Slide Báo cáo hội nghị khoa học công nghệ tuổi trẻ 2018 THIẾT KẾ, TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ NHYDROXYBENZAMIDPROPENAMID MANG KHUNG QUINAZOLIN4(3H)ON HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ

HỘI NGHỊ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TUỔI TRẺ LẦN THỨ XIX THIẾT KẾ, TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ N-HYDROXYBENZAMID/PROPENAMID MANG KHUNG QUINAZOLIN-43H-ON HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁN

HỘI NGHỊ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TUỔI TRẺ

LẦN THỨ XIX

THIẾT KẾ, TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA MỘT SỐ

N-HYDROXYBENZAMID/PROPENAMID

MANG KHUNG QUINAZOLIN-4(3H)-ON

HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ

Báo cáo viên: Dương Tiến Anh Trường Đại học Dược Hà Nội

1

Hoạt động của enzym HDAC và HAT [1]

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

[1] Blackbum C., Barrett C., Chin J., et al (2013), “Potent histone deacetylase inhibitors derived from 4-(aminomethyl)-N-hydroxybenzamide

with high selectivity for the HDAC6 isoform”, Journal of Medicinal Chemistry, 56, pp 7201-7211

CÁC CẤU TRÚC KHUNG CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ

Hình 1 Cấu trúc một số chất ức chế HDAC

Định hướng thiết kế chứa hợp phần acid hydroxamic

1.1 Hợp phần acid hydroxamic

CÁC CẤU TRÚC KHUNG CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ

Hình 2 Cấu trúc một số chất có hoạt tính sinh học mang khung quinazolin-4(3H)-on

Định hướng thiết kế chứa hợp phần Quinazolin-4(3H)-on

1.2 Hợp phần Quinazolin-4(3H)-on

Hình 3 Thiết kế một số dẫn chất N-hydroxybenzamid/propenamid mới

Thiết kế công thức chất mới hướng ức chế HDAC

1 Thiết kế và sàng lọc sơ bộ các dẫn chất tiềm năng.

10a: R = H 10b: R = 7-CH310c: R = 6-CH310d: R = 6-Cl

2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro.

1 Nghiên cứu docking

3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Nghiên cứu Docking

Kết quả Docking của 16 dẫn chất N-hydroxybenzamid/propenamid với HDAC-2.

Chất R Ái lực liên kết (kcal/

6-CH 3 7-F

- 9,66

- 9,29

SAHA - 7,07

3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tổng hợp hóa học

Sơ đồ 2 Quy trình tổng hợp dẫn chất 8a-d

13

8a: R = H 8b: R = 7-CH38c: R = 6-CH38d: R = 6-Cl

Tổng hợp hóa học

Sơ đồ 3 Quy trình tổng hợp dẫn chất 10a-d

10a: R = H 10b: R = 7-CH310c: R = 6-CH310d: R = 7-Cl

Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các dẫn chất 4a-h

Chất R KLPT Thể chất Màu kết tinh lại Dung môi H%

Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các dẫn chất 8a-d, 10a-d

Chất R KLPT Thể chất Màu kết tinh lại Dung môi H%

3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kiểm tra độ tinh khiết

Giá trị R f và nhiệt độ nóng chảy (t o

nc ) của các dẫn chất 4a-h

Chất R Thể chất kết tinh lại Dung môi

R f (DCM:MeOH:AcOH

Kiểm tra độ tinh khiết

Giá trị R f và nhiệt độ nóng chảy (t o

nc ) của các dẫn chất 8a-d, 10a-d

Chất R Thể chất kết tinh lại Dung môi

R f (DCM:MeOH:AcOH

3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

- Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro.

1 Nghiên cứu docking

(CH2)

Phổ IR của dẫn chất 8a

Khẳng định cấu trúc - Phổ 1H-NMR

Phân tích phổ 1 H-NMR của các dẫn chất 4a-h, 8a-d, 10a-d

Peak tương ứng số proton với độ dịch chuyển và độ bội

của tín hiệu phù hợp với công thức dự kiến

3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

6-F 6-Cl

1,50 0,61

HDAC (Hela)

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

Liên quan cấu trúc – tác dụng ức chế HDAC của dãy dẫn chất 4

Thử tác dụng sinh học - Thử tác dụng ức chế HDAC

R = 6,7-(OCH 3 ) 2 ↑

R = 6 -F ↓

R = 6-Cl > R = 6-F

HDAC (Hela)

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

HDAC (Hela)

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

6-CH 3 7-F

0,09 0,17

3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

- Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro.

1 Nghiên cứu docking

Thử tác dụng sinh học - Thử hoạt tính kháng TB ung thư

Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất 4a-h

39

HDAC (IC50, M)

Độc tính tế bào (IC50, M) trên từng

Thử tác dụng sinh học - Thử hoạt tính kháng TB ung thư

Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất 8a-d

HDAC (IC50, M)

Độc tính tế bào (IC50, M) trên từng

Thử tác dụng sinh học - Thử hoạt tính kháng TB ung thư

Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất 10a-d

41

HDAC (IC50, M)

Độc tính tế bào (IC50, M) trên từng

Thử tác dụng sinh học - Thử hoạt tính kháng TB ung thư

0 0.5

1 1.5

2 2.5

3 3.5

Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất 10a-d và SAHA

trên các dòng tế bào SW620, PC-3 và NCI-H23

Độc tính tế bào các dẫn chất 10a-d đều lớn hơn SAHA từ 2-4 lần

Thử tác dụng sinh học - Thử hoạt tính kháng TB ung thư

43

So sánh tác dụng gây độc tế bào của 3 dãy dẫn chất 4, 8, 10

trên các dòng tế bào SW620, PC-3 và NCI-H23

- So sánh dãy 4 và dãy 8: dãy 8 > dãy 4

Þ vòng Quinazolin-4(3H)-on gắn nhóm thế 2’-CH3 có lợi cho hoạt tính

- So sánh dãy 4 và dãy 10: dãy 10 > dãy 4

Þ cầu nối propenamid tối ưu hơn cầu nối benzamid

Về thiết kế và sàng lọc dẫn chất tiềm năng

 Đã thiết kế và sàng lọc được 16 dẫn chất tiềm năng

4 KẾT LUẬN

Về hoạt tính sinh học.

 Tác dụng ức chế HDAC:

- Cả 16 dẫn chất đều có tác dụng ức chế HDAC

- Trong đó dãy dẫn chất 10a-d có tác dụng ức chế tốt nhất.

 Tác dụng kháng tế bào ung thư:

- Cả 16 dẫn chất đều có tiềm năng kháng 3 dòng tế bào ung thư (SW620, PC-3 và NCI-H23)

- Một số dẫn chất (4e, 8b-c, 10b-d) có độc tính tế bào tốt hơn chất

chứng dương SAHA tới 4 lần

45

EM XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN CÁC THẦY CÔ

47

Hoạt động của enzym HDAC và HAT

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

4 9

Cấu trúc trung tâm hoạt động enzym HDAC

Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC

Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC

Tham gia nhận diện

bề mặt amino acid của enzym

Tương tác với kênh, giúp cơ chất

cố định trong kênh enzym

Tương tác với

Zn2+ tại trung tâm hoạt động của HDAC

5 1

Phân loại các chất ức chế HDAC

Các thuốc mới được FDA phê duyệt

Panobinostat (2015)

Belinostat (2014)

số dao động của một phần trong phân tử mẫu [6]

[6] Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phương pháp phổ ứng dụng trong hóa học, NXB Khoa học và Kỹ thuật.

- Tín hiệu tương ứng với các ion được thể hiện bằng một số vạch

có cường độ khác nhau, tập hợp lại gọi là phổ đồ [7]

Chế độ đo phổ MS

ESI (ElectroSpray Ionization) là thuật ngữ chỉ phương pháp ion hóa mẫu bằng phương pháp phun chùm ion trong dung dịch tạo thành đám sương mù với các giọt nhỏ dễ bay hơi.

+ Nguồn ion hóa là điện trường, ion trong dung dịch

+ Áp suất buồng mẫu: áp suất khí quyển

Positive/Negative khác nhau ở cách ion hóa của nguồn

+ Positive phù hợp pH thấp

+ Negative phù hợp pH cao

Nguyên tắc đo phổ NMR

NGUYÊN TẮC:

- Dựa vào hiện tượng cộng hưởng: Nếu một hạt nhân có momen từ được đặt

trong từ trường, khi từ trường thay đổi, hạt nhân sẽ hấp thụ năng lượng của sóng điện từ truyền qua nếu năng lượng của nó bằng đúng hiệu hai mức năng lượng của hạt nhân.

- Nguyên tắc đo: người ta cho mẫu hòa tan trong dung môi thích hợp vào cuộn

dây có dòng điện xoay chiều tạo ra từ trường có tần số ν, đặt trong một từ trường

H

(ν cố định, H thay đổi).

Người ta phát hiện cộng hưởng bằng ampe kế nhạy => phổ NMR [6].

CƠ CHẾ PHẢN ỨNG ALKYL

HÓA

Trạng thái chuyển tiếp

Cơ chế phản ứng

SN2

CƠ CHẾ PHẢN ỨNG TẠO ACID HYDROXAMIC

59

Cơ chế phản ứng

PHẢN ỨNG TẠO

2-METHYLQUINAZOILN-4(3H)-ON

Cơ chế phản ứng

Phân biệt đồng phân cis - trans

Dựa vào J

+ Jcis = 10 Hz (6-14)

+ J trans = 17 Hz (11-18)

Tuy nhiên phổ này không phổ biến vì hàm lượng của nó

trong tự nhiên rất nghèo nàn so với H => độ nhạy kém hơn

Nó được dùng trong các trường hợp kiểm tra độ nhạy của

quá trình làm giàu D

Phản ứng alkyl hóa

- Phản ứng alkyl hóa là quá trình thay thế một hoặc nhiều

nguyên tử H của hợp chất hữu cơ bằng một hoặc nhiều nhóm alkyl [9]

- Các yếu tố ảnh hưởng:

+ Nhiệt độ: cần nhiệt độ cao

+ Tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng

+ Phản ứng thực hiện trong pha lỏng => không chịu ảnh hưởng của áp suất

Vai trò của KI

- Do I có bán kính nguyên tử lớn hơn Br, đồng thời có độ âm điện thấp hơn Br

Þ Liên kết C-I dễ đứt hơn liên kết C-Br

Þ KI cho vào để giảm năng lượng hoạt hóa, làm nhóm đi ra dễ dàng hơn

Phản ứng dễ xảy ra hơn

Nhóm đẳng cấu điện tử - Đẳng cấu sinh học [5]

Đẳng cấu sinh học: là nhóm thỏa mãn định nghĩa nhóm đẳng cấu

điện tử theo nghĩa rộng nhất và cho cùng một loại hoạt tính sinh họcHiện nay, ĐCSH là những nhóm, chất có tính chất vật lý hóa học

tương tự nhau và có một loại hoạt tính tương tự nhau hoặc có vai trò quyết định tạo ra một loại hoạt tính sinh học tương tự nhau

Đẳng cấu điện tử là các nguyên tử hoặc nhóm nguyên tử (ion hay

phân tử) mà lớp điện tử ngoài cùng có thể coi là giống nhau

Một số định nghĩa còn bổ sung là những nhóm ĐCĐT là những

nhóm có cùng số điện tử π

[5] GS.TS Nguyễn Hải Nam (2010), “Nghiên cứu phát triển thuốc mới’’.

Docking?

- Docking là phương pháp để dự đoán sự định hướng tốt nhất của một

phân tử này với phân tử khác để khi gắn lại thì chúng sẽ tạo thành một phức hợp ổn định

- Sự hiểu biết về các định hướng tốt nhất đó còn có thể sử dụng để dự

đoán độ lớn liên kết hay ái lực liên kết giữa hai phân tử bằng cách sử dụng các trường lực.

- Trọng tâm của docking phân tử là mô phỏng có tính toán quá trình tương tác giữa các phân tử Mục đích cuối cùng của nó là đạt được cấu hình tối

ưu hóa cho cả protein, phối tử (ligand) và sự định hướng tương đối giữa protein và phối tử sao cho năng lượng tự do của cả hệ thống là cực tiểu.

Tại sao thử trên HDAC-2

Chúng tôi lựa chọn HDAC-2 bởi vì

+ Hoạt động deacetyl hóa một số các “key” protein histon được quy định bởi HDAC-2 và HDAC-3

Điều này đã được chứng minh qua nghiên cứu rõ ràng [8]

+ Hơn nữa, HDAC-2 còn có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy chu trình tế bào và ức chế chết theo chương trình của tế bào

[8] Pelzel H.R., Schlamp C.L., Nickells R.W (2010) “Histone H4 deacetylation plays a critical role in early gene silencing during neuronal

apoptosis”, BMC Neuroscience 11, pp 62

IC50?

để gây ra 50% tác dụng ức chế trong phép thử in vitro

- FDA:

“IC represents the concentration of a drug that is required for 50% inhibition in vitro’’

Nhiệt độ sôi của một số dung môi thông thường

Chất chưa được công bố trong bất kỳ tài liệu nào?

- Bộ môn đã nhờ sử dụng ChemFinder, một database cập nhật các chất mới trên thế giới để xác định

- Một số khung chất bộ môn đã đăng ký bản quyền

Thử tác dụng ức chế HDAC

+ Bước 1: Enzym HDAC được ủ với các dẫn chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau ở 37oC trong 30 phút với sự có mặt của cơ chất HDAC có gắn huỳnh quang Thí nghiệm được tiến hành 2 lần

+ Bước 2: Thêm 50 µL HDAC assay developer (tạo chất phát huỳnh

quang trong hỗn hợp phản ứng) (2x) vào mỗi lô Để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

+ Bước 3: Đọc kết quả độ hấp thụ trên máy đo hấp thụ huỳnh quang, tại bước sóng kích thích 350-360 nm và bước sóng phát quang 440-460

nm (độ hấp thụ được đo 2 lần ở mỗi bước sóng)

- Kết quả độ hấp thụ được đưa vào phần mềm excel tính toán thu được phần trăm trung bình mẫu thử gắn với HDAC Phần trăm này chuyển sang phần mềm GraphPad prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) để tính toán IC50 Độ lệch chuẩn tương đối không quá 10%

Thử tác dụng kháng TB ung thư

- Dựa trên khả năng gắn của thuốc nhuộm với các acid amin cơ bản của protein trong tế bào, sử dụng phương pháp đo màu để tính

tổng lượng protein, từ đó suy ra số lượng tế bào

- Giá trị IC50 là nồng độ mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy), kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với

độ khác nhau không quá 5%

Dòng TB HeLa

- Tế bào HeLa là một loại tế bào thuộc dòng tế bào bất tử, được

phân lập từ tế bào ung thư cổ tử cung ngày 8 tháng 2 năm 1951 từ Henrietta Lacks, bệnh nhân đã qua đời vì ung thư vào ngày 4 tháng

10 năm 1951

- Dòng tế bào HeLa rất ổn định và tăng sinh mạnh

- là dòng tế bào “bất tử” theo nghĩa là chúng có thể phân chia

không giới hạn trong quá trình nuôi cấy tế bào trong phòng thí

nghiệm khi đảm bảo điều kiện cơ bản cho tế bào sống (tức là duy trì ổn định trong môi trường nuôi phù hợp)

- Các tế bào này tăng sinh nhanh chóng lạ thường thậm chí khi so sánh với các dòng tế bào ung thư khác Cũng giống như các dòng

tế bào ung thư khác, tế bào HeLa có một dạng hoạt động của

enzym telomerase trong quá trình phân chia tế bào, điều đó ngăn chặn việc bị làm ngắn lại của đầu telomere mà đó là nguyên nhân gây ra quá trình lão hóa và cuối cùng là chết tế bào Bằng cách

này, các tế bào ung thư tránh được giới hạn Hayflick, là điểm giới hạn số lần tế bào phân chia mà hầu hết tế bào trải qua trước khi trở nên lão hóa.

Tác dụng của các chất ức chế HDAC (HDACi)

Vai trò của HDAC và HDACi