Tổng hợp một số dẫn chất của 5 fluoroisatin và thăm dò tác dụng sinh học

Trong lĩnh vực tổng hợp thuốc, để nhanh chóng tạo ra các thuốc mód, các nhà nghiên cứu thưòrng dựa trên cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có tác dụng dược lý,

B ộ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI

ĐỖ THỊ THANH MAI

5-FLUOROISATIN

VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ ĐẠI HỌC KHÓA 59 (2004 - 2009)

- Người hướng dẫn : TS T rần Viết Hùng

TS Đinh Thị Thanh Hải

- Nơi thực hiện : Bộ môn Hóa hữu cơ

- Thòi gian thực hiện : 02/2009 - 05/2009

T iiir A iE V

-V j o / ' t

LỜI CẢM ƠN

Sau một thă gian làm việc khẩn trương, được sự giúp đỡ tận tình của thầy

cồ giáo, gia đình và bạn bè, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp “ Tổng hợp

một số dẫn chất của 5-fluoroisatìn và thăm dỏ tác dụng sinh học”.

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy cô giáo:

TS Trần Viết Hùng

TS Đinh Thị Thanh Hải

đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian nghiên cứu thực hiện luận văn tốt nghiệp này.

Đồng thời, tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới, TS Nguyễn Thị Kiều Anh (Phòng Thí nghiệm Trung tâm - Trường Đại học Dược Hà Nội), ThS Lê Tuấn Anh (Phòng Thí nghiệm Hoá vật liệu - Khoa Hoá học - Trường ĐHKHTN - ĐHQGHN), TS Lê Mai Hương, Ths Trần Thị Như Hằng (Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam), các cán bộ phòng phân tích cấu trúc (Viện Hoá học - Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam) đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này.

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, kỹ thuật viền bộ môn Hoá hữu cơ, các thầy cô trong trường, các phòng ban, thư viện đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp này!

Tôi xin chân thành cẩm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2009

Sinh viên

Đỗ Thị Thanh Mai

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH, s ơ Đổ

ĐẶT VẤN ĐỂ 1

Phần 1:TỔNG QUAN 2

1.1 Tác dụng sinh học của dẫn chất Isatin 2

1.1.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng lao 2

1.1.2 Tác dụng kháng virus 5

1.1.3 Tác dụng chống ung thư 6

1.1.4 Tác dụng ức chế men monoaminooxydase 7

1.1.5 Các tác dụng khác .8

1.2 Các phương pháp tổng hợp ỉsatin và dẫn chất 8

1.2.1 Các phương pháp tổng hợp dị vòng isatin 8

1.2.2 Các phương pháp tổng hợp dẫn chất của isatin 11

Phần 2: Đ ố l TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 16

2.1 Nguyên liệu nguyên cứu 16

2.2 Thiết bị nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

Phần 3: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 18

3.1 Tổng hợp hoá học 18

3.1.1 Tổng hợp 5-fluoroisatin (1) 19

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất ngưng tụ của 5-fluoroisatin với 2-thioxo-4-thiazolidinon (2) 20

3.1.3 Tổng hợp một số dẫn chất base di-Mannich của 5-(2’-oxo-5’-fluoro-3 ’ -indolinyliden)-2-thioxo-4-thiazolidinon(5-(2’-oxo-5’-fluoro-3,4) 21 3.1.4 Tổng hợp một số dẫn chất base mono-Mannich của

5-(2’-oxo-5’-fluoro-3.2 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc 31

3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được 31

3.2.2 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được 31

3.3 Thử tác dụng sinh học 35

3.3.1 Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 35

3.3.2 Thử hoạt tmh gây độc tế bào (Cytotoxicity assay) 38

3.4 Bàn luận 39

3.4.1 Về tổng hợp hoá học 39

3.4.2 Về xác định cấu trúc 40

3.4.3 Về tác dụng sinh học 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

(The 50% Inhibitory concentration)

IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

MIC ; Nồng độ ức chế tối thiểu

(Minimum Inhibitory concentration)

MS : Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Hiệu suất và một số hằng số vật lý của các chất tổng hợp được 29

Bảng 3.2: Tóm tắt kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng 31

Bảng 3.3: Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ IR (em'*) của các chất tổng hợp được 32

Bảng 3.4: Số liệu phân tích phổ khối lượng của các chất tổng hợp được 33

Bảng 3.5: Số liệu phổ 'H-NMR và ‘^C-NMRcủa chất 2 35

Bảng 3.6: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 37

Bảng 3.7; Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người 39

Hình 3.1 : Sơ đồ phân mảnh của chất 1 42 Hình 3.2: Sơ đồ phân mảnh của chất 2 43 Hình 3.3: Sơ đồ phân mảnh của chất 4 44

ĐẶT VÂN ĐỂ

Từ xưa đến nay thuốc luôn chiếm một vị trí quan trọng trong vấn đề chăm sóc sức khoẻ cho con người Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và công nghệ, các thuốc sử dụng trong công tác phòng và chữa bệnh ngày càng

có nhiều nguồn gốc khác nhau, trong đó các thuốc được tạo ra bằng phương pháp tổng hợp và bán tổng hợp đóng vai trò quan trọng

Trong lĩnh vực tổng hợp thuốc, để nhanh chóng tạo ra các thuốc mód, các nhà nghiên cứu thưòrng dựa trên cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có tác dụng dược lý, có triển vọng để tạo ra các chất mới

dự đoán có tác dụng tốt hơn, ít độc tính hơn và có hiệu quả hơn trong điều trị.Isatin và dẫn chất là một dãy chất hữu cơ đã được nghiên cứu một cách có

hệ thống về hoá học cũng như về tác dụng sinh học Nhiều công trình nghiên cứu công bố đã cho thấy các dẫn chất của Isatin có hoạt tính sinh học phong phú và đa dạng vói các tác dụng như: kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, kháng virus, kháng lao, và nhiều tác dụng dược lý khác [2 - 13], [17], [18], [22], [23], [32], [34] Trong số các dẫn chất của Isatin thì các dẫn chất 5- halogenoisatin, trong đó có 5-fluoro isatin, dẫn chất base Mannich và dẫn chất ngưng tụ với 2-thioxo-4-thiazolidinon đã được chú ý nghiên cứu trong thòd gian gần đây và các kết quả nghiên cứu cho thấy chúng có hoạt tính sinh học rất đáng quan tâm Vói mong muốn góp phần nghiên cứu các dẫn chất isatin, chúng tôi thực hiện đề tài “Tổng hợp một số dẫn chất của 5-fluoroisatin và thăm dò tác dụng sinh học” với hai mục tiêu chính sau đây:

1 Tổng họp 5-fluoroisatin và các dãn chất của chúng

2 Thăm dò tác dụng sinh học (kháng khuẩn, kháng nấm và kháng các dòng tế bào ung thư người) của các chất tổng hợp được với hy vọng tìm được các chất có hoạt tính sinh học cao và có thể rút ra các nhận xét sơ

bộ về mối liên quan cấu trúc - tác dụng của dãy dẫn chất này

Chúng tôi hy vọng đề tài này là một đóng góp nhỏ vào việc nghiên cứu, tìm kiếm những chất có hoạt tính sinh học cao thuộc dãy chất Isatin

P h ầ n l TỔNG QUAN1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA DẪN CHẤT c ủ a ISATIN

Isatin và dẫn chất là một trong nhiều dãy chất hữu cơ đã được nghiên cứu

có hệ thống về mặt hoá học cũng như tác dụng sinh học Rất nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học của các dẫn chất Isatin đã cho thấy chúng có tác dụng khá phong phú và đa dạng như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng lao, kháng virus, chống phân bào, ức chế men monoamino- oxydase (MAO)

17 dẫn chất 5-iodo và 5-cloro của isatin đã được D Maysinger và cộng sự [32] tổng hợp:

N-NHR

X = I,C1 R=HC0CH3, CH3, CSNH2

X = I, Cl NRR' = NHCH 2 CH 2 OH , N(CH2CH20H)2 , N(CH(CH3)2)2

N(CH2CH2C1)2 , n o n

Thử tác dụng trên 11 chủng vi khuẩn và 2 chủng nấm, nhiều chất có tác dụng mạnh Trong số đó có các dẫn chất base Mannich diisopropylamino của dẫn chất 5-iodoisatin và 5-cloroisatin có MIC dưới 100|ag/ml Các tác giả rút

ra nhận xét là nhóm thế halogen ở vị trí 5 giữ vai trò quan trọng trong tác dụng kháng khuẩn (làm tăng tác dụng)

Các tác giả A c Padhya và cộng sự [34] cũng đã tổng hợp và thử tác dụng của một số dẫn chất nitrofurfuryliden isatin hydrazon và thấy rằng chúng

có tác dụng ức chế Staphylococcus aureus, Escherichia coli:

Kết quả cho thấy có 8 chất có tác dụng vód Escherichia coli, 4 chất có tác dụng với Staphylococcus aureus.

ở Việt Nam, Nguyễn Quang Đạt và cộng sự [3], [6] đã tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của nhiều dẫn chất isatin với các nhóm thế khác nhau ở vị trí 5 (-NO2, -Br) và các dẫn chất base Mannich, hydrazon, base Schiff:

R = NƠ 2,Br

R’ = H,CH2RiR2

R" = o , = N - A r , = N - N H - A r

Kết quả cho thấy nhiều dẫn chất có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Candida albicans, trong số đó đáng chú ý là các dẫn chất của 5-nitroisatin.

Tác giả Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt và cộng sự [7], [8] cũng đã tổng họfp và thử tác dụng sinh học của dẫn chất 5-fluoroisatin thì thấy 5-fluoro

-1-morpholinomethylisatin, 5-fluoro-l-piperinomethylisatin có tác dụng mạnh với 9 chủng vi khuẩn thử nghiệm và các base Mannich có tác dụng mạnh hơn

so với các chất cùng dãy, ngoài ra chúng còn có tác dụng vód nấm Candida

albicans.

Tiếp theo đó vào năm 2000, các tác giả trên [9] tiếp tục nghiên cứu tổng hợp thăm dò tác dụng sinh học của 5-bromo-l-morpholinomethylisatin và các dẫn chất của chúng thì thấy chúng có tác dụng mạnh với 8 chủng vi sinh vật thử nghiệm với nồng độ 1 mg/ml

Một tác dụng chống vi khuẩn được chú ý là tác dụng chống vi khuẩn lao Nhiều thuốc chống lao có hiệu quả như rimifon, streptomycin, rifampicin đã được đưa vào sử dụng Tuy nhiên, việc kháng lại các thuốc chống lao của vi khuẩn lao hiện nay đang ngày càng lớn, đặc biệt là hiện tượng kháng đa thuốc Việc tìm kiếm các chất có khả năng chống lại vi khuẩn lao trong dãy isatin cũng đã được các nhà nghiên cứu quan tâm

Năm 1976, các tác giả A B Tomchin và cộng sự [38] đã thử tác dụng

tác dụng ức chế Mycobacterium tuberculosis ở nồng độ 2|j,g/ml Đặc biệt tác

dụng tốt cả vói chủng vi khuẩn lao đã kháng rimifon và streptomycin;

N - N H —C-

II 0

N

Năm 2000, các tác giả Nguyễn Quang Đạt, Trần Viết Hùng cùng cộng sự[10] đã đi sâu nghiên cứu tác dụng kháng lao của một số dẫn chất 3-thio semicarbazon và isonicotinoylhydrazon của isatin và 5-halogenoisatin Kết quả cho thấy 12 dẫn chất có tác dụng mạnh với trực khuẩn lao (MIC: 0,2 - 50|ig/ml) và các dẫn chất thế 5-bromo có tác dụng mạnh hơn các dẫn chất không thế Trong đó chú ý nhất công thức một số chất có tác dụng với cả vi khuẩn lao đã kháng rimifon (MIC: 5|ag/ml):

N - N H —C-

lí 0

liệt Nhiều chất đã có tác dụng với virus bại liệt Trong đó N-piperidino methylisatin có tác dụng mạnh nhất:

R 3 = o , N N H C S N H 2

Nghiên cứu một số dẫn chất của isatin-3-thiosemicarbazon, p w Sadler

[36] thấy rằng N-methyl và N-ethyl có tác dụng ức chế virus sarcom rous Hai

chất này cũng đã được tác giả thử tác dụng trên mô nuôi cấy, trên súc vật và trên lâm sàng

Về cơ chế tác dụng chống virus của các dẫn chất isatin chưa được nghiên cứu nhiều, song một số tác giả đã phát hiện ra cơ chế tác dụng của Isatin-3- thiosemicarbazon là ức chế việc tổng hợp ADN của virus

1.1.3 Tác dụng chống ung thư

Việc tìm kiếm các chất tổng hợp có tác dụng chống ung thư được các nhà nghiên cứu chú ý nhằm tìm ra các hoá dược có tác dụng điều trị căn bệnh đang có chiều hướng gia tăng này Nhiều dẫn chất của isatin, đặc biệt là các dẫn chất base Mannich cho thấy có tác dụng chống phân bào, chống khối u.Nhà nghiên cứu người Hoa Kỳ, F D Pop [35] đã tổng hợp và công bố tác dụng chống khối u của các dẫn chất 3-(o-nitrophenyl)hydrazon isatin Các

chất này kìm hãm sự phát triển của Carcinosarcoma walker 256:

^ N -N H -C 0 C H 3

Năm trong số các dẫn chất 5-(2-oxo-3-indolinyliden)thiazolidin-2,4-dion- 1,3-di-Mannich được N H Eshba và H M Salama [18] tổng hợp và được thử tác dụng trên tế bào bạch huyết P388 của chuột Trong số các chất này thì dẫn chất có nhóm thế dimethylaminomethyl ở vị trí 3 của nhân thiazolidindion có hoạt tính chống ung thư cao nhất Kết quả thử cũng cho thấy thế brom vào vị trí 5 của nhân isatin làm tăng hoạt tính chống ung thư

N -C H 2—NR1R2

I

CH2—NR1R2

Tại Việt Nam, Nguyễn Quang Đạt và cộng sự [2] đã tổng hợp và thử tác

dụng chống phân bào trên mô phân sinh của rễ cây Raphanus satỉvus L của

một số dẫn chất hydrazon, base Mannich của 5-bromoisatin và 5-sulfamido isatin, các azomethin của 5-nitroisatin Kết quả cho thấy chúng kìm hãm mô phân sinh thực vật khá cao

1.1.4 Tác dụng ức chế monoamino-oxydase (MAO)

Năm 1962, khi tiến hành so sánh indol với isatin, Mueller và cộng sự (dẫn theo [25]) thấy rằng isatin có tác dụng ức chế MAO trong dịch đồng nhất của gan lợn

A.Grinberg và cộng sự [21] đã tổng hợp 18 dẫn chất (là các dẫn chất N- methyl, N-acetyl của isatin và các oxim của chúng), thử tác dụng trên ty lạp thể của gan lợn các tác giả rút ra nhận xét:

■ Khi thay thế nhóm p-carbonyl bởi nhóm oxim cũng như thay thế nguyên tử H của nhóm NH sẽ làm giảm hoạt tính ức chế MAO

■ Dẫn chất ß-acethoxyimino có hoạt tính cao hofn dẫn chất ß- methoxyimino.

■ Khi phần nhân thơm được mở rộng sẽ làm tăng hoạt tính ức chế MAO

1.1.5 Các tác dụng khác:

Ngoài các tác dụng đã nêu ở trên, các dẫn chất isatin còn có nhiều tác dụng khác: an thần, chống co giật, chống viêm, điều trị suy nhược thần kinh, trị giun

5-bromoisatin thử trên chuột có tác dụng giảm đau mạnh hơn aspirin ở

liều 0,4g/kg Nó cũng có tác dụng an thần ở liều 0,2g/kg [25]

K.c Joshi và cộng sự [25] khảo sát tác dụng trên hệ thần kinh trung ương

và tác dụng giảm đau của một số base Mannich và base Schiff của các dẫn chất fluor của isatin Kết quả cho thấy các chất có nhóm ceton tự do ở vị trí 2

và 3 có tác dụng ức chế thần kinh trung ương mạnh Hoạt tính này giảm đi khi nhóm ceton ở vị trí 3 bị thay thế bỏd nhóm C=N và hoàn toàn biến mất khi nhóm ceton ở vị trí 2 bị thay thế tiếp bằng nhóm C=N Các dẫn chất có 1 hoặc

2 nhóm ceton tự do có tác dụng giảm đau LD50 của phần lóĩi các dẫn chất trên đều >1000mg/kg

Một số dẫn chất thiosemicarbazon, 3-hydrazon, 3-aryl alkylimino của isatin được công bố có tác dụng chống co giật [25]

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ISATIN VÀ DẪN CHẤT

1.2.1 Các phương pháp tổng hợp dị vòng isatin

1.2.1.1 Oxy hoá Indigo:

Isatin là một dị vòng có chứa nhân indol có công thức cấu tạo:

H

Isatin ( lH -in dol-2,3-dion )

Isatin là tên bắt nguồn từ cây chàm Châu Âu Isatis tinctorỉa do Laurent và

Erdmant tìm ra năm 1841 (dẫn theo [20]) Các tác giả này đã tổng hợp Isatin

Sơ đồ phản ứng như sau:

[0 ]

N a 2 C r2 0 7 /H 2 S 0 4

1.2.1.2 Tống hợp theo phản ứng Sandmayer 1903 [26],

Sandmayer đã tìm ra 2 phương pháp tổng hợp isatin Phản ứng Sandmayer

1903 là phương pháp đầu tiên của ông được thực hiện để tổng hợp isatin Từ nguyên liệu ban đầu là diphenylthioure, cho tác dụng vói PbO tạo ra N, N’- diphenylcarbodiimid, cho chất này tác dụng tiếp vói HCN tạo N, N’- diphenyl cyanoformamidin Khử hoá tiếp bằng amoni Sulfid tạo thành thioamid Khi đóng vòng thioamid bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ 75 - 100°c tạo thành isatin-2- anilinyliden Thuỷ phân isatin-2-anilinyliden cho isatin

PbO_

N -C -N H - C ô H s H

N-C6H5

Isatin cũng có thể tổng hợp vód hiệu suất tốt mà không cần qua giai đoạn tạo thành thioamid bằng cách cho N, N’-diphenylcyanoformamidin tác dụng với AICI3 khan trong dung môi là benzen, clorobenzen, dicloroethan ở nhiệt

đô 20 - 40°c.

I.2.I.4 Tổng hợp theo phản ứng Sandmayer 1919 [26]:

Năm 1919, Sandmayer đã đưa ra một phương pháp để tổng hợp isatin và dẫn chất Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và thường được ứng dụng trong thực tế Quá trình tổng hợp đi qua hai giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Tạo isonitrosoacetanilid bằng cách đun nóng amin thơm

với cloral hydrat và hydroxylamin hydroclorid trong môi trường acid

- Giai đoạn 2: Đóng vòng isonitrosoacetanilid tạo isatin dưới tác dụng của H2SO4 đặc.

- Sơ đồ phản ứng như sau:

1.2.1.4 Tổng hợp theo phương pháp của Martìnet [26]:

Isatin nhận được khi đun sôi (20 - 30 phút) arylamin bậc một hay bậc hai với este diethyl của acid mesoxalic trong acid acetic băng Trong nhiều trường hợp sản phẩm được tạo thành với hiệu suất trung bình hoặc thấp Tuy nhiên, phương pháp này vẫn được sử dụng, đặc biệt vói các isatin khó tổng hợp

Một số dẫn chất isatin nhận được bằng phương pháp Martinet: 5-methyl

và 5,7-dimethylisatin, 5-methoxyisatin, 6-ethylisatin, 5 và 6-phenylisatin, naphtyl-isatin-l,2,6-oxy và 8-oxynaphtylisatin-l,2

1.2.2 Các phương pháp tổng hợp dẫn chất của isatỉn

H

Từ cấu trúc phân tử của isatin cho thấy nhiều khả năng phản ứng chuyển hoá để tạo ra nhiều dẫn chất khác nhau của isatin, chủ yếu theo ba hưófng chính sau đây:

Các dẫn chất tạo thành do phản ứng thế nguyên tử hydro của nhóm -NH.Các dẫn chất tạo thành do phản ứng thế ái điện tử của nhân benzen

Các dẫn chất tạo thành do phản ứng của nhóm carbonyl ở vị trí 3

I.2.2.I Phẩn ứng thế ái điện tử vào nhân benzen.

Các phản ứng thế ái điện tử vào nhân benzen của isatin thưcmg xảy ra ở vị trí 5 hoặc 7, các phản ứng thưòỉng gặp như thế brom, thế nitro

+ Bro + HBr

1.2.2.2 Phẩn ứng ngưng tụ của isatin với 2 - thioxo - 4 - thiazolidinon

2-thioxo-4-thiazolidinon có công thức cấu tạo như sau:

o

^ 4— 3NH

Nhóm methylen ở vị trí 5 trong nhân 2-thioxo-4-thiazolidinon hoạt động rất mạnh, nó có thể dễ dàng tham gia phản ứng ngưng tụ với dẫn chất nitroso, dẫn chất formamidin, các hợp chất có nhóm >c=0:

-)

CH + HB

(II)

B = Anion (II) sẽ tấn công vào carbon mang điện tích dương của nhóm

Ion alcolat (IV) lại lấy một proton của HB để trả lại xúc tác B" :

+) Giai đoạn ngưng tụ (dehydrat):

Dưới tác dụng proton, một phân tử nước bị loại ra tạo thành dây nối kép

Định nghĩa: Phản ứng Mannich là phản ứng aminomethyl hoá hợp chất

hữu cơ có nguyên tử hydro linh động bằng tác dụng của HCHO (hoặc các aldehyd khác) và amin bậc 1 hoặc bậc 2 hoặc NH3

Phản ứng này xảy ra dễ dàng trong dung môi ethanol ở nhiệt độ không cao (<100^’C) và xúc tác acid.

Cơ chế phẩn ứng xảy ra theo 2 giai đoạn:

Giai đoạn I : Amin phản ứng vói formaldehyd vói sự có mặt của acid tạo

thành một chất trung gian, chất này loại nước tạo thành các tác nhân ái điện tử:

R2

N = C H 2 - / N - C H 2

Giai đoạn 2: Các phân tử hữu cơ có nguyên tử H linh động phản ứng vói

các tác nhân ái điện tử tạo ra sản phẩm của phản ứng gọi là các base Mannich

ĩ/

Đặc điểm của các chất tham gia phản ứng:

Trong phản ứng Mannich có ba chất tham gia là amin, aldehyd và một họfp chất có nguyên tử hydro linh động

• Amin: Có thể là amin bậc 1 hoặc amin bậc 2 Nếu dùng amin bậc 1 thì

sản phẩm sẽ là amin bậc 2 và thường sẽ phản ứng tiếp cho sản phẩm là amin bậc 3 Amoniac cũng có thể được sử dụng nhưng thường xảy ra ba phản ứng liên tiếp cho amin bậc 1, bậc 2, bậc 3

• Aldehyd: Formaldehyd thường được dùng trong phản ứng Mannich

Một vài aldehyd cao hơn cũng được dùng có kết quả như aldehyd succinic dùng trong tổng hợp atropin

• Các hợp chất có nguyên tử hydro linh động: bao gồm nhiều loại hợp

chất khác nhau chứa hydro linh động đi từ các liên kết C-H khác nhau (thường là C-H ở cạnh nhóm chức của aldehyd, ceton, acid, phenol, hợp

amin, amid, imid; từ liên kết S-H của một số dẫn chất thiol; từ P-H của một số dẫn chất phosphonic Tưofng ứng với các loại H linh động nêu trên ta có các quá trình C-aminomethyl hoá, N-aminomethyl hoá, P- aminomethyl hoá

Điều kiện của phản ứng:

• Tính ái nhân của amin: Phản ứng Mannich xảy ra khi tính ái nhân của

amin mạnh hơn tính ái nhân của hợp chất chứa nguyên tử H linh động Nếu ngược lại thì formaldehyd sẽ phản ứng ưu tiên vói hợp chất có hydro linh động theo kiểu phản ứng aldol hoá

• Dung môi: Dung môi dùng chủ yếu là ethanol, ngoài ra có thể dùng các

alcol khác như methanol, isopropanol, đôi khi dùng DMF

• Nhiệt độ phản ứng: Phản ứng Mannich xảy ra với điều kiện nhẹ nhàng,

nhiệt độ phản ứng từ 50 - lOO^C hoặc nhiệt độ phòng

• Xúc tác: Thông thường phản ứng Mannich cần xúc tác acid Xúc tác

hay dùng là acid hydrocloric loãng hoặc dùng amin dưới dạng muối hydroclorid của nó Trường hợp các chất chứa C-H có tính acid yếu như phenol và indol thì ta tiến hành phản ứng trong môi trường acid acetic Trong nhiều trường hợp phản ứng xảy ra không cần xúc tác

ứng dụng của phản ứng Mannich trong tổng hợp các dẫn chất base Mannich của 5-fluoroisatin và 2-thioxo-4-thiazolidinon:

Nhóm -NH amid của nhân 5-fluoroisatin và -NH imid của nhân 4-thiazolidinon có H linh động có thể tham gia phản ứng Mannich tạo ra các dẫn chất base di-Mannich và mono-Mannich theo sơ đồ sau:

Phần 2ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u2.1 NGUYÊN LIỆU

■ Các hoá chất chính (p-fluoroanilin, p-cloroanilin, piperidin, morpholin, p-toluidin, anilin) là các hoá chất dùng trong tổng hợp hoá học có hàm lượng từ 98 - 99,5% của hãng Merck (Đức)

■ Cloralhydrat (99%) của công ty hoá dược BDH (Anh)

■ Các hoá chất khác (hydroxylamine hydroclorid, natrisulfat, natri acetat)

và dung môi (ethanol, acid acetic băng, aceton, cloroform, DMF, methanol ) của Trung Quốc

■ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ('H-NMR và ^^C-NMR) ghi trên máy Bruker - AV500 tại phòng phân tích cấu trúc - Viện hoá học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

■ Sử dụng các phương pháp thực nghiệm trong hoá học hữu cơ để tổng hợp các sản phẩm dự kiến.

■ Dùng SKLM để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm để nhận biết vết sắc ký

■ Xác định độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được bằng phương pháp SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy

■ Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích phổ u v , IR, MS, ‘H-NMR, '^C-NMR

■ Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (kỹ thuật thử hoạt tính sinh học trên phiến vi lượng 96 giếng)

■ Thử tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư người được tiến hành theo phương pháp SBR của Likhiwitayawuid hiện đang áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI)

2.3 PHƯƠNG PHÁP

Phần 3THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ3.1 TỔNG HỢP HOÁ HỌC

3.1.1 Tổng hợp 5-fluoroisatin (1)

Chúng tôi tiến hành tổng hợp 5-fluoroisatin bằng phản ứng Sandmayer

1919 theo sơ đồ sau:

Quá trình tổng hợp gồm 2 giai đoạn;

- Giai đoạn 1: Cho p-fluoroanilin phản ứng với cloralhydrat và hydroxylamin trong môi trường acid thu được p-fluoro isonitrosoacetanilid

- Giai đoạn 2: Đóng vòng p-fluoroisonitrosoacetanilid tạo ra 5-fluoro isatin dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở 80°c.

b Tổng hợp 5-fluoroỉsatìn (1)

Cho 60 ml acid sulfuric đặc vào bình cầu Đun nóng đến khoảng 60°c Vừa khuấy, vừa cho từ từ 14,56g (0,08 mol) p-fluoroisonitrosoacetanilid đã sấy khô vào sao cho nhiệt độ giữ trong khoảng 60-70°C Khi cho hết thì tăng nhiệt độ lên 80°c Giữ ở nhiệt độ này trong 15 phút thì kết thúc phản ứng Để nguội đến nhiệt độ phòng rồi rót từ từ vào cốc có 700g nước đá Để yên 30 phút Lọc hút, rửa tủa bằng nước lạnh cho đến hết phản ứng acid Kết tinh lại trong ethanol, sấy khô thu được 8,53g sản phẩm là tinh thể hình kim màu đỏ gạch, có nhiệt độ nóng chảy 226-227°C, hiệu suất 64,6% tính theo chất (1’)

Khd năng hoà tan trong các dung môi: Sản phẩm khó tan trong nước, tan

trong methanol, ethanol, aceton, dễ tan trong DMF

Độ tinh khiết: Kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM vói hệ dung môi khai

triển là CHCI3 : MeOH (13:1), dung môi hoà tan là aceton Soi đèn tử ngoại thu được một vết rõ có Rf = 0,56

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất ngưng tụ của 5-fluoroisatin với 2-thioxo-4- thiazolidinon (2).

5-fluoroisatin có nhóm carbonyl ở vị trí p có khả năng tham gia phản ứng ngưng tụ với 2-thioxo-4-thiazolidinon có nhóm methylen hoạt động ở vị trí 5,

s s

(2): 5-(2 ’-0 X 0 -5 *-fluoro-3 ’-indolinyliden)-2-thioxo-4-thiazolidinon

CTPT: C11H5O2N2FS2 PTL: 280

Dụng cụ gồm: Bình cầu 3 cổ dung tích 250ml, sinh hàn hồi lưu, máy

khuấy từ gia nhiệt, nhiệt kế

Tiến hành:

Cho vào bình cầu 8,25g (0,05mol) 5-fluoroisatin, 12,3g (0,15mol) natri acetat khan, 6,65g (0,05mol) 2-thioxo-4-thiazolidinon và 100 ml acid acetic băng Đun hồi lưu cách cát trong vòng 6h Sau 6h thì kết thúc phản ứng, đổ hỗn hợp ra cốc có mỏ dung tích 250ml Để nguội cho kết tinh, sau đó đem lọc hút chân không, rửa bằng nước đá đến khi hết acid Sấy khô, kết tinh lại trong Ethanol: DMF (1:1), sấy khô, thu được 1 l,24g sản phẩm có màu tím sẫm

+ Độ tinh khiết: Kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi khai triển CHCI3: MeOH (13:1), soi đèn tử ngoại cho một vết gọn rõ có = 0,58

3.1.3 Tổng hợp một sô dẫn chất base di-Mannich của 5-(2’-oxo-5’-fluoro- 3’-indolinyliden)-2-thioxo-4-thiazolidinon (3,4).

Trong cấu tạo phân tử chất 2 có hai nguyên tử hydro linh động Đó là H ở nhóm -NH amid của hợp phần 5-fluoroisatin và H của nhóm -NH imid của hợp phần 2-thioxo-4-thiazolidinon, vì vậy khi tham gia phản ứng Mannich với amin bậc 2 và formaldehyd hai nguyên tử hydro này đều có khả năng tham gia phản ứng tạo thành dẫn chất base di-Mannich

Sơ đồ phản ứng như sau:

phẩm dự kiến Các phản ứng đều được tiến hành ở nhiệt độ thích hợp, dung

môi là ethanol, tỷ lệ mol các hợp phần tham gia phản ứng là; Chất 2 : amin bậc h a i: formol (1 : 2,25 : 3) Quá trình phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lófp mỏng để xác định thời gian phản ứng thích hợp

3.1.3.1 Tổng hợp 5 -(l’-morpholinomethyl-2 ’-0 X 0 -5 ’-Jĩuoro-3*-indoỉinyli den)-3-morpholinomethyl-2-thioxo-4-thiazolidinon (3).

(3)

C T P T ; Q1H23O4N4FS2 PTL: 478

Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ dung tích lOOml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ

gia nhiệt, nhiệt kế

Tiến hành:

Cho vào bình cầu 0,56g (0,002 mol) chất 2, 20ml ethanol rồi khuấy trộn

0,5ml formol (0,006mol HCHO) Khuấy khoảng 10 phút tủa đỏ nâu xuất hiện Tiếp tục khuấy trong vòng 4 giờ, đổ ra cốc thuỷ tinh, để kết tủa 1 ngày đêm Đem lọc hút chân không, rửa tủa bằng ethanol lạnh Sấy đến khô Kết tinh lại trong ethanol, sấy khô thu được 0,54g sản phẩm là bột kết tinh màu đỏ nâu.

v _ /

(4)

CTPT ; C23H27O2N4FS2 PTL: 474

Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ dung tích lOOml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ

gia nhiệt, nhiệt kế

Tiến hành:

Cho vào bình cầu 0,56g (0,002 mol) chất 2, 20ml ethanol rồi khuấy trộn đều Sau đó cho tiếp 0,38g (0,0045mol) piperidin trong 20ml ethanol và 0,5ml formol (0,006mol HCHO) Khuấy khoảng 7 phút tủa đỏ xuất hiện Tiếp tục khuấy trong vòng 2 giờ, đổ ra cốc thuỷ tinh, để kết tủa 1 ngày đêm Đem lọc

hút chân không, rửa tủa bằng ethanol lạnh Sấy đến khô Kết tinh lại trong ethanol, sấy khô thu được 0,62g sản phẩm là bột kết tinh màu đỏ.

H của nhóm -NH imid của hợp phần 2-thioxo-4-thiazolidinon theo sơ đồ sau:

3.1.4.1 Tổng hợp 5-(2 ’-0 X 0 -5 ’-fluoro-3’-indolinyliden)-3-N-(p-methyl anilino) methyl-2-thioxo-4-thiazolidinon (5)

2 3 "

-3N— CH2— NH— V ^ C H s

(5)

CTPT : C,9H,402N3FS2 PTL: 399

Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ dung tích lOOml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ

gia nhiệt, nhiệt kế

Tiến hành:

Cho vào bình cầu 0,56g (0,002 mol) chất 2, 20ml ethanol rồi khuấy trộn đều Sau đó cho tiếp 0,48g (0,0045mol) p-toluidin trong 20ml ethanol và0,5ml formol (0,006mol HCHO) Khuấy khoảng 10 phút tủa đỏ cam xuất hiện Tiếp tục khuấy trong vòng 2 giờ, đổ ra cốc thuỷ tinh, để kết tủa 1 ngày đêm Đem lọc hút chân không, rửa tủa bằng ethanol lạnh Sấy đến khô Kết tinh lại trong ethanol, sấy khô thu được 0,49g sản phẩm là bột kết tinh màu đỏ

2 3

— N - C H 2 - N H - Ì ( / "

ơ )

Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ dung tích lOOml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ gia

nhiệt, nhiệt kế

Tiến hành:

Cho vào bình cầu 0,56g (0,002 mol) chất 2, 20ml ethanol rồi khuấy trộn đều

Sau đó cho tiếp 0,42g (0,0045mol) anilin trong 20ml ethanol và 0,5ml formol (0,006mol HCHO) Khuấy khoảng 7 phút tủa đỏ nâu xuất hiện Tiếp tục khuấy trong vòng 2 giờ, đổ ra cốc thuỷ tinh, để kết tủa 1 ngày đêm Đem lọc hút chân không, rửa tủa bằng ethanol lạnh Sấy đến khô Kết tinh lại trong ethanol, sấy khô thu được 0,46g sản phẩm là bột kết tinh màu đỏ nâu

CTPT: C,8H„02N3S2FC1 PTL: 419,5

Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ dung tích lOOml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ gia

nhiệt, nhiệt kế

Tiến hành:

Cho vào bình cầu 0,26g (0,002 mol) p-cloroanilin trong 20ml ethanol và 0,17

ml formol (0,002mol HCHO) Khuấy trộn đều Tiếp đó cho từ từ, từng lượng nhỏ

0,26g (0,002 mol) chất 2 Sau khi cho hết thì tăng nhiệt độ lên 50‘’c Duy trì nhiệt

độ này trong 2 giờ Kết thúc phản ứng, đổ dung dịch ra cốc thuỷ tinh, để kết tủa 1 ngày đêm Đem lọc hút chân không, rửa tủa bằng ethanol lạnh Sấy đến khô Kết tinh lại trong ethanol, sấy khô thu được 0,39g bột kết tinh màu đỏ nâu

2 Đã tiến hành khảo sát thồng số thời gian phản ứng bằng SKLM để tìm thòd gian phản ứng đem lại hiệu suất tối đa

3 Đã sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của chất tổng hợp được bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy của chúng

4 Việc xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được bằng phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ proton (‘H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (*^C-NMR) sẽ được trình bày ở phần sau

Bảng 3.1: Hiệu suất và hằng sô vật lý của các chất tổng hợp được

KLPT

Thời gian phản ứng (giờ)

Nhiệt độ phản ứng(°C)

Màu sắc sản phẩm

Dung môi kết tinh lại

Nhiệt độ nóng chảy CO

Hiệusuất(% )

H '0

3.2 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được:

Chúng tôi đã sơ bộ tiến hành kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng Silicagel Kieselgel 6 O F 2 5 4 (Merck) Các chất được hoà tan trong dung môi aceton và hệ dung môi khai triển là Cloroform : Methanol hoặc Cloroform : Aceton Sau khi tiến hành chạy sắc ký và soi dưói ánh sáng đèn tử ngoại, các chất thử nghiệm đều cho 1 vết gọn và có R f

3.2.2 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được:

Để xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được, chúng tôi đã tiến hành phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưỏfng từ proton (*H- NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (^^C-NMR)

3.2.2.I Phân tích phổ hồng ngoại (IR):

Tại phòng Thí nghiệm trung tâm - Trường Đại học Dược Hà Nội, 8 chất đã tổng hợp được ghi phổ hồng ngoại trên máy Perkin Elmer Sử dụng kỹ thuật viên nén KBr, ghi phổ trong vùng 4000 - 500cm'\ các phổ đồ được trình bày ở các phụ lục (1-8) Kết quả phân tích số liệu phổ hồng ngoại ghi ở bảng 3.3 Các số liệu phân tích phù hợp với các tài liệu tham khảo [14], [15], [37].

Bảng 3.3: Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ IR (cm'^)

3.2.2.2 Phân tích phổ khối lượng (MS).

Phổ khối lượng được ghi trên máy Autospec Premier tại phòng Thí nghiệm Hoá vật liệu - Khoa Hoá Học - Trưòìig ĐH Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN Các phổ đồ được ghi ở phụ lục 9-15 Kết quả phân tích phổ khối lượng được ghi ở bảng 3.4