Khối lượng chén không tro (g) c: Khối lượng mẫu (g)

h: Độ ẩm (%)

2.2.1.3 Xác định tro không tan trong acid clohydric [11]

 Lấy chén nung đã xác định tro toàn phần ở trên, thêm vào đó 25 ml HCl 2M

Đậy chén bằng một mặt kính đồng hồ, đun sôi cẩn thận trong 5 phút Để nguội Rửa mặt kính đồng hồ bằng 5 ml nước cất rồi cho vào chén nung

 Lọc chất không tan bằng giấy lọc không tro Rửa giấy lọc và tro bằng nước

cất nóng cho tới khi dịch lọc trung tính (thử bằng giấy quỳ)

 Cho tất cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô rồi đốt, nung ở 500oC trong 2 h Để nguội trong bình hút ẩm và cân

 Nung tiếp cho đến khi giữa hai lần cân liên tiếp, khối lượng không chệnh

lệch nhau quá 1mg

 Tính tỉ lệ phần trăm tro không tan trong acid với tro tan trong acid so với

lượng mẫu đã sử dụng

2.2.1.4 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học: [4]

Dựa vào độ hòa tan của các hợp chất trong dược liệu để tách chúng bằng các

dung môi có độ phân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình, phân cực

mạnh bằng cách chiết lần lượt với các dung môi: dietyl eter, cồn và nước Sau đó

xác định các hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng

Hình 2.1: Tóm tắt quy trình chiết xuất trong phân tích thành phần hóa thực vật

Bột rễ Thương lục

- Chiết bằng dietyl eter

Bã Dịch chiết eter

- Chiết bằng etanol - Chiết hồi lưu

Bã Dịch chiết etanol

- Chiết bằng nước - Chưng cất thủy

Bã Dịch chiết nước

 Định tính bằng các phản ứng hóa học: [4]

Bảng 2.1: Các phản ứng hóa học định tính những nhóm hợp chất

Nhóm hợp chất Thuốc thử / cách phát hiện Phản ứng dương tính

Lớp tiếp xúc có màu đỏ nâu, lớp dung dịch trên có màu xanh lục hay tím

Alkaloid

Thuốc thử Mayer Thuốc thử Bouchardat Thuốc thử Dragendorff

Tủa trắng – vàng nhạt Tủa nâu đỏ

Tủa đỏ cam

dưới đèn tử ngoại 365 nm

2.2.2 Định tính và định lượng saponin chứa trong nguyên liệu:

2.2.2.1 Định tính saponin trong nguyên liệu:

Lấy 10 g bột rễ thương lục đun hồi lưu với metanol 70% trong 30 phút rồi

lọc, cô bốc hơi dịch lọc đến cắn Dùng cắn để làm các phản ứng định tính

Phản ứng tạo bọt:

- Chuẩn bị 2 ống nghiệm sạch - Ống 1: Cho 10 ml nước cất vào để yên làm đối chứng - Ống 2: Cho vào ống một lượng cắn tương đương 1 g nguyên liệu cho vào

thêm 5 ml nước nóng hòa tan lượng cắn Lọc và cho vào một ống nghiệm khác, thêm một lượng nước cho vừa đủ 10 ml Lắc mạnh trong 1 phút, đo độ bền bọt

Cách đọc kết quả:

Nếu có bọt bền: có saponin

- Độ bền bọt trong 15 phút : + - Độ bền bọt trong 30 phút : ++ - Độ bền bọt trong 60 phút : +++

Phản ứng Liebermann- Burchard

Chuẩn bị 2 ống nghiệm đánh số theo thứ tự 1 và 2 (ống nghiệm 1: ống đối chứng, ống nghiệm 2: ống thử)

- Ống nghiệm 1: Cho 1 ml anhydrid acetic và 0,5 ml chloroform vào ống

nghiệm Thêm từ từ 1 - 2 ml H2SO4 đậm đặc xuống đáy ống nghiệm, để yên, làm ống đối chứng

- Ống nghiệm 2: Cho một lượng cắn hòa tan trong 1ml anhydrid acetic và 0,5

ml chloroform Thêm từ từ 1 - 2 ml H2SO4 đậm đặc xuống đáy ống nghiệm, để yên, quan sát vòng ngăn cách

2.2.2.2 Định lượng saponin bằng phương pháp Namba: [2]

Tiến hành chiết siêu âm nóng 1g bột nguyên liệu với 10 ml metanol trong 30 phút, lọc thu lấy dịch Lặp lại bốn lần, dịch chiết cuối cùng được thử bằng giấy sắc ký lớp mỏng với thuốc thử là H2SO4 10% trong cồn, sấy ở 105o C thấy giấy sắc ký không xuất hiện màu tím đỏ chứng tỏ không có saponin trong dịch Sau đó gom dịch chiết lại và cô dịch chiết thành cắn

Hòa tan cắn trong 40ml nước cất thu được dịch nước Dịch nước lắc với dietyl eter trong bình lắc, đến khi lớp dietyl eter nhạt màu, bỏ lớp dietyl eter Tiếp tục lắc dịch nước với dung dịch n butanol bão hòa nước, đến khi dịch n butanol trở nên nhạt màu và đồng thời thử bằng giấy sắc ky lớp mỏng với thuốc thử là H2SO4 10% trong cồn, sấy khô giấy sắc ký ở 105o C không xuất hiện màu hồng tím, chứng tỏ không còn saponin tan trong dung dịch n butanol Tập trung và cô cạn dịch n butanol chứa saponin

Tiến hành sấy ở 105o C trong 2 giờ, để nguội trong bình hút ẩm và cân Tiếp tục sấy đến khi khối lượng cân giữa hai lần liên tiếp không quá 0,5 mg

Tiến hành lặp lại 3 lần: Hàm lượng saponin toàn phần được tính theo công thức:

𝐗 (%) = 𝒎

𝑴 𝒙 (𝟏𝟎𝟎−𝒂)𝒙 𝟏𝟎𝟒Trong đó:

- m: Khối lượng saponin toàn phần (g) - M: Khối lượng dược liệu (g)

- a: Độ ẩm của dược liệu (%) 2.2.3 Khảo sát độc tính cấp:

Động vật thử nghiệm:

Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, 22 ± 2 g) được cung

cấp bởi Viện Vắcxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang và được để ổn định ít nhất một