Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây thuốc thượng (Phaeanthus Vietnamensis Ban)

Nhiệm vụ và nội dung Nhiệm vụ - Xác định thành phần hóa học của cây Thuốc Thượng Phaeanthus vietnamensis Ban - Khảo sát hoạt tính sinh học kháng khuẩn và kháng ung thư của các cao chiế

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

BÙI THANH PHONG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY THUỐC THƯỢNG

(PHAEANTHUS VIETNAMENSIS BAN)

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 05/2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

BÙI THANH PHONG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY THUỐC THƯỢNG

(PHAEANTHUS VIETNAMENSIS BAN)

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 05/2016

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Công Luận

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng

Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

Luận văn được bảo vệ tại Trường đại học Bách Khoa TP.HCM vào ngày 04/05/2016 Thành phần hội đồng đánh giá luận văn Thạc sĩ bao gồm:

1.Chủ tịch hội đồng: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng 2.Uỷ viên thư ký: TS Huỳnh Ngọc Oanh

3.Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng 4.Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên 5.Uỷ viên: PGS.TS Lê Phi Nga

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn được sửa chữa

PGS.TS Nguyễn Đức Lượng GS.TS Phan Thanh Sơn Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Bùi Thanh Phong MSHV: 7140290 Ngày, tháng, năm sinh: 04/07/1986 Nơi sinh: Long An Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201

I Tên đề tài

“Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Thuốc Thượng

(Phaeanthus vietnamensis Ban)”

II Nhiệm vụ và nội dung Nhiệm vụ

- Xác định thành phần hóa học của cây Thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis

Ban) - Khảo sát hoạt tính sinh học (kháng khuẩn và kháng ung thư) của các cao chiết

từ Thuốc Thượng: cao alkaloid toàn phần, cao toàn phần, cao diethyl ether, cao

chloroform, cao n – butanol, cao nước

- Phân lập alkaloid bằng phương pháp sắc ký cột và đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất thu được

Nội dung

- Xác định các hợp chất hóa học có trong cây Thuốc Thượng - Thu nhận alkaloid tổng, cao cồn tổng và cao phân đoạn của cây Thuốc Thượng:

diethyl ether,chloroform, n – butanol, nước

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của: cao tổng, cao lắc phân đoạn - Xác định hoạt tính độc tế bào ung thư của: cao tổng, cao lắc phân đoạn - Xác định cao có hoạt tính sinh học tốt nhất, tiến hành sắc ký cột, xác định chất

tinh khiết và chạy phổ để xác định cấu trúc của nó - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng ung thư của chất phân lập được

III Ngày giao nhiệm vụ: 01/2016 IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ:03/2016 V Cán bộ hướng dẫn: PGS TS Trần Công Luận

TP HCM, ngày 22 tháng 04 năm 2016

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

PGS TS Trần Công Luận PGS TS Nguyễn Thúy Hương

TRƯỞNG KHOA

GS TS Phan Thanh Sơn Nam

i

Lời cảm ơn

Lời đầu tiên, con xin cảm ơn mẹ đã nuôi dưỡng và cho con ăn học Cảm ơn gia đình đã luôn bên con và tạo điều kiện tốt nhất để con đạt được những thành quả của ngày hôm nay

Cảm ơn thầy PGS TS Trần Công Luận đã tận tình hướng dẫn em thực hiện đề tài

Cảm ơn PGS TS Nguyễn Thúy Hương, GS TS Phan Thanh Sơn Nam và các thầy cô giảng viên cao học K2014 ngành Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Bách Khoa Tp HCM đã dạy bảo, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt khóa học

Cảm ơn PGS TS Nguyễn Thị Thu Hương, ThS Dương Thị Mộng Ngọc, ThS Trần Mỹ Tiên và các anh chị em, bạn bè tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp HCM, bộ môn CNSH, khoa Kỹ Thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa Tp HCM đã giúp đỡ tôi thực hiện đề tài

Cảm ơn TS Huỳnh Thị Ngọc Lan, ThS Nguyễn Tuấn Anh và các thầy cô bộ môn Vi – Kí Sinh, Khoa Dược, Đại Học Y Dược Tp HCM đã hướng dẫn và hỗ trợ em hoàn thiện nội dung kháng khuẩn

Cảm ơn TS Nguyễn Tú Anh, ThS NguyễnThị Thanh Thảo và các thầy cô khoa Dược, Đại Học Quốc Tế Hồng Bàng đã tạo điều kiện cho tôi hoàn tất luận văn này

Cảm ơn TS Đinh Minh Hiệp và các bạn nhóm MHG đã hỗ trợ tôi về mặt tinh thần trong quá trình học tập

Cám ơn ThS Nguyễn Thị Mỹ Nương và các bạn bộ môn Di truyền – ĐH Khoa học Tự nhiên đã hỗ trợ tôi các mảng nghiên cứu về độc tế bào

Cám ơn TS Võ Đình Lệ Tâm động viên tinh thần cho em trong suốt quá trình học tập tại ĐH Bách Khoa TP.HCM

Lời cảm ơn sau cùng anh dành cho Vợ, người đã luôn bên anh, động viên, an ủi, hỗ trợ và là chỗ dựa vững chắc cho anh vượt qua mọi khó khăn trong thời gian qua…

Xin chân thành cảm ơn!

ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài luận văn: “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Thuốc

Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban)”

Học viên thực hiện: Bùi Thanh Phong Cán bộ hướng dẫn: PGS TS Trần Công Luận Thời gian thực hiện: Tháng 06/2014 đến tháng 12/2016

Nội dung đề tài - Xác định các hợp chất hóa học có trong cây Thuốc Thượng - Thu nhận alkaloid tổng, cao cồn tổng và cao phân đoạn của cây Thuốc Thượng:

dietyl ete, chloroform, n – butanol, nước

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của: cao tổng, cao lắc phân đoạn - Xác định hoạt tính độc tế bào ung thư của: cao tổng, cao lắc phân đoạn, - Xác định cao có hoạt tính sinh học tốt nhất, tiến hành sắc ký cột, xác định chất

tinh khiết và chạy phổ để xác định cấu trúc của nó

- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng ung thư của chất phân lập được Kết quả đề tài

- Xác định độ tro, độ ẩm của dược liệu - Xác định các nhóm hợp chất chính có trong cây Thuốc Thượng là: Axit hữu cơ,

alkaloid, chất khử, polyphenon, tinh dầu, triterpenoid tự do, triterpenoid thủy phân; trong cành có axit hữu cơ, alkaloid, tinh dầu, triterpenoid tự do, triterpenoid thủy phân Cả lá và cành đều có sự nghi ngờ về sự có mặt của flavonoid

- Thu được các cao chiết từ lá Thuốc Thượng khô (bao gồm định tính và định

lượng)

- Xác định cao chiết có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất là cao alkaloid toàn

phần Cao alkaloid toàn phần cho giá trị IC50 với các dòng vi khuẩn E coli, P

aeruginosa, MSSA, MRSA lần lượt là 1,5625; 3,125; 0,1953; 0,3906 mg/ml

- Xác định khả năng kháng ung thư mạnh nhất là cao alkaloid toàn phần Nồng

độ IC50 tương ứng với các dòng tế bào ung thư MCF – 7, NCI - H460, HepG2, HeLa, Fibroblast lần lượt là 26,71; 32,28; 11,68; 31,19 và 71,50 µg/ml

iii

- Phân tích đƣợc cao alkaloid thành các phân đoạn nhỏ, từ đó tách ra đƣợc một

alkaloid tinh sạch là N-methyl-6,7-dimethoxy-1-oxoisoquinolin dimethoxyisoquinolon)

methyl-6,7 Khảo sát hoạt tính sinh học của Nmethyl-6,7 methylmethyl-6,7 6,7methyl-6,7 dimethoxymethyl-6,7 1methyl-6,7 oxoisoquinolin (Nmethyl-6,7

(N-methyl-6,7-dimethoxyisoquinolon) thu đƣợc

iv

SUMMARY I OBJECTIVES

- Identification of chemical compounds in Phaeanthus vietnamensis Ban - Phaeanthus vietnamensis extracts including alcohol total, dietyl ete,

chloroform, n – butanol, water and total alkaloid

- The antibacterial activity was carried out by the method of punching agar plates

and MIC value

- Determination of the cytotoxic activity of cancer: alcohol total, dietyl ete,

chloroform, n – butanol, water and total alkaloid

- Conducting column chromatography, determining reagent and running

universal to determine its structure

- Evaluation of the antibacterial activity andanti-cancer of substances isolated II RESULTS

- Determination of ash, moisture pharmaceuticals

- Phaeanthus vietnamensis contains mainly alkaloid, triterpenoids and

polyphenon

- The antibacterial activity of this medicinal plant is quite high Especially, total

alkaloid showed hightest activity MIC value of the total alkaloid sample

(mg/ml) with E coli, P aeruginosa, S aureus ATCC 43300 (MRSA) và S

aureus ATCC 25953 (MSSA) respectively 1.56, 3.125, 0.1953

- This research was conducted to determine the ability of cytotoxic cancer of

Thuoc Thuong extracts The results showed that the total alkaloid sample has acytotoxic activity against many cancer cell lines such as MCF – 7 (breast cancer cell), NCI - H460 (lung cancer cell), HepG2 (liver cancer cell), HeLa (cervical cancer cell) with IC50 value of 26.71, 32.28, 11.68 and 31.19 µg/ml, respectively

- Isolated a pure alkaloid is N-methyl-6,7-dimethoxy-1-oxoisoquinolin

(N-methyl-6,7-dimethoxyisoquinolon)

- Studying biological activity of N-methyl-6,7-dimethoxy-1-oxoisoquinolin

(N-methyl-6,7-dimethoxyisoquinolon)

v

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi Tất cả kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố bởi bất kỳ tác giả nào khác

Người cam đoan

Bùi Thanh Phong

vi

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Cây Thuốc Thƣợng Phaeanthus vietnamensis Ban 3

Hình 1.2: Quá trình phát triển của khối tế bào ung thƣ 15

Hình 1.3: Quá trình di căn của khối tế bào ung thƣ 16

Hình 1.4: Cấu trúc của Phaeanthin và Limacin 20

Hình 2.1: Một số dòng tế bào ung thƣ và fibroblast 21

Hình 3.1: Sơ đồ sắc ký cột cao alkaloid toàn phần 42

Hình 3.2: Kiểm tra chất KT1 44

Hình 3.3: Cấu trúc của N-methyl-6,7-dimethoxy-1-oxoisoquinolin 46

vii

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn bởi Phaeanthin và Limacin 19

Bảng 2.1: Các nồng độ pha loãng trong thử nghiệm MIC 34

Bảng 3.1: Kết quả phân tích sơ bộ trên mẫu lá 38

Bảng 3.2: Kết quả phân tích sơ bộ trên mẫu cành 39

Bảng 3.3: Các phân đoạn của cột sắc kí I 42

Bảng 3.4: Các phân đoạn của cột sắc kí II 43

Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR, HMBC của KT1 45

Bảng 3.6: Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình của các cao kháng khuẩn (mm) 46

Bảng 3.7: Nồng độ ức chế tối thiểu các vi khuẩn của các cao chiết 48

Bảng 3.8: Kết quả kháng khuẩn của hợp chất KT1 49

Bảng 3.9: Tỷ lệ (%) gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư ở nồng độ 50, 75 và 100 µg/ml 50

Bảng 3.10: IC50 (µg/ml) của các mẫu trên các dòng tế bào ung thư và tế bào fibroblast 51

Bảng 3.11: Tỷ lệ (%) gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư ở nồng độ 100 µg/ml của KT1 53

1.2.2 Cấu tạo hóa học 5

1.2.3 Phân loại alkaloid 6

1.2.4 Phân bố alkaloid 7

1.2.5 Sinh tổng hợp alkaloid 8

1.2.6 Tính chất của alkaloid 8

1.2.7 Cơ sở và nguyên tắc tách chiết alkaloid 9

1.2.8 Hoạt tính sinh học của các alkaloid 10

1.3 Kháng sinh và kháng sinh thực vật 10

1.3.1 Kháng sinh 10

1.3.2 Kháng sinh thực vật 11

1.4 Tổng quan về các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn 13

1.4.1 Phương pháp khếch tán trên đĩa thạch 13

ix

1.4.2 Phương pháp pha loãng 14

1.4.3 Khái quát về MIC (Minimum inhibitory concentration) 14

1.5 Nghiên cứu khả năng kháng ung thư của thực vật 15

1.5.1 Khái quát về ung thư và các phương pháp điều trị 15

1.5.2 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất tự nhiên 17

1.6 Một số kết quả nghiên cứu trên cây Thuốc Thượng và các cây cùng chi Phaeanthus 18

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21

2.2.5 Định lượng alkaloid bằng phương pháp cân 28

2.3 Chiết xuất các phân đoạn cao và alkaliod tổng 29

2.3.1 Chiết các phân đoạn cao 29

Dịch nước còn lại đem cô thu hồi dung môi thu được cao nước [1][5][6] 30

2.3.2 Chiết alkaloid tổng 30

2.4 Phân lập và xác định cấu trúc các alkaloid 31

2.4.1 Sắc kí lớp mỏng 31

2.4.2 Sắc kí cột 31

2.4.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hóa học của các alkaloid 32

2.5 Phương pháp kiểm tra khả năng kháng khuẩn 32

2.5.1 Định tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ trên bảng thạch 32

x 2.5.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC bằng phương pháp pha loãng trong

môi trường rắn 33

2.6 Phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng ung thư của cây thuốc bằng thử nghiệm SRB 34

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37

3.1 Thành phần hóa học của cây Thuốc Thượng Phaeanthus vietnamensis Ban 37

3.2 Kết quả chiết tách cao phân đoạn và chiết tách alkaloid tổng 41

3.3 Kết quả phân lập alkaloid 41

3.3.1 Phân lập các hợp chất 41

3.3.2 Giải cấu trúc hóa học KT1 43

3.4 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn 46

3.4.1 Kết quả kháng khuẩn của các cao chiết 46

3.4.2 Kết quả kháng khuẩn của các alkaloid đã được phân lập 49

3.5 Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư 50

3.5.1 Thử nghiệm sàng lọc sơ bộ hoạt tính của các cao chiết 50

3.5.2 Thử nghiệm xác định IC50 của các cao chiết trên các dòng tế bào ung thư 51

3.5.3 Khảo sát hoạt tính kháng ung thư của hợp chất phân lập được 53

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

I KẾT LUẬN 54

II KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

1

MỞ ĐẦU

Từ lâu, con người đã biết việc sử dụng những loại cây cỏ trong tự nhiên làm thảo dược để chữa bệnh một cách có hiệu quả nhưng chủ yếu dựa trên kinh nghiệm được truyền lại Ngày nay con người đã đi sâu và phân tích cơ sở khoa học của tác dụng chữa bệnh của cây thuốc, các nhà nghiên cứu đã phân loại được rất nhiều hợp chất từ cây cỏ và hiểu rõ hơn về thành phần hóa học, tách dụng sinh học của những hợp chất này Bên cạnh việc ứng dụng những hoạt chất có nguồn gốc từ thảo dược tự nhiên chữa bệnh trong y học cổ truyền đã được biết từ rất lâu, các hợp chất phân lập từ cây cỏ còn được ứng dụng một cách rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, được dùng làm thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm… Mặc dù, công nghệ toàn phần hợp dược ngày nay phát triển mạnh mẽ, nhiều loại biệt dược đã được tạo ra sử dụng trong phòng, chữa bệnh, nhưng chúng luôn để lại tác dụng phụ không mong muốn Hơn nữa, một số loại hợp chất tự nhiên rất khó được tổng hợp theo phương thức hóa học, trong khi đó các loại thuốc dân gian hầu như không gây ra tác dụng phụ

Cây Thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban), còn có tên gọi là Thuốc

Mọi, Da Xà Lắc, Thuốc Dấu Cà Doong thuộc họ Na – Annonaceae là một cây gỗ nhỏ hay bụi, đã được sử dụng nhiều trong dân gian nhất là trong chiến tranh – Thuốc Thượng được sử dụng như một thuốc chống nhiễm trùng trên vết thương rất tốt Trong dân gian dùng lá non hấp chín trên nồi cơm, lấy nước nhỏ mắt chữa đau mắt đỏ Vỏ rễ, vỏ thân và lá đem nấu cao dán chỗ mụn nhọt sưng tấy Còn được dùng chữa bệnh đường ruột (tiêu chảy) Cao đặc nấu từ lá, chế thành viên nén dùng chữa bệnh ỉa phân trắng ở lợn con rất tốt

Cây Thuốc Thượng được sử dụng đắp lên vết thương để ngăn nhiễm trùng rất tốt Hiện nay, chỉ có một công trình khoa học nghiên cứu về thành phần hóa học và chưa có công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Thuốc Thượng Do đó, đề

tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Thuốc Thượng

(Phaeanthus vietnamensis Ban)” được thực hiện với các nội dung:

- Xác định các hợp chất hóa học có trong cây Thuốc Thượng

2 - Thu nhận alkaloid toàn phần, cao toàn phần và cao phân đoạn của cây Thuốc

Thượng: dietyl ete, chloroform, n – butanol, nước

- Xác định hoạt tính kháng khuẩn của: cao toàn phần, cao phân đoạn, alkaloid toàn phần

- Xác định hoạt tính độc tế bào ung thư của: cao toàn phần, cao phân đoạn, alkaloid toàn phần

- Xác định cao có hoạt tính sinh học tốt nhất, tiến hành sắc ký cột, xác định chất tinh khiết và chạy phổ để xác định cấu trúc của nó

- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng ung thư của chất phân lập được

Đề tài được thực hiện nhằm mục đích:

Xác định một số thành phần hoá học có trong cây Thuốc Thượng và một số hoạt tính sinh học (khả năng kháng khuẩn, khả năng gây độc tế bào) của các cao chiết (cao toàn phần, cao phân đoạn, alkaloid toàn phần) và chất phân lập được từ cây Thuốc Thượng Qua đó góp phần tăng hiểu biết về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây thuốc Việt Nam

- Chi: Phaeanthus [2][13]

1.1.2 Mô tả thực vật

Hình 1.1: Cây Thuốc Thượng Phaeanthus vietnamensis Ban [2]

Cây gỗ nhỏ hoặc cây bụi, cao 2-10 m Cành non gần như không lông Lá thuôn hoặc gần hình mác, dài 9-16 cm, rộng 3,6-5 cm, đầu có mũi dài và nhọn; gốc hình nêm, hơi lệch, không lông; gân bên 9-11 đôi; cuống dài 5-6 mm Hoa mọc so le với lá, thường thành xim 2 hoa Hoa có cuống dài 1,5-3 cm mang 4-6 lá bắc nhỏ; lá đài và

4 cánh hoa ngoài rất giống nhau, dài trên 1mm, cánh hoa trong màu vàng dài 8-12 mm, rộng 4-6 m; nhị nhiều, lá noãn nhiều (trên 10) Phân quả hình trái xoan, cỡ 12-15 x 6-7 mm, không có lông, khi chín màu vàng sau chuyển thành màu mận chín; cuống dài 13-

15 mm; vỏ quả rất mỏng Ra hoa tháng 5-12, có quả tháng 6-1 [2][51] 1.1.3 Phân bố, sinh thái

Phaeanthus vietnamensis Ban là loài thực vật đặc hữu của vùng Trung Trường

Sơn Nơi sống và thu hái: mới thấy ở Trung bộ Việt Nam: Thừa Thiên - Huế (Phú Lộc), Quảng Nam - Đà Nẵng (Đại Lộc, Quế Sơn, Núi Thành, Duy Xuyên, Tiên Phước, Phước Sơn) [2][11][51]

1.1.4 Bộ phận dùng

Bộ phận dùng: lá, vỏ và vỏ rễ [2][51]

1.1.5 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý

Hiện chỉ có một công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và chưa có công

trình nghiên cứu về tác dụng hóa sinh - dược lý của cây Thuốc Thượng (Phaeanthus

vietnamensis Ban) [51]

Công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Thuốc Thượng còn hạn chế Nguyễn Thị Nghĩa và các cộng sự (1991) đã phân lập được 8 alkaloid từ cây Thuốc Thượng Năm alkaloid được xác định thuộc nhóm isoquinolines gồm N-methyl-6,7-dimethoxyisoquinolon, N-methylcorydaldin, argentinin, phenanthrenes và atherosperminin, secobenzylisoquinolin petalinemethin [14][15] Hai alkaloid thuộc nhóm bisbenzylisoquinolines là 1S,1'R-(-)-7,7'-O,O'-dimethylgrisabin và 1S,1'R-(-)-7-O-methylgrisabin (-)-7,7'-O-O'-dimethylgrisabin là alkaloid có hoạt tính kháng khuẩn [27][39][41]

1.1.6 Tính vị, công dụng

Dân gian dùng lá non hấp chín trên nồi cơm, lấy nước nhỏ mắt chữa đau mắt đỏ Vỏ rễ, vỏ thân và lá đem nấu cao dán chỗ mụn nhọt sưng tấy Còn được dùng chữa bệnh đường ruột (tiêu chảy) Cao đặc nấu từ lá, chế thành viên nén dùng chữa bệnh ỉa phân trắng ở lợn con rất tốt [2][51]

1.2 Khái quát về alkaloid 1.2.1 Khái niệm

Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập là kiềm Alkaloid là:

5 - Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp ở trong

nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật - Có phản ứng kiềm cho các muối với axit và các muối này dễ kết tinh - Có hoạt tính sinh học rất quan trọng

- Có một số phản ứng chung là tạo “tủa” cần thiết cho sự xác định chúng - Tên của alkaloid có chứa nitơ thường được quy định gọi tên bằng cây mà chúng được chiết xuất cộng thêm đuôi “in”

Chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt Đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo [1]

1.2.2 Cấu tạo hóa học

Về mặt hóa học, nghiên cứu sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành một chuyên ngành, chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạp chí thông tin về hóa học Đối với việc nghiên cứu alkaloid còn quan trọng hơn bởi vì chúng phân bố trong hệ thực vật nhiệt đới phong phú

Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất một nguyên tử nitơ trong phân tử, chủ yếu nằm trong vòng Có ý kiến xếp các hợp chất có N ngoài vòng như colchicin, hordenin, là các protoalkaloid Sự có mặt của nguyên tử N trong cấu trúc quyết định tính bazơ của alkaloid

Alkaloid bao giờ cũng có nitơ (N), carbon (C) và hydro (H), đồng thời cũng hay gặp oxy (O) Vì vậy đôi khi người ta chia làm hai nhóm là loại có mang oxy và loại không mang oxy

Loại không mang oxy, có nghĩa là trong cấu tạo chỉ có C, H, N như: conin (C8H17N), nicotin (C10H14N2), spactien (C15H28N2), semperoirin (C19H16N2)…

Những alkaloid không có oxy chiếm phần lớn Đó là các morphin (C17H19O3N), codein (C18H12O3N), atropine (C17H23O3N), cocain (C17H21O4N), mescalin (C11H17O3N), pilocacbin (C11H26O2N6), strychnin (C21H22O2N2), quinin (C19H24O2N2)…

Các alkaloid là các bazơ bậc 1, 2 hay 3 đôi khi là các amoni hydrat bậc 4 Thông thường nhất là nitơ (N) tham gia vào nhân dị vòng, nhưng cũng có những alkaloid mà các nitơ ở ngoài vòng [1][4]

6

1.2.3 Phân loại alkaloid

Ngày nay tùy vào cấu trúc của nhân mà người ta phân loại các alkaloid Đó là các alkaloid không có nhân dị vòng, có nhân dị vòng, có nhân sterol và có cấu trúc terpen [1]

Alkaloid không có nhân dị vòng

Những alkaloid thuộc loại nhóm này có các amin, còn gọi là các protoalkaloid và có N đính vào mạch ngang

Ví dụ: hordenin (C10H15NO) trong mạch nha, ephedrin (C10H15NO) trong ma hoàng, capsaichin (C19H27NO3) trong ớt

Alkaloid là dẫn xuất của nhân pyrol

Các dẫn chất của pyrol hay nói đúng hơn là của pylolidin vì nhân đã được hydro hóa hoàn toàn

Ví dụ: pyrolidin (C4H9N) trong cà rốt, hygrin (C8H15NO) trong lá coca

Những alkaloid là dẫn xuất của nhân pyridin

Ví dụ: arecolin (C8H13NO2) trong hạt cau, nicotin (C10H14N2) trong thuốc lá

Những alkaloid là dẫn xuất của nhân indol

Ví dụ: haemalin (C13H14N3O) trong Peganum harmala, strychinin (C21H22N2O2) trong mã tiền, bruxin (C23H26N2O4) trong mã tiền

Những alkaloid là dẫn xuất của nhân tropan

Ví dụ: atropin (C17H23NO3) trong Atropa beladoza, cocain (C17H21NO4) trong lá coca, scopolamine (C17H21NO4) trong Hyoscyamus niger

Những alkaloid là dẫn xuất của nhân imidazol

Ví dụ: pilocacpin (C11H16N2O2) trong Jaborandi, jaborin (C22H23N4O4) trong

Jaborandi, pilocacpidin (C10H14N2O2) trong Jaborandi

Những alkaloid là dẫn xuất của nhân purin

Ví dụ: theophyllin (C5H2(CH3)2N4O2) trong chè, theobromin (C5H2(CH3)2N4O2) trong cacao, cafein ( C5H2(CH3)2N4O2) trong chè, cà phê

Những alkaloid là dẫn xuất của nhân quinolin

Ví dụ: các alkaloid chiết từ vỏ cây canhkina như quinin (C20H24N2O2), quinidin (C20H24N2O2), xinchonin (C19H22N2O), xinchinodin (C19H22N2O)

7

Những alkaloid là dẫn xuất của nhân isoquinolin

Ví dụ: berberin (C20H19NO5) trong hoàn liên gai, papaverin (C20H21NO4) và narcotin (C22H23NO7) trong thuốc phiện, emetin (C30H44N2O4) trong ipeca, xechelin (C28H38N2O4) trong peca

Những alkaloid là dẫn xuất của nhân phenanthren

Ví dụ: morphin (C17H19NO3H2O), thebain (C19H19NO3) và codein (C18H21NO3) trong thuốc phiện; colchicin (C23H25NO6) trong tỏi độc

Những alkaloid có nhân sterol

Nhóm này có thể kể alkaloid của họ cà đó là ancamin 27C và alkaloid connexin

Những alkaloid có cấu trúc terpen

Cấu trúc terpen là cấu trúc trong phân tử chỉ có C, H hoặc C, H, O Genalkaloid là do chức amin bậc 3 của vài alkaloid bị khóa bởi nguyên tử oxy, tạo ra một nhóm chức aminooxit R=N→O như N – oxy – hyozxiamin, N – oxyhiosxin, N – oxy – bufotein Các genalkaloid thường có độc tính giảm đi nhiều so với alkaloid, ví dụ ít độc hơn atropin 250 lần Để điều chế genalkaloid người ta cho các alkaloid tác dụng với H2O2

1.2.4 Phân bố alkaloid

Cromwell (1995) ước tính alkaloid phân bố trong khoảng 1 phần 7 loài thực vật có hoa Một ước tính khác (Hegnauer, 1963) cho rằng alkaloid có từ 12 % - 20 % trong tổng số cây có nhựa Còn Willaman và Schubert (1955) thì cho rằng trong hơn 300 họ của ngành hạt kín thì 1/3 họ có chứa alkaloid Nhiều tổng kết cho thấy đại đa số cây có chứa alkaloid là cây hai lá mầm Có rất nhiều loài có alkaloid nhưng chỉ ở mức độ dạng vết hoặc ở tỷ lệ phần vạn, mười vạn Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, một cây được xem là có alkaloid phải chứa ít nhất là 0,05 % alkaloid so với dược liệu khô

Mối liên quan giữa alkaloid với các chất khác trong một cây cũng đã được nghiên cứu Cây có chứa alkaloid đều vắng mặt tinh dầu và ngược lại (Trelibs, 1955) Hiện tượng này đưa đến ý kiến cho rằng chức năng của 2 nhóm hợp chất này đối với cây cỏ là giống nhau

Một vài nhận xét khác là sự có mặt của axit amin thông thường và một vài loại axit amin đặc biệt (tiền chất của alkaloid) trong các loài có nồng độ tương đương với

8 nồng độ alkaloid (Michels – Nyomorkay, 1970; Paris và Girre, 1969) Điều này khẳng

định thêm quá trình tổng hợp alkaloid trong cây bắt nguồn từ các axit amin [1][4][29] 1.2.5 Sinh tổng hợp alkaloid

Có rất nhiều sách và tổng quan đề cập đến vấn đề sinh tổng hợp alkaloid trong

cây (Mothes và Schute, 1969; Robinson, 1968; Spenser, 1970) [4][29]

Nói chung cho đến nay người ta thừa nhận rằng đại đa số alkaloid là dẫn xuất của axit amin Mối quan hệ giữa alkaloid và các axit amin đã được biết đến từ đầu thế kỷ 20 và đã có nhiều nghiên cứu tổng hợp alkaloid từ axit amin

Có thể nói giai đoạn quan trọng đầu tiên trong sự chuyển hóa axit amin thành alkaloid là sự khử carboxyl thành một amin và tiếp đến là sự oxy hóa amin này thành andehyd bởi men oxydase amin Việc ngưng tụ một nhóm amin bởi andehyd dẫn đến tạo các vòng đặc trưng cho alkaloid

Mặc dù đại đa số alkaloid dẫn xuất của axit amin nhưng một số alkaloid khác lại bắt nguồn từ một số tiền chất riêng Bằng phương pháp dùng axit amin có nguyên tố đồng đánh dấu người ta chứng minh rõ ràng về các tiền chất alkaloid

1.2.6 Tính chất của alkaloid

1.2.6.1 Tính bazơ

Alkaloid là các bazơ yếu, do sự có mặt của nguyên tử N Nhưng độ kiềm của alkaloid không giống nhau do ảnh hưởng khác nhau của lớp điện tích nguyên tử N gây ra và ảnh hưởng của các nhóm chức khác Nói chung tính bazơ giảm dần theo thứ tự amoni bậc 4, amoni bậc 1, amoni bậc 2, amoni bậc 3 Tính bazơ phản ánh ở pKa khác nhau của các alkaloid Các bazơ yếu (trị số pKa thấp) sẽ cần môi trường axit mạnh hơn để tạo thành muối trong dung dịch nước Vì vậy ở môi trường axit yếu một số alkaloid bazơ mạnh có thể chuyển thành muối trong khi các bazơ yếu vẫn tồn tại trong dung dịch dưới dạng bazơ Đặc tính này được ứng dụng trong việc tách các nhóm alkaloid

có trị số pKa khác nhau bởi hỗn hợp của chúng [1][4][27]

1.2.6.2 Tính hòa tan

Hầu hết các alkaloid bazơ thực tế không tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ như chloroform, ete và các alcol bậc thấp (methanol, etanol, propanol, butanol)

9 Một số nhóm alkaloid có thêm các nhóm phân cực nên tạo được một phần trong nước hoặc trong kiềm Ví dụ: mocphin, cephalin, do có nhóm OH phenol nên tan trong dung dịch kiềm và các bazơ của chúng thi gần như là không tan trong ete

Ngược lại với bazơ, các muối alkaloid nói chung tan được trong nước và cồn nhưng hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: chloroform, ete, benzen

Một số trường hợp ngoại lệ như ephedrin, pilocarpin, nicotin, cafein,… tan trong nước dễ dàng, còn muối của của các alkaloid như cocain clohydrat, quinin, bromhydrat, tan nhiều trong chloroform

1.2.7 Cơ sở và nguyên tắc tách chiết alkaloid

1.2.7.2 Một số đặc tính khác cần chú ý trong quá trình chiết xuất

Trong cây, alkaloid tồn tại dưới dạng muối của các axit hữu cơ nhưng một số kết hợp với tanin (nhất là những cây có nhiều tanin) vì vậy đối với dược liệu có nhiều tanin thì cần dùng dung môi có độ phân cực mạnh hơn hoặc chiết nóng để tách alkaloid ra khỏi tanin và hòa tan vào dung môi

Một số loại alkaloid là các este như atropin, cocain, heliotrin có thể bị thủy phân trong quá trình chiết xuất nên rất hạn chế sử dụng nhiệt độ cao Ngược lại một số alkaloid tồn tại trong cây dưới dạng glycosid (glycoalcaloid) như solamacgin, solasonin trong các loài Solanum Để chiết các alkaloid này cần có giai đoạn thủy phân [1][4][5]

Nói chung, một số alkaloid là một chất tương đối bền vững so với nhiều chất tự nhiên khác Nhưng một số hợp chất thuộc nhóm indol rất dễ bị thủy phân hoặc biến chất bởi ánh sáng và các tác nhân oxy hóa – khử khác nên cần chú ý kiểm soát các yếu tố có thể làm hỏng alkaloid trong quá trình chiết xuất

10 Đại đa số các alkaloid là chất kết tinh không màu và có điểm nóng chảy xác định, chỉ có một số ít alkaloid có màu vàng (becberin, palmatin, secpentin…) có thể lợi dụng chúng trong quá trình chiết tách [1][4][5]

1.2.7.3 Chiết xuất alkaloid

Nói chung alkaloid có thể chiết từ dược liệu khô tán bột Để hạn chế khó khăn trong quá trình chiết tách, đối với dược liệu nhiều chất béo, chất màu nên có giai đoạn loại tạp Có 2 cách [1][5]:

- Ngâm bột dược liệu với ete dầu hoặc ete trong vài giờ hoặc 1 ngày - Chiết liên tục bằng Soxhlet hoặc hồi lưu với ete dầu trong 1 – 2 giờ Bột loại tạp xong, để khô tự nhiên

Có 2 phương pháp chính để chiết xuất alkaloid: Chiết bằng dung môi hữu cơ (alkaloid được chiết dưới dạng bazơ) và chiết bằng dung dịch nước axit hoặc cồn (alkaloid được chiết dưới dạng muối)

1.2.8 Hoạt tính sinh học của các alkaloid

Tác dụng lên hệ thần kinh: kích thích giao cảm (ephedrin, hordein, ), tê liệt

giao cảm (ergotanin,…), kích thích phó giao cảm hay làm tê liệt phó giao cảm

Gây tê, trị co giật

Làm thuốc chống rung tim (ajmalin, quinidin,…), chống trầm uất (quinin,

emectin, )

Làm tăng hoặc giảm huyết áp Tiêu diệt kí sinh trùng, vi khuẩn [1] 1.3 Kháng sinh và kháng sinh thực vật 1.3.1 Kháng sinh

1.3.1.1 Khái niệm

Kháng sinh là những chất hóa học – không kể nguồn gốc – có tác động chống vi sinh vật, ngăn cản vi sinh vật nhân lên hoặc phá hủy vi sinh vật ở liều thấp, bằng cách tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết cho sự sống của vi khuẩn, làm ức chế sự sống hay làm ảnh hưởng đến sự cân bằng hóa lý của vi sinh vật [7][15]

11

1.3.1.2 Cơ chế tác động của kháng sinh

Tác động vào sự thành lập thành tế bào vi khuẩn: Tác động lên giai đoạn tổng hợp uridindiphosphat (UDP) hay tác động ngăn cản sự kết nối của hai peptidoglycan kế cận nhau

Tác động lên màng sinh chất: Thay đổi tính thấm của màng tế bào hay ức chế tổng hợp lipit trên màng

Tác động ức chế tổng hợp axit nucleic: Ức chế DNA gyrase mở xoắn DNA để sao chép, ức chế DNA polymerase tổng hợp RNA, ức chế tổng hợp axit folic

Tác động ức chế tổng hợp protein: Ngăn chặn sự khởi đầu quá trình tổng hợp chuỗi polypeptit, ngăn chặn sự kéo dài của chuỗi polypeptit [4][5]

Về cách sử dụng: Phần lớn các kháng sinh thực vật rất bền vững và dễ hoà tan trong nước, do đó hầu hết các kháng sinh thực vật thường được dùng dưới dạng thuốc sắc - dạng bào chế đơn giản và thông dụng nhất

Những kết quả nghiên cứu y học gần đây đã chứng minh những cây thuốc có khả năng kháng khuẩn của nước ta rất phong phú, có tác dụng chữa được nhiều bệnh nhiễm khuẩn và kinh nghiệm chữa bệnh của nhân dân ta là có cơ sở và có kết quả [15]

1.3.2.2 Ưu – nhược điểm của kháng sinh thực vật

 Ưu điểm

- Ít độc hại, không gây tai biến

- Không bị kháng thuốc bởi các cơ chế tác động của vi sinh vật

- Rẻ tiền, dễ sản xuất vả sử dụng [15]

12  Nhược điểm:

- Hoạt lực yếu hơn các kháng sinh từ vi sinh vật và các kháng sinh tổng hợp, bán tổng hợp khác nên chỉ sử dụng trong những trường hợp kháng khuẩn nhẹ và thông thường

- Liều điều trị cao, thời gian điều trị kéo dài [15]

1.3.2.3 Một vài nhóm hoạt chất từ thực vật có hoạt tính kháng sinh

 Terpenoid và tinh dầu:

- Cơ chế tác động của terpenoid chưa được khẳng định rõ ràng, nhưng được

suy đoán là liên quan đến sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic

- Hầu hết tinh dầu đều có tính diệt khuẩn, diệt nấm và diệt côn trùng Ví dụ:

Eucalypton, cineol (Tràm); allyl (Tỏi), artemisinin (Thanh Hao Hoa Vàng)…  Alkaloid:

- Cơ chế kháng khuẩn của berberin là do khả năng gây đột biến RNA của ký

sinh trùng gây bệnh sốt rét, chính vì điều này mà tác dụng kháng khuẩn của berberin khá mạnh đối với loại trùng gây bệnh này

- Một vài alkaloid có hoạt tính kháng khuẩn: Berberin (Vàng Đắng, Hoàng

Liên), solamargin (họ Cà), capsaicin (Ớt)…  Quinon:

- Quinon được biết là có thể tạo phức bền chặt với các axit amin ái nhân trong

protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein Vì lí do đó, khả năng kháng khuẩn của quinon rất lớn Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt tế bào, polypeptid ở thành tế bào và các enzym trên màng Quinon cũng tạo ra chất nền không thể sử dụng được cho các vi sinh vật

- Một vài quinon có tác dụng kháng khuẩn: anthraquinon, hypericin…

 Coumarin:

- Cơ chế diệt khuẩn tương tự như quinon - Một vài coumarin có khả năng kháng khuẩn: novobiocin…

 Flavonoid:

- Hoạt tính kháng khuẩn của flavonoid là do khả năng tạo phức với các protein

ngoại bào và tạo phức với thành tế bào vi khuẩn

13

- Một vài flavonoid có tác dụng kháng khuẩn: catechin (Trà Xanh),

swertifranchesid, glycyrrhizin (Cam Thảo), alpinumisoflavon, phloretin, galangin…

 Tanin:

- Tanin tạo phức với các protein thông qua các liên kết không đặc hiệu như liên

kết hydro và các liên kết cộng hóa trị Vì vậy, cơ chế kháng khuẩn của tanin cũng tương tự như các hợp chất quinon Khi liên kết với protein chúng có thể làm mất hoạt tính của các protein chức năng Các protein này có thể là enzym, các protein vận chuyển hay polypeptit trên thành tế bào… Tính kháng khuẩn của tanin được tăng cường bởi tia UV ở bước sóng khoảng 320 đến 400 nm  Saponin:

- Thường được biết đến với khả năng diệt protozoa Khả năng diệt protozoa của

saponin do sự kết hợp với cholesterol trên màng, làm cho màng bị phá hủy, gây ly giải tế bào

- Saponin có khả năng diệt protozoa: yuccin, quillajin…[17][21][40] 1.4 Tổng quan về các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn

Có nhiều phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, tùy theo tính hòa tan của chất cần nghiên cứu mà lựa chọn cho phù hợp [16][18]

1.4.1 Phương pháp khếch tán trên đĩa thạch

Phương pháp này có 3 cách tiến hành

1.4.1.1 Phương pháp đặt đĩa giấy

Các đĩa giấy được tẩm thuốc thử hay hóa chất rồi đặt lên mặt thạch đã cấy sẵn vi sinh vật Tính kháng khuẩn được thể hiện bằng vòng vô khuẩn Phương pháp này thường áp dụng đối với kháng sinh có tác dụng trên vi khuẩn (còn gọi là phương pháp kháng sinh đồ - đây là thử nghiệm đi trước thử nghiệm tìm MIC – nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật) Nhược điểm của phương pháp này là nếu thuốc thử và hóa chất khó khuếch tán vào bản thạch sẽ làm sai lệch kết quả và phải tính toán phức tạp

1.4.1.2 Phương pháp đục lỗ

Sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị ức chế do sự khuếch tán của chất kháng khuẩn từ một lỗ đục trên mặt thạch vào môi trường xung quanh Tính kháng khuẩn của dung dịch thử nghiệm được biểu hiện bằng một vòng kháng khuẩn Với phương pháp này

14 cần phải thăm dò để tìm ra một dung dịch đệm và môi trường để chất thử nghiệm có thể khuếch tán tốt

Ưu điểm của phương pháp này là dễ làm, nhanh chóng Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là nếu chất thử khó khuếch tán vào trong bản thạch sẽ làm kết quả không ổn định Mặc khác chưa có tiêu chuẩn đánh giá thống nhất đường kính vòng vô khuẩn nên kết quả nhận được chỉ mang tính tương đối

1.4.1.3 Phương pháp ống trụ

Kháng sinh được đặt trong ống hình trụ rồi đặt vào bản thạch Kháng sinh sẽ khuếch tán vào trong thạch và ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn tạo thành vùng ức chế xung quanh nơi đặt kháng sinh

1.4.2 Phương pháp pha loãng

1.4.2.1 Pha loãng trong môi trường lỏng

Phương pháp này nhanh, gọn, dễ thực hiện nhưng chỉ áp dụng được với những

chất dễ tan trong nước

1.4.2.2 Pha loãng trên thạch

Phương pháp này thích hợp với những chất khó tan trong nước Trong giai đoạn khảo sát MIC của vi khuẩn thường áp dụng phương pháp này theo cách cải tiến hơn là sử dụng đĩa 96 giếng (phương pháp Microdilution) Phương pháp Microdilution có

nhiều ưu điểm nổi trội hơn so với những phương cách cũ Cụ thể là:

- Chất thử được pha trực tiếp trên giếng - Lượng mẫu sử dụng ít

- Dễ thực hiện, thao tác nhanh - Làm nhiều mẫu trong cùng một lúc nên cho kết quả chính xác

1.4.3 Khái quát về MIC (Minimum inhibitory concentration)

1.4.3.1 Định nghĩa MIC

MIC của một chất được xác định dựa vào nồng độ tối thiểu của chất đó có khả

năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn từ 80 – 100 % khi quan sát bằng mắt thường

1.4.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến MIC

- pH: Môi trường sử dụng nếu pH thấp thì MIC tăng - Nhiệt độ: Tùy loại vi khuẩn mà ta có nhiệt độ ủ thích hợp - Lượng tế bào vi khuẩn trong các thử nghiệm phải xác định

15 - Thời gian đọc kết quả phải chính xác, nếu kéo dài thời gian ủ sẽ làm tăng MIC

1.5 Nghiên cứu khả năng kháng ung thư của thực vật 1.5.1 Khái quát về ung thư và các phương pháp điều trị

Ung thư là một bệnh của các tế bào, vốn là những đơn vị cấu trúc cơ bản của cơ thể Cơ thể chúng ta liên tục sản xuất ra các tế bào để giúp chúng ta phát triển, để thay thế những tế bào đã chết, hoặc hàn gắn lại những tế bào bị tổn thương sau một chấn thương Các gen nào đó kiểm soát quá trình này và chính việc gây tổn hại những gen này dẫn đến các bệnh ung thư Sự tổn hại này thường xảy ra trong cuộc đời con người, mặc dù có một số nhỏ lại thừa hưởng những gen này từ cha mẹ họ Bình thường thì các tế bào phát triển và nhân lên theo một trình tự Tuy nhiên, những gen đã bị tổn hại có thể phát triển không bình thường Chúng có thể phát triển thành những khối gọi là u hay bướu Những khối u có thể lành tính (không phải ung thư) hoặc ác tính (ung thư) Những khối u lành tính không xâm lấn vào các cơ quan và các mô xung quanh của cơ thể Trong khi u ác tính sẽ phát triển, nó có thể giới hạn trong khu vực ban đầu Nếu những tế bào này không được xử lý hay điều trị, chúng có thể xâm lấn ra ngoài phạm vi ban đầu và xâm lấn vào những mô xung quanh, trở thành ung thư xâm lấn

Hình 1.2: Quá trình phát triển của khối tế bào ung thư

Một số u lành tính là tiền ung thư và có thể tiến triển thành ung thư nếu không được điều trị Nhưng đa số u lành tính không phát triển thành ung thư [50]

16 Ban đầu, các tế bào ung thư phát triển ngay tại mô mà nó sinh ra Sau đó, các tế bào tách khỏi khối ung thư ban đầu, xuôi theo dòng bạch huyết hoặc theo dòng máu để tới những cơ quan khác của cơ thể Khi những tế bào này tới vùng mới, chúng có thể tiếp tục phát triển và tạo ra một khối u tại vùng đó Cái này gọi là ung thư thứ phát hay di căn [50]

Hình 1.3: Quá trình di căn của khối tế bào ung thư

Cơ quan Nghiên cứu Quốc tế về các bệnh Ung thư ước tính về tỷ lệ tử vong và tỷ lệ nhiễm từ các loại ung thư cho biết trên 184 quốc gia đã có 14,1 triệu trường hợp ung thư mới, 8,2 triệu ca tử vong ung thư và 32,6 triệu người sống chung với căn bệnh ung thư (trong vòng 5 năm chẩn đoán) trong năm 2012 trên toàn thế giới Đến năm 2030, nó được dự đoán rằng sẽ có 26 triệu trường hợp ung thư mới và 17 triệu ca tử vong ung thư mỗi năm [43]

Các phương pháp trị liệu bằng các thuốc hóa học tổng hợp đang được sử dụng trên lâm sàng đã không thành công như mong đợi mặc dù chi phí đáng kể cho nghiên cứu và sử dụng Do đó việc phát triển các loại thuốc chống ung thư mới, hiệu quả, và giá cả phải chăng là một nhu cầu liên tục Từ thời cổ đại, các hợp chất hóa học có nguồn gốc từ thực vật đã được sử dụng để điều trị bệnh cho người Sản phẩm tự nhiên đã nhận được sự chú ý ngày càng tăng trong 30 năm qua vì tiềm năng phòng ngừa và điều trị ung thư thông thường Song song đó, ngày càng có bằng chứng cho tiềm năng của hợp chất có nguồn gốc thực vật như chất ức chế các giai đoạn khác nhau của khối u và quá trình viêm có liên quan [38], nhấn mạnh tầm quan trọng của các sản phẩm này trong việc phòng chống ung thư và điều trị

17 Khoảng 60 % các loại thuốc hiện đang được sử dụng để điều trị ung thư đã được phân lập từ các sản phẩm tự nhiên và thực vật là nguồn quan trọng nhất Chúng bao gồm các alkaloid vinca, taxus diterpen, camptotheca alkaloid, và podophyllum lignan Hiện nay, trong số 16 hợp chất thực vật có nguồn gốc từ mới đang được thử nghiệm trong các thử nghiệm lâm sàng, 13 đang trong giai đoạn I hoặc II và 3 đang trong giai đoạn III Cây dược liệu tạo thành một lựa chọn phổ biến để điều trị ung thư ở nhiều nước trên thế giới Tại thời điểm này, hơn 3000 cây thuốc trên toàn thế giới đã được báo cáo là có đặc tính chống ung thư Trên toàn cầu, tỷ lệ sản phẩm nguồn gốc thực vật để điều trị ung thư là từ 10 % đến 40 % với tỷ lệ này đạt 50 % ở bệnh nhân Châu Á Ở châu Âu chi cho sản phẩm thảo dược chống ung thư được ước tính là 5 tỷ đô la cho mỗi năm [23]

Trong nghiên cứu này, các dòng tế bào ung thư được sử dụng là tế bào ung thư vú MCF – 7, ung thư phổi NCI – H460, ung thư gan HepG2, ung thư cổ tử cung HeLa

Tế bào ung thư vú MCF – 7 sẽ bị ức chế bởi nhiều flavonoid (trong Tephrosia

purpurea và Ficus religiosa) [47] hay alkaloid (như berberin) [32] Tế bào ung thư

phổi NCI – H460 có thể được tiêu diệt bởi curcumin theo cơ chế apoptosis [37] Tế

bào ung thư gan HepG2 có thể chết theo cơ chế hóa học bởi các chất chiết từ Angelica

dahurica [45] hay polyphylin D từ Paris polyphylla [33] Tế bào ung thư vú HL – 60

dễ bị tiêu diệt bởi các chất từ cây Taxus mairei, Cephalataxus fortune, Torreya grandis

[49]… Các dòng tế bào này hầu như có thể bị tiêu diệt bởi các hợp chất tự nhiên hay hóa học Tuy nhiên hiệu quả điều trị vẫn chưa thật sự tốt như mong đợi

1.5.2 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất tự nhiên

1.5.2.1 Nghiên cứu độc tính tế bào

Trong lĩnh vực nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị ung thư, đánh giá độc tính của các chất trên các dòng tế bào ung thư là một bước thiết yếu cho phép sàng lọc những hợp chất có tiềm năng Chất thử được cho vào môi trường đã có sẵn các dòng tế bào ung thư và tế bào thường, quan sát tỉ lệ sống của các dòng tế bào và ra kết luận

Thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B)

- Đánh giá độc tính thông qua hoạt động sinh tổng hợp protein tổng của tế bào

18 - Thử nghiệm SRB (Sulforhodamin B) là một phương pháp so màu đơn giản và

nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện với các phần tích điện dương của protein Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào

- Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu

- Kết quả ổn định, tương quan với các thử nghiệm độc tính khác và được viện Ung Thư Hoa Kì (NCI) sử dụng cho chương trình sàng lọc của mình

Thử nghiệm xCELLigence

- Xác định độc tính dựa trên sự bám trải của tế bào lên bề mặt nuôi cấy - Cho phép đánh giá tác động của chất thử theo thời gian thực (realtime)

1.5.2.2 Nghiên cứu cảm ứng apoptosis

Apoptosis là một kiểu chết được kiểm soát bởi sự biểu hiện của những gen trong tế bào và là một trong những mục tiêu quan trọng cho việc lựa chọn hoạt chất tiềm năng trong tiêu diệt tế bào ung thư Do đó, xác định khả năng cảm ứng apoptosis là bước đi sâu hơn vào cơ chế tế bào và phân tử của tính kháng ung thư sau bước sàng lọc độc tính ban đầu

Nhuộm huỳnh quang kép với AO (acridine orange) và EB (ethidium bromide): Phát hiện sự cô đặc nhiễm sắc chất trong quá trình apoptosis

Thử nghiệm caspase – 3: Khảo sát hoạt tính của enzym caspase – 3, một

enzym được hoạt hóa chính trong quá trình apoptosis

Tách chiết DNA phân mảnh: phát hiện được sự phân cắt đặc hiệu DNA bộ

gen thành những đoạn có kích thước 180 bp hoặc bội số của 180 bp, tạo thành một “thang DNA” (DNA laddering) trong quá trình apoptosis

1.6 Một số kết quả nghiên cứu trên cây Thuốc Thượng và các cây cùng chi

Phaeanthus

Chi Phaeanthus trên thế giới có khoảng 30 loài, phân bố chủ yếu ở Nam Á và

Đông Nam Á Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng alkaloid phân bố trên các thực vật trong

19

chi này là tác nhân kháng khuẩn mạnh Trong chi Phaeanthus đã phân lập được một số

alkaloid như: o,o'-dimethylgrisabin, limacin, 7-o-methylgrisabin, phaeantharin, phaeanthin Các alkaloid trong chi này phần lớn thuộc nhóm isoquinon và β – benzylisoquinon,… [29][41]

Phaeanthus ebracteolatus (Presl.) Merr là một loại cây mọc nhiều ở rừng nhiệt

đới của Philippines Từ cây này người ta phân lập được 1 alkaloid là

β-benzylisoquinolin được biết với tên gọi là phaeantharin; chất này có tác dụng kháng khuẩn và côn trùng khá mạnh [48]

Fasihuddin và các cộng sự (1991) nghiên cứu trên cây Phaeanthus

crassibetalus Beec đã phân lập được 2 alkaloid chính và xác định cấu trúc của nó

bằng quang phổ là phaeanthin và limacin Hai chất này đều có khả năng kháng lại các vi khuẩn Gram âm và Gram dương

Một số loài khác thuộc chi Phaeanthus cũng được nghiên cứu như: P nutans,

P ophthalmicus và thu được một số kết quả về phân tích các alkaloid… [27][41]

Riêng loài Phaeanthus vietnamensis Ban chưa có công trình nghiên cứu tổng

quát về thành phần hóa học và tác dụng dược lý Nhóm tác giả Nguyễn Thị Nghĩa và các cộng sự (1991) đã phân lập được 8 alkaloid từ cây này Trên cơ sở đó các tác giả đã xác định được một alkaloid từ loài này có khả năng kháng khuẩn là (-)-7,7'-O-O'-dimethylgrisabin

Bảng 1.1: Nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn bởi Phaeanthin và Limacin [28]

Vi Khuẩn Nồng độ ức chế tối thiểu (µg/ml)

20 1 R = CH3 ( Phaeanthin)

2 R = H ( Limacin )

Hình 1.4: Cấu trúc của Phaeanthin và Limacin [28]

Nhìn chung, hiện nay cây Thuốc Thƣợng (Phaeanthus vietnamensis Ban) và

các cây thuốc cùng chi này hiện có rất ít công trình nghiên cứu [39]

Dịch chiết ethanol của Phaeanthus ophtalmicus có khả năng kháng tế bào ung thƣ bạch cầu HL – 60 Nhìn chung, trong họ Na và chi Phaeanthus đều chứa nhiều

alkaloid và các acetogenin có khả năng kháng ung thƣ cao Hợp chất phaeantharin

(thuộc nhóm bysbenzylisoquinolin) phân lập từ cây Phaeanthus ebracteolatus có khả

năng kháng ung thƣ cao [24]

21

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Cây thuốc

Cây Thuốc Thượng (Phaeanthus vietnamensis Ban) được thu hái ở núi Bà Nà

Đà Nẵng Mẫu được định danh và lưu trữ tại Trung Tâm Sâm và Dược Liệu TP HCM

2.1.2 Các vi khuẩn sử dụng để xác định tính kháng khuẩn  Nhóm vi khuẩn Gram Dương

Staphylococcus aureus ATCC 25953 (MSSA); Staphylococcus aureus ATCC

43300 (MRSA)

 Nhóm vi khuẩn Gram Âm

Escherichia coli ATCC 25922; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

2.1.3 Các dòng tế bào ung thư

Các dòng tế bào ung thư: MCF-7 (ung thư vú), NCI-H460 (ung thư phổi), HepG2 (ung thư gan) và Hela (ung thư cổ tử cung) được mua từ ATCC, Hoa Kỳ Tế bào fibroblast được phân lập từ da bao qui đầu người, đại diện cho tế bào thường Các dòng tế bào ung thư và fibroblast được nuôi cấy và bảo quản tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Bộ môn Di truyền – trường ĐH Khoa học Tự nhiên TP HCM

Hình 2.1 Một số dòng tế bào ung thư và dòng tế bào fibroblast 2.1.4 Dung môi, hóa chất

- Dung môi: Chloroform, dietyl ete, aceton, ethanol, methanol, n – butanol

- Hóa chất: Javel, carmin 1 %, lục iod 0,1 %, axit acetic, amoni hydroxid, anhydrid acetic, FeCl3, HCl, H2SO4, KOH, Mg, CaSO4 khan, Na2CO3, dung dịch NH3 25 % - Thuốc thử: Dragendorff, Mayer, Bouchardat, Fehling, Erdman

- Bản mỏng tráng sẵn, silica gel

22 - Các hóa chất: axit trichloroacetic (TCA), axit acetic 1 %, camptothecin 0,01 (µg/ml), Sulforhodamine B và các hóa chất cơ bản dùng trong nghiên cứu nuôi cấy tế bào động vật

2.1.5 Môi trường

Môi trường giữ giống vi khuẩn và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn NA [16]: pepton (8 g/l); casein (4 g/l); cao nấm men (3 g/l); glucose (1 g/l); agar (15 g/l); nước cất vừa đủ 1 lít Đun nóng hòa tan agar, cho vào các ống nghiệm mỗi ống khoảng 10 ml, đem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút rồi nghiêng thạch

Môi trường hoạt hóa vi khuẩn: chỉnh pH cho phù hợp, cho vào mỗi ống nghiệm 5 ml môi trường, sau đó đem hấp khử trùng

Sơ đồ nghiên cứu

2.2 Phương pháp xác định thành phần hóa học của cây Thuốc Thượng

Phaeanthus vietnamensis Ban

 Xác định độ ẩm, độ tro  Định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật  Định tính xác định các nhóm hợp chất

23  Sắc ký lớp mỏng

 Định lƣợng hoạt chất chính trong mẫu

2.2.1 Xác định độ ẩm, độ tro của dƣợc liệu

Độ ẩm, độ tro của dƣợc liệu đƣợc xác định theo quy trình của Dƣợc Điển Việt Nam IV [1][5][6]

Xác định độ ẩm: Lấy một dụng cụ chứa sấy đến khối lƣợng không đổi ở 105C (chênh lệch khối lƣợng giữa 2 lần sấy và cân liên tiếp là 5 mg), lấy khối lƣợng đó là khối lƣợng bì Cân vào bì một lƣợng chính xác khoảng 2-5 g dƣợc liệu rồi sấy ở 105C trong 2-3 giờ Lấy miếng bì có chứa dƣợc liệu đã sấy, cho vào bình hút ẩm và để nguội trong khoảng 15 phút Cân và ghi kết quả Tiếp tục sấy trong 1 giờ, để nguội và cân mẫu nhƣ trên cho đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không quá 5 mg

- Tính kết quả:

%100



abaX

Với: X – độ ẩm dƣợc liệu, %

a – khối lƣợng dƣợc liệu khi chƣa sấy, g

b – khối lƣợng dƣợc liệu khi sấy đến khối lƣợng không đổi, g

Xác định tro toàn phần: Nung một chén nung bằng sứ tới khối lƣợng không

đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lƣợng của chén không (b).Cân chính xác khoảng 1 – 3 g dƣợc liệu (c) cho vào chén nung Trải đều dƣợc liệu ở đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi dƣợc liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc

khói

Dùng kẹp sắt dài đƣa chén vào lò nung ở 500 – 600°C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen) Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm, sau đó đem cân

Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1giờ nữa Lấy chén ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm, sau đó đem cân

Tiếp tục làm nhƣ vậy cho đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lƣợng chén có tro (a) chênh lệch nhau không quá 0,5 mg

Tro toàn phần tính trên dƣợc liệu khô kiệt theo công thức:

( )

( )

24

Với A: tro toàn phần của dược liệu, %

a: khối lượng chén có tro, g b: khối lượng chén không, g c: khối lượng dược liệu dùng, g h: độ ẩm của dược liệu, %

Xác định tro không tan trong HCl: Lấy chén nung đã xác định tro toàn phần,

thêm vào đó 15 ml nước cất và 10 ml HCl 10 % Đậy chén nung bằng một mặt kính đồng hồ, đun sôi cẩn thận 10 phút rồi để nguội Rửa mặt kính đồng hồ với 5 ml nước nóng rồi cho vào chén nung Tập trung chất không tan vào một phểu lọc thủy tinh xốp đã cân bì hay vào một giấy lọc không tro Rửa (cả lọc và tro) bằng nước cất nóng tới khi dịch lọc cho phản ứng trung tính (thử bằng giấy quỳ) Cho cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô, đốt, rồi nung ở 500 – 600°C trong 2 giờ Để nguội trong bình hút ẩm và cân Nung tiếp tới khi giữa 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chênh lệch nhau không vượt quá 1 mg

Tính tỉ lệ phần trăm của tro không tan trong axit so với lượng dược liệu đã dùng theo công thức:

( ) Với X: tro không tan trong axit, %

a: khối lượng chén có tro, g b: khối lượng chén không tro, g c: khối lượng dược liệu dùng, g [2][3]

Xác định tro sulfat: Dùng chén nung bằng sứ đã được cân bì đến khối lượng

không đổi Cân chính xác khoảng 1 g dược liệu cho vào chén, nhỏ vào đó 0,5 – 1 ml H2SO4 đậm đặc sao cho axit thấm đều vào dược liệu Đặt chén trên bếp điện có lưới amiang, đốt cẩn thận cho đến khi không còn hơi axit bay lên Sau đó đặt chén vào lò nung, nung đến khối lượng không đổi Cân và tính toán kết quả giống như khi xác định tro toàn phần [2]

25

2.2.2 Định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật  Chuẩn bị dịch chiết

Chiết dịch chiết ete

Chiết 10 – 25 g bột dược liệu (có thể ít hơn hay nhiều hơn, tùy điều kiện thực hiện và nguyên liệu cụ thể) bằng dietyl ete trong Soxhlet hay lắc trong erlen trong 10 – 20 phút Chiết cho tới khi dịch chiết ete sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ Gộp dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết ete

Chiết dịch chiết cồn

Bã dược liệu được chiết tiếp bằng cồn cao độ (hoặc methanol) trong erlen với sinh hàn hồi lưu 20 - 30 phút trên bếp cách thủy, thực hiện 2 - 3 lần Gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết cồn

Phần lớn dịch chiết cồn được dùng để định tính trực tiếp các nhóm hợp chất Một phần dịch chiết được thủy phân để định tính các aglycon sau khi thủy phân Lấy 15 ml dịch chiết cồn cho vào erlen 100 ml, thêm 10 ml HCl 10 % và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút Để nguội, cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết bằng ete ethylic (15 ml x 3 lần) Dịch ete được dùng để định tính các aglycon

Chiết dịch chiết nước

Bã dược liệu sau khi chiết bằng cồn được đem chiết nóng với nước trong erlen trên bếp cách thủy sôi Gộp các dịch chiết, để nguội, lọc (và cô lại nếu cần) để thu được khoảng 50 ml dịch chiết nước

Phần lớn dịch chiết nước được dùng để định tính trực tiếp các nhóm chất Một phần dịch chiết được thủy phân để định tính các aglycon sau khi thủy phân Lấy 15 ml dịch chiết nước cho vào erlen 100 ml, thêm 10 ml HCl 10 % và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút Để nguội, cho hỗn hợp vào bình lắng gạn vào chiết bằng ete ethylic (15 ml x 3 lần) Dịch ete được dùng để định tính các aglycon

 Xác định các nhóm hợp chất

Dịch ete được dùng để xác định các nhóm hợp chất sau: Chất béo, tinh dầu, carotenoid, triterpenoid tự do, alkaloid, coumarin, anthraquinon, flavonoid