Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 3 oxim isatin hướng tác dụng kháng ung thư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MƠ TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-OXIM-ISATIN HƢỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MƠ TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-OXIM-ISATIN HƢỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Phan Thị Phƣơng Dung PGS.TS Nguyễn Hải Nam HÀ NỘI 2013 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình tổng hợp hồn thành luận văn tơi nhận đƣợc nhiều giúp đỡ thầy cô giáo, gia đình, bạn bè đồng nghiệp Đầu tiên, tơi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Phan Thị Phƣơng Dung, PGS.TS Nguyễn Hải Nam, thầy cô tận tâm hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho q trình làm nghiên cứu Bộ Mơn Hóa Dƣợc – Trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn tồn thể thày giáo, anh chị kỹ thuật viên, bạn sinh viên nhóm nghiên cứu Hóa Dƣợc – Bộ Mơn Hóa Dƣợc – Trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ thời gian làm tổng hợp hóa học Trong thời gian thực luận văn, nhận đƣợc giúp đỡ đơn vị, cá nhân ngồi trƣờng Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị Khoa hóa học – Trƣờng đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học – Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, Viện Hóa hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Trƣờng đại học quốc gia Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc) Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới chồng, gia đình, bạn bè đồng nghiệp bên cạnh động viên tôi, họ động lực giúp tơi phấn đấu hồn thành luận văn Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu mà ngƣời dành cho Hà Nội ngày 12 tháng năm 2013 Nguyễn Thị Mơ MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG DANH MỤC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Histon deacetylase 1.1.1 Khái niệm HDAC 1.1.2 Phân loại HDAC 1.1.3 Cấu tạo HDAC 1.1.4 HDAC ung thƣ 1.2 Các chất ức chế histon deacetylase 10 1.2.1 Phân loại chất ức chế HDAC 10 1.2.2 Cơ chế tác dụng chất ức chế HDAC 16 1.2.3 Liên quan cấu trúc tác dụng chất ức chế HDAC 16 1.3 Các phƣơng pháp tổng hợp acid hydroxamic 18 1.3.1 Tổng hợp acid hydroxamic từ ester 18 1.3.2 Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic 19 1.4 Các chất ức chế HDAC nhóm nghiên cứu mơn Hóa Dƣợc, đại học Dƣợc Hà Nội thiết kế nghiên cứu 19 CHƢƠNG - NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên liệu 21 2.2 Thiết bị dụng cụ 21 2.3 Nội dung nghiên cứu 21 2.3.1 Tổng hợp hóa học 22 2.3.2 Thử tác dụng sinh học chất tổng hợp đƣợc 22 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Phƣơng pháp tổng hợp hóa học 22 2.4.2 Phƣơng pháp kiểm tra độ tinh khiết khẳng định cấu trúc 22 2.4.3 Phƣơng pháp thử tác dụng sinh học 23 2.4.4 Kiểm chứng tác dụng thuốc thông qua docking chất đại diện 25 2.4.5 Đánh giá mức độ giống thuốc chất tổng hợp đƣợc 26 CHƢƠNG - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Tổng hợp hóa học 27 3.1.1 Tổng hợp ester trung gian 1a-g 27 3.1.2 Tổng hợp acid hydroxamic 2a-g 30 3.2 Kiểm tra độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc 33 3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết 33 3.2.2 Khẳng định cấu trúc 34 3.3 Kết thử hoạt tính sinh học 39 3.3.1 Kết thử tác dụng ức chế HDAC 39 3.3.2 Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro 39 3.4 Kết docking 40 3.5 Đánh giá mức độ giống thuốc chất tổng hợp đƣợc 41 CHƢƠNG - BÀN LUẬN 42 4.1 Hóa học 42 4.1.1 Phản ứng tổng hợp ester trung gian 1a-g 42 4.1.1 Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic 2a-g 42 4.2 Khẳng định cấu trúc 43 4.2.1 Phổ hồng ngoại 43 4.2.2 Phổ khối 44 4.2.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 46 4.3 Hoạt tính sinh học 50 4.3.1 Tác dụng ức chế HDAC 50 4.3.2 Tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 56 Kết luận 56 1.1 Về tổng hợp hóa học khẳng định cấu trúc 56 1.2 Về hoạt tính sinh học 56 Đề xuất 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC PHỤ LỤC CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT  (ppm) : Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) ADN : Acid desoxyribonucleic ALL : Bệnh ung thƣ nguyên bào lympho cấp tính AML : Bệnh ung thƣ bạch cầu dạng tủy cấp tính APL : Bệnh ung thƣ bạch cầu tủy bào cấp tính AsPC-1 : Dòng tế bào ung thƣ tụy ngƣời CDI : Carbonyldiimidazol CLL : Bệnh lympho mãn tính (Chronic lymphocytic leukemia) CTCL : Tế bào lymphoT dƣới da (Cutaneous T cell lymphoma) CTPT : Công thức phân tử 13 : Cộng hƣởng từ hạt nhân 13C C-NMR DCM : Dicloromethan DMF : Dimethyl formamid DMSO : Dimethyl sulfoxid FDA : Cục quản lý thuốc thực phẩm Mỹ (Food and Drug Administration) EtOH : Ethanol HAT : Histon acetyltranferase HDAC : Histon deacetylase HDIs : Các chất ức chế HDAC (histon deacetylase inhibition) : Cộng hƣởng từ hạt nhân 1H H-NMR IC50 : Nồng độ ức chế hoạt độ tế bào xuống nửa IR : Phổ tử ngoại J : Hằng số tƣơng tác (Hz) MCF-7 : Tế bào ung thƣ vú ngƣời MeOH : Methanol MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid MS : Phổ khối lƣợng NCI-H460 : Tế bào ung thƣ phổi ngƣời NSCLC : Ung thƣ phổi tế bào không nhỏ (Non-smali lung cell) NST : Nhiễm sắc thể PC-3 : Tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến ngƣời SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic T0nc : Nhiệt độ nóng chảy TLC : Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng TMS : Tetramethylsilan TSA : Trichostatin A SW620 : Tế bào ung thƣ đại tràng ngƣời DANH MỤC HÌNH VẼ Tên hình Trang Hình 1.1: Cấu trúc histon nucleosom Hình 1.2: Vai trị cân động HDAC & HAT với phiên mã (DMMTs – DNA methyl transferase, HMT – Histon methyltransferase, hình trịn: nhóm methyl, hình tam giác: nhóm acetyl, hình vng: nhóm methyl histon) Hình 1.3: Phân loại HDAC ngƣời Hình 1.4: Cấu tạo trung tâm hoạt động HDAC Hình 1.5: Vùng ion K+ HDAC8 Hình 1.6: Vai trị sinh học HDAC tế bào ung thƣ 10 Hình 1.7: Một số chất ức chế HDAC thử nghiệm lâm sàng 12 Hình 1.8: HDIs có cấu trúc peptid vịng 13 Hình 1.9: HDIs benzamid 13 Hình 1.10: HDIs acid béo mạch ngắn 14 Hình 1.11: HDIs có cấu trúc Hydroxamat 15 Hình 1.12: HDIs dẫn chất ceton 16 Hình 1.13: Cơ chế tác dụng tế bào chất ức chế HDAC 16 Hình 1.14: Cơ chế tác dụng tế bào chất ức chế HDAC 17 Hình 1.15: Cấu trúc chung số dãy chất nghiên cứu cơng bố 18 Hình 1.16: Liên quan cấu trúc – tác dụng chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic 20 Hình 3.1: Kết docking chất 2a SAHA với HDAC8 40 Hình 3.2: Kết docking chất 2a N-(2-aminophenyl)benzamid với HDAC2 Hình 4.1: 41 Phổ hồng ngoại chất 2g 44 Hình 4.2: Phổ khối lƣợng chất 2c 45 Hình 4.3: Phổ 1H-NMR chất 2f 47 Hình 4.4: Phổ 1H-NMR dãn rộng chất 2e 48 Hình 4.5: Phổ 13C-NMR dãn rộng chất 2f 49 Hình 4.6: Kết phân tích Western Blot chất 2a-g 50 Hình 4.7: Biểu đồ so sánh tác dụng kháng tế bào SW620 MCF-7 chất 2a-g so với SAHA Hình 4.8: 52 Biểu đồ so sánh tác dụng kháng tế bào AsPC-1 chất 2a-g so với SAHA 53 DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC thử nghiệm lâm sàng 12 Bảng 3.1: Giá trị Rf Tonc acid hydroxamic 2a-g 34 Bảng 3.2: Số liệu phân tích phổ IR acid hydroxamic 2a-g 35 Bảng 3.3: Số liệu phân tích phổ MS acid hydroxamic 2a-g 36 Bảng 3.4: Số liệu phân tích phổ 1H-NMR acid hydroxamic 2a-g 37 Bảng 3.5: Số liệu phân tích phổ 13C-NMR acid hydroxamic 2a-g 38 Bảng 3.6: Đánh giá mức độ giống thuốc chất 2a-g theo qui tắc Lipinsky 41 Bảng 4.1: Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro chất 2a-g 51 Phụ lục 2d-3: phổ 1H-NMR chất 2d Phụ lục 2d-4: phổ 13C-NMR chất 2d BO M ON HOA VAT LIEU-KHOA HOA-TRUONG DHKHTN Ten may: GX-PerkinElmer-USA Resolution: 4cm-1 Date: 10/15/2012 Nguoi do: Phan Thi Tuyet M Ten mau: 5e 85.7 80 75 70 613 65 873 1386 60 714 843 55 1558 1269 956 50 913 494 751 481 1105 45 %T 1282 1159 1453 40 1131 1747 2858 3307 35 1474 1039 1194 2936 1072 1509 30 1729 25 1630 20 15 1334 1611 10 0.0 4000.0 3600 3200 Analysis name: P2c.d Method: DEF – LCMS.m Sample Name: P2c Analysis Info: P2c 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 cm-1 Display – Report – All Windows Selected Analysis Intrument: LC – MSD – TRAP_SL Operator: Manager Phụ lục 2e-1: phổ IR chất 2e 800 600 400.0 Print Date: 9/10/2012 3:38:42 PM Acq Date: 9/10/2012 3:35:31 PM Phụ lục 2e-2: phổ MS chất 2e Phụ lục 2e-3: phổ 1H-NMR chất 2e Phụ lục 2e-4: phổ 13C-NMR chất 2e BO M ON HOA VAT LIEU-KHOA HOA-TRUONG DHKHTN Ten may: GX-PerkinElmer-USA Resolution: 4cm-1 Date: 11/9/2012 Nguoi do: Phan Thi Tuyet M Ten mau: 5F 100.4 95 90 85 80 75 70 65 60 1288 %T 55 50 3039 1210 45 1172 40 929 893 2929 2862 1360 730 1118 622 35 1017 3304 1048 809 998 30 1476 25 1699 1618 1084 1650 20 15 10.0 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 Phụ lục 2f-1: phổ IR chất 2f 1400 1200 1000 800 600.0 Phụ lục 2f-2: phổ MS chất 2f Phụ lục 2f-3: phổ 1H-NMR chất 2f Phụ lục 2f-4: phổ 13C-NMR chất 2f BO M ON HOA VAT LIEU-KHOA HOA-TRUONG DHKHTN Ten may: GX-PerkinElmer-USA Resolution: 4cm-1 Date: 11/26/2012 Ten mau: 5H Nguoi do: Phan Thi Tuyet M 92.0 85 80 75 70 714 636 65 1216 492 928 848 60 522 994 1169 55 1525 1137 3109 50 731 1122 3021 1014 797 1000 800 1184 %T 45 2930 3353 40 2862 3297 35 1467 1364 1428 30 1056 1602 25 1089 1649 20 1702 15 10 0.0 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 cm-1 Phụ lục 2g-1: phổ IR chất 2g 1200 600 400.0 Phụ lục 2g-2: phổ MS chất 2g Phụ lục 2g-3: phổ 1H-NMR chất 2g Phụ lục 2g-4: phổ 13C-NMR chất 2g ... 27 3. 1 Tổng hợp hóa học 27 3. 1.1 Tổng hợp ester trung gian 1a-g 27 3. 1.2 Tổng hợp acid hydroxamic 2a-g 30 3. 2 Kiểm tra độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc 33 3. 2.1 Kiểm tra độ tinh khiết 33 3. 2.2... 5-Cl C15H18O4N3Cl 33 9,5 33 8,5 [M-H]- 2d 5-Br C15H18O4N3Br 38 4,0 38 3,0 [M-H]- 2e 5-NO2 C15H18O6N4 35 0,0 34 9,0 [M-H]- 2f 5-CH3 C16H21O4N3 31 9,0 31 8,0 [M-H]- 2g 7-Cl C15H18O4N3Cl 33 9,5 33 8,5 [M-H]-... chế tác dụng chất ức chế HDAC 16 1.2 .3 Liên quan cấu trúc tác dụng chất ức chế HDAC 16 1 .3 Các phƣơng pháp tổng hợp acid hydroxamic 18 1 .3. 1 Tổng hợp acid hydroxamic từ ester 18 1 .3. 2 Tổng hợp acid