Trong những năm gần đây, cùng những thành tựu mang tính đột phá trong lĩnh vực sinh học thì hiểu biết về chức năng và hoạt động của cơ thể sống ở mức độ tế bào, mức độ phân tử ngày càng được làm rõ. Các thuốc chống ung thư mới ra đời hầu hết đều bắt nguồn từ mục tiêu phân tử nhằm tăng hiệu quả điều trị và giảm độc tính so với các phương pháp cổ điển như hóa trị hay xạ trị. Một số đích tác dụng mà các thuốc chống ung thư hiện nay đang hướng đến như các protein kinase, protein gây ung thư Bcl2, HAT, HDAC… trong đó đích HDAC đang mở ra nhiều triển vọng. Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự huy động quá mức các HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quá trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thư 15, 23. Hiện nay, trong các chất ức chế HDAC được tổng hợp và công bố, nhóm các dẫn chất của acid hydroxamic có hoạt tính khá tốt trong đó điển hình là SAHA (Zolinza®) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên được FDA cấp phép lưu hành năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL) 6. Sau đó là belinostat (Beleodaq®), gần đây nhất panobinostat (Farydax®) cũng được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị một số bệnh ung thư.Theo hướng tiếp cận này, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất dẫn xuất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt 1, 30, 31. Một số bài báo gần đây của nhóm nghiên cứu đã cho kết quả rất khả quan khi sử dụng khung benzothiazol hoặc khung 5aryl1,3,4thiadiazol thay cho vòng phenyl trong cấu trúc của SAHA để làm nhóm khóa hoạt động. Nhiều chất đã thể hiện tác dụng ức chế HDAC tốt hơn SAHA từ vài lần đến vài chục lần 31, 32.Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Tổng hợp một số Nhydroxybutanamidpentanamid mang khung 1(triazol4yl)methylindolin2on hướng tác dụng kháng ung thư” với hai mục tiêu: 1. Tổng hợp Nhydroxy4(4((3(hydroxyimino)2oxoindolin1yl)methyl)1H1,2,3triazol1yl)butanamid và 4 dẫn chất.2. Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp được.Histon có hai dạng tồn tại là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa được chuyển hóa qua nhau nhờ 2 enzym là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC). Ở dạng acetyl hóa dưới xúc tác của HAT, điện tích dương nhóm εNH2 của lysin ở đầu N của histon bị trung hòa, NST được tháo xoắn, quá trình phiên mã được xảy ra 16. Ngược lại, ở dạng deacetyl hóa dưới tác dụng của HDAC, histon tích điện dương lớn ở đầu N, tương tác mạnh với ADN, đóng xoắn NST, ngăn cản quá trình phiên mã 15 (xem hình 1.1). 1.1.2. Phân loại các HDACHiện nay, các nhà khoa học đã xác định được 18 loại HDAC có mặt ở con người và chúng được chia thành 4 nhóm 7, 8, 29: Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8. Nhóm II: HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC9, HDAC10. Nhóm III: Sirtuin 17. Nhóm IV: HDAC11.
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - DƯƠNG TIẾN ANH MÃ SINH VIÊN: 1201010 TỔNG HỢP MỘT SỐ N-HYDROXYBUTANAMID/PENTANAMID MANG KHUNG 1-(TRIAZOL-4-YL) METHYLINDOLIN-2-ON HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - DƯƠNG TIẾN ANH MÃ SINH VIÊN: 1201010 TỔNG HỢP MỘT SỐ N-HYDROXYBUTANAMID/PENTANAMID MANG KHUNG 1-(TRIAZOL-4-YL) METHYLINDOLIN-2-ON HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: NCS Đỗ Thị Mai Dung PGS.TS Phan Thị Phương Dung Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày nội dung phần thuộc đề tài mình, tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến người suốt thời gian qua hỗ trợ động viên tơi hồn thành cách tốt khóa luận tốt nghiệp Trước tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với người thầy, người đáng kính tơi: GS.TS Nguyễn Hải Nam, PGS.TS Phan Thị Phương Dung, DS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ mơn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội Thầy cô không tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận mà ln có dẫn xác, kịp thời động viên tơi lúc khó khăn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược Đại học quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực khóa luận Cuối cùng, tơi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị, bạn nhóm nghiên cứu mơn Hóa Dược, đặc biệt anh Lê Văn Cường, anh Lê Xuân Thiện, em Lê Công Trực, Cao Việt Phương, Phạm Nguyễn Khánh Linh bạn Đào An chia sẻ buồn vui, giúp đỡ khích lệ tơi suốt trình nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2016 Sinh viên Dương Tiến Anh MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 1.1.1 Khái niệm histon deacetylase (HDAC) 1.1.2 Phân loại HDAC 1.1.3 Cấu trúc enzym HDAC chế deacetyl hóa 1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 1.2.1 Phân loại chất ức chế HDAC 1.2.2 Cấu trúc chất ức chế HDAC 1.2.3 Liên quan cấu trúc tác dụng chất ức chế HDAC 1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TRONG TỔNG HƠP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 1.3.1 Thay đổi nhóm khóa hoạt động 1.3.2 Thay đổi cầu nối 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC VÀ 11 12 HÓA HỌC CLICK 1.4.1 Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic 12 1.4.2 Hóa học Click 14 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ 17 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 17 2.1.1 Hóa chất 17 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 17 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Tổng hợp hóa học 18 2.2.2 Thử tác dụng sinh học dẫn chất tổng hợp 18 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1 Tổng hợp hóa học 18 2.3.2 Thử tác dụng sinh học 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 HÓA HỌC 21 21 3.1.1 Tổng hợp hóa học 21 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 34 3.1.3 Xác định cấu trúc 35 3.2 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 40 3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC 40 3.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 41 3.3 BÀN LUẬN 42 3.3.1 Tổng hợp hóa học 42 3.3.2 Khẳng định cấu trúc 45 3.3.3 Thử hoạt tính sinh học 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 60 DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT 13 C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (Carbon-13 nuclear magnetic resonance) H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton nuclear magnetic resonance) A549 : Dòng tế bào ung thư phổi người AcOH : Acid acetic ADN : Acid desoxyribonucleic AsPC-1 : Dòng tế bào ung thư tuyến tụy người CU : Nhóm liên kết (Connecting unit) d : Vạch đôi phổ NMR (Doublet) DCM : Dicloromethan dd : Vạch chẻ đôi lần phổ NMR (Doublet of doublet) DMF : Dimethylformamid DMSO : Dimethylsulfoxid DMSO-d6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa ESI : Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization) FBS : Huyết bào thai bò (Fetal bovine serum) FDA : Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ (U.S Food and Drug Administration) H (%) : Hiệu suất HAT : Histon acetyltransferase HCT116 : Dòng tế bào ung thư ruột kết người HDAC : Histon deacetylase HDACi : Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors) HepG2 : Dòng tế bào ung thư gan người IC50 : Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration) IR : Hồng ngoại (Infrared) J : Hằng số ghép cặp phổ NMR KRIBB : Viện nghiên cứu Sinh học Công nghệ sinh học Hàn Quốc (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) m : Đa vạch phổ NMR (Multiplet) MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol MS : Phổ khối lượng (Mass spectrometry) NAD+ : Nicotinamid adenin dinucleotid NST : Nhiễm sắc thể PC-3 : Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người Rf : Hệ số lưu giữ TLC s : Vạch đơn phổ NMR (Singlet) SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic SRG : Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group) SW620 : Dòng tế bào ung thư đại tràng người t : Vạch ba phổ NMR (Triplet) tºnc : Nhiệt độ nóng chảy THF : Tetrahydrofuran TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) TMS : Tetramethylsilan TSA : Trichostatin A UV : Tử ngoại (Ultraviolet) ZBG : Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group) δ (ppm) : Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) phổ NMR ν : Dao động hóa trị phổ IR DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Chỉ số lý hóa hiệu suất tổng hợp acid hydroxamic từ ester 33 Bảng 3.2 Giá trị Rf nhiệt độ nóng chảy (tonc) dẫn chất VIa-d, X 34 Bảng 3.3 Kết phân tích phổ IR dẫn chất VIa-d, X 35 Bảng 3.4 Kết phân tích phổ MS dẫn chất VIa-d, X 36 Bảng 3.5 Kết phân tích phổ 1H-NMR dẫn chất VIa-d, X 37 Bảng 3.6 Kết phân tích phổ 13C-NMR dẫn chất VIa-d, X 39 Bảng 3.7 Kết thử tác dụng ức chế HDAC dẫn chất VIa-d, X 40 Bảng 3.8 Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thư dẫn chất VIa-d, X 41 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1 Cấu trúc nucleosom vai trị HAT, HDAC Hình 1.2 Bảng phân loại HDAC Hình 1.3 Phức hợp HDAC-8 acid hydroxamic Hình 1.4 Phân loại chất ức chế HDAC Hình 1.5 Cấu trúc SAHA tương ứng với cấu trúc chung chất ức chế HDAC Hình 1.6 Cấu trúc apicidin azumamid E Hình 1.7 Cấu trúc chung acid hydroxamic mang khung benzothiazol Hình 1.8 Cấu trúc chung chất nghiên cứu Feng T 10 Hình 1.9 Cấu trúc chung chất nghiên cứu Zhang Z 11 Hình 1.10 Cấu trúc chung số dẫn chất mang khung 2-oxoindolin 11 Hình 1.11 Cấu trúc HPOB nghiên cứu Lee J.H cộng 11 Hình 3.1 Phổ khối lượng MS dẫn chất VIb 47 Hình 3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất VIc (giãn rộng) 49 Hình 3.3 Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào dẫn chất VIc-d 51 dòng tế bào SW620, PC-3 AsPC-1 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 1.1 Tổng hợp số dẫn chất amid ngược SAHA 12 Sơ đồ 1.2 Tổng hợp acid phenylthiazol hydroxamic 13 Sơ đồ 1.3 Phản ứng đóng vịng 1,3-lưỡng cực alkyn azid với xúc tác 14 Cu(I) (CuAAC) Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung 21 Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II 22 Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất VIII 22 Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp chất IVa 23 Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất Va 24 Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIa 25 Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIb 26 Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIc 28 Sơ đồ 3.9 Quy trình tổng hợp dẫn chất VId 30 Sơ đồ 3.10 Quy trình tổng hợp dẫn chất X 32 Sơ đồ 3.11 Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-d 43 Sơ đồ 3.12 Cơ chế phản ứng Click dùng xúc tác Cu(I) 44 Sơ đồ 3.13 Cơ chế phản ứng tạo thành VIa-d, X 45 Chú thích: 48G = VId Phụ lục 14 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR VId (phổ giãn rộng) Chú thích: 49G = X Phụ lục 15 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR X Chú thích: 49G = X Phụ lục 15 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR X (phổ giãn rộng) Chú thích 4C = VIa Phụ lục 16 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIa Chú thích: 4C = VIa Phụ lục 16 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIa (phổ giãn rộng) Chú thích: 48B = VIb Phụ lục 17 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIb Chú thích: 48B = VIb Phụ lục 17 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIb (phổ giãn rộng) Chú thích: 47D = VIc Phụ lục 18 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIc Chú thích: 47D = VIc Phụ lục 18 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VIc (phổ giãn rộng) Chú thích: 48G = VId Phụ lục 19 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VId Chú thích: 48G = VId Phụ lục 19 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR VId (phổ giãn rộng) Chú thích: 49G = X Phụ lục 20 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR X Chú thích: 49G = X Phụ lục 20 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR X (phổ giãn rộng) Phụ lục 21 Kết hoạt tính ức chế HDAC-2 độc tính tế bào Phụ lục 21 Kết hoạt tính ức chế HDAC-2 độc tính tế bào ... chất vừa tổng hợp 2.2.2 Thử tác dụng sinh học dẫn chất tổng hợp - Thử tác dụng ức chế HDAC - Thử độc tính số tế bào ung thư: ung thư đại tràng (SW620), ung thư tuyến tụy (AsPC-1), ung thư biểu... 1201010 TỔNG HỢP MỘT SỐ N-HYDROXYBUTANAMID/PENTANAMID MANG KHUNG 1-(TRIAZOL-4-YL) METHYLINDOLIN-2-ON HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: NCS Đỗ Thị Mai Dung... bị, dụng cụ 17 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Tổng hợp hóa học 18 2.2.2 Thử tác dụng sinh học dẫn chất tổng hợp 18 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1 Tổng hợp hóa học 18 2.3.2 Thử tác dụng