Tổng hợp một số dẫn chất của 5 cloroisatin và thăn dò tác dụng sinh học

Thăm dò tác dụng sinh học kháng khuấn, kháng nấm và kháng các dòng tế bào ung thư người của các chất tổng hợp được.Chúng tôi hy vọng đề tài này là một đóng góp nhỏ vào việc nghiên cứu, t

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS T rần Viết

Hùng, TS Đinh Thị Thanh Hải - Bộ môn Hóa hữu cơ - Trường đại học

Dược Hà Nội, các thầy đã dành nhiều thời gian tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quang Đạt, các thầy cô và

các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa hữu cơ - Trường Đại học Dược Hà Nội

đã giúp đỡ, động viên và cho tôi những ý kiến vô cùng quý báu trong thời gian nghiên cứu và làm luận tại bộ môn

Trong quá trình thực hiện khóa luận tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của

cá nhân, đơn vị trong và ngoài trường, tôi xin chân thành cảm ơn: ThS Bùi Thị N hung - phòng sắc ký khối phổ phân giải cao, ThS Nguyễn Thị Son - phòng Hóa vật liệu - Khoa Hóa - Trường đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội ThS Đ ặng Vũ Lương - phòng c ấ u trúc - Viện Hóa học - Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam; PGS TS Lê M ai H uong phòng Thực nghiệm sinh học, Viện Hóa học các họp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp, những người đã giúp đỡ động viên tôi suổt 2 năm học vừa qua và tạo mọi điều kiện

đê tôi hoàn thành được khóa học

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2010

Học viên

Hoàng Lê Hiếu Hạnh

MỤC LỤC

Trang

CHÚ GIẢI KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIế T TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH, s ơ ĐỒ

ĐẶT VẤN Đ È 1

Chương i TỐNG QUAN 3

1.1 Tình hình nghiên cứu tác dụng sinh học của dẫn chất Isatin .3

1.1.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng lao 3

1.1.2 Tác dụng kháng virus 7

1.1.3 Tác dụng kháng tế bào ung th ư 8

1.1.4 Tác dụng ức chế Monoamino-oxydase (M A O ) 9

1.1.5 Các tác dụng k h á c 10

1.2 Các phương pháp tổng họp Isatin và dẫn ch ất 10

1.2.1 Các phương pháp tống họp dị vòng isatin 10

1.2.2 Các phương pháp tổng họp dẫn chất của isatin 13

Chương 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 22

2.1 Nguyên liệu nghiên c ứ u 22

2.2 Thiết bị nghiên c ứ u 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Phương pháp tổng hợp các dẫn chất 5-cloroisatin và các dẫn chất base M annich 23

2.3.2 Phương pháp xác định câu trú c 23

2.3.3 Phương pháp thử tác dụng sinh h ọ c 23

Chuông 3 Kế T QUẢ NGHIÊN c ứ u 27

3.1 Tổng họp hóa học 27

3.1.1 Tổng hợp 5-cloroisatin 28

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất ngưng tụ của 5-cloroisatin với

2-thioxo-4-thiazolidinon và imidazolidin-2,4-dion 30

3.1.3 Tổng hợp một số dẫn chất base Mannich 32

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc 45

3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được 45

3.2.2 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được 46

3.3 Thử tác dụng sinh học 50

3.3.1 Thử tác dụng kháng khuân, kháng n âm 51

3.3.2 Thử hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay) 52

Chuong 4 BÀN L U Ậ N 53

4.1 v ề tổng họp hóa học 53

4.1.1 v ề phản ứng tổng hợp 5-cloroisatin 53

4.1.2 v ề phản úng ngưng tụ của 5-cloroisatin (1) với 2-thioxo-4-thiazolidinon và imidazolidin-2,4-dion 53

4.1.3 v ề phản ứng M annich 53

4.2 v ề xác định cấu t r ú c 55

4.2.1 v ề phổ hồng ngoại (IR) 55

4.2.2 v ề phổ khối lượng (M S) 56

4.2.3 v ề phổ cộng hưởng từ proton ('H-NMR) và l3C (l3C-NMR) của chất (2), (3) 61

4.3 v ề tác dụng sinh học 63

K ế t l u ậ N VÀ KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CHÚ GIẢI KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIế T TẮT

l3C-NMR Phổ công hưởng từ hat nhân carbon 13

CFU Số đơn vị khuẩn lạc (Colony forming unit)

Hep-G2 Te bào ung thư gan người (Hepatocellular carcinoma)

EI-MS Phổ khối iượng bắn phá electron

IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ

MIC Nồng độ ức chế tối thiếu (Minimal inhibitory concentration)

MS Phổ khối lượng (Mass spectroscopy)

NMR Pho cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)PTL Phân tử lượng (Khối lượng phân tử)

nnO

1 nc Nhiệt độ nóng chảy

DANH MỤC CÁC BẢNG

TrangBảng 3.1 Hiệu suất và hằng số vật lý của các chất tổng hợp được 43Bảng 3.2 Tóm tắt kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng 45Bảng 3.3 Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ IR (cm"1) của các 47

chât tông họp đượcBảng 3.4 Số liệu phân tích phổ khối lượng của các chất tổng họp 48

đượcBảng 3.5 Số liệu phổ cộng hưởng từ proton ('H-NM R) của các 49

chât tông hợp đượcBảng 3.6 Số liệu phổ cộng hưởng từ carbon 13 (13C-NMR) của 50

một số chất tổng họp đượcBảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của một 51

số chất tổng họp đượcBảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người của 52

một số chất tổng họp được

I

ĐẶT VẨN ĐÈ

Ngày nay, trình độ khoa học kỹ thuật và công nghệ ngày càng phát triển, việc phát hiện bệnh tật ở con người không còn khó khăn như trước Nhưng vấn đề nan giải đặt ra cho ngành Y tế nói chung và ngành Dược nói riêng là làm sao nghiên cứu kịp thời các loại thuốc có hiệu quả phòng và chữa bệnh

Khi khoa học hiện đại phát triển, bên cạnh thuốc có nguồn gốc tự nhiên thì thuốc có nguồn gốc tổng họp Hóa dược đóng vai trò hết sức quan trọng trong nghiên cứu phát triển thuốc Trong lĩnh vực tổng hợp Hóa dược, các nhà nghiên cứu tìm cách tạo ra các chất mới, dự đoán có hoạt tính cao hơn và độc tính giảm bằng cách biến đổi cấu trúc của các chất có tác đụng dược lý đã biết đến hoặc đã được sử dụng làm thuốc

Những năm gần đây, isatin và các dẫn chất là một dãy chất hữu cơ đã được các nhà nghiên cứu quan tâm bởi tác dụng sinh học phong phú đa dạng của nó Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh được tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, kháng virus, kháng lao và nhiều tác dụng dược lý khác có triển vọng Trong đó, các dẫn chất 5-halogen isatin cụ thể là 5-cloroisatin, dẫn chất Mannich, dẫn chất ngưng tụ với 2-thioxo-4-thiazolidin

và imidazolidin-2,4-dion đang được chú ý nghiên cứu [2 - 13]; [1 5 - 18]; [20 - 28]; [3 1 -3 5 ],

Xuất phát từ nhũng thành tựu nghiên cứu trên, với mong muốn tìm ra những dẫn chất mới của isatin có hoạt tính cao, có thể ứng dụng lâm sàng,

chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Tống họp một số dẫn chất của 5-Cloroisatin

1 Tổng hợp 5-cloroisatin và một số dẫn chất của nó

2 Thăm dò tác dụng sinh học (kháng khuấn, kháng nấm và kháng các dòng tế bào ung thư người) của các chất tổng hợp được.

Chúng tôi hy vọng đề tài này là một đóng góp nhỏ vào việc nghiên cứu, tìm kiếm những chất có hoạt tính sinh học thuộc dãy chất isatin

C h u o n g 1 T Ố N G Q U A N

1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN c ứ ư TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA DẪN

CHẤT ISATIN

Isatin và dẫn chất là một trong những chất hữu cơ đã được nghiên cứu có

hệ thống về mặt hóa học cũng như tác dụng sinh học Rất nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học của các dẫn chất isatin đã cho thấy chúng có tác dụng khá phong phú và đa dạng như tác dụng kháng khuân, kháng nấm, kháng lao, kháng virus, chống phân bào, ức chế men Monoamino-oxydase (MAO)

nhận thấy nhóm thế halogen ở vị trí 5 giữ vai trò quan trọng trong tác dụng kháng khuẩn (làm tăng tác dụng).

Các nhà nghiên cứu Ấn Độ Joshi K c., Pathak V N., Jain s K [24]

đã tổng họp và nghiên cứu tác dụng kháng khuấn của 15 dan chat fluor của isatin có công thức

^X-

Các tác giả Padhya A c và cộng sự [34] cũng đã tông hợp và thử tác dụng của một số dẫn chất nitrofuryliden isatin hydrazon và thấy rằng chúng

có tác dụng ức chế Staphylococcus aureus, Echerỉchia coli.

N - N = C H - - n o 2

R = H, 5 -Br, 6-CI

Varma R s và Nobles w I [39], [40] đã nghiên cứu và công bố tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của một số base Mannich của isatin có công thức như sau :

R = H, CH3, Br R2 = o, NNHCSNHa

R, = N(CH3)2, — n p í

-N

V

Năm 1989, Dilber s [17] và cộng sự đã tổng hợp và khảo sát tác dụng kháng khuẩn của 19 dẫn chất isatin có công thức :

Kết quả cho thấy có 8 dẫn chất có tác dụng với Escherichia colỉ, 4 chất

có tác dụng với Staphylococcus aureus.

Ở Việt Nam, Nguyễn Quang Đạt và cộng sự [2], [5] đã tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của nhiều dẫn chất isatin với các nhóm thế khác nhau ở vị trí 5 (-NO2, -Br) và các dẫn chất base Mannich, hydrazon, base Schiff

R = N 0 2 , Br R' = H ,C H 2R |R 2

R" = o , = N — A r , = N — N H — A r

Kết quả cho thấy nhiều dẫn chất có hoạt tính kháng khuẩn và kháng

nấm Candida albicans, trong số đó đáng chú ý là các dẫn chất của 5-

nitroisatin

Tác giả Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt và cộng sự [7 - 8] cũng đã tổng hợp và thử tác dụng sinh học của dẫn chất 5-fluoroisatin, kết quả cho thấy 5-fluoro-l-morpholinomethylisatin, 5-fluoro-l-piperinomethylisatin có tác dụng với 9 chủng vi khuấn thử nghiệm và các base Mannich có tác dụng mạnh hơn so với các chất cùng dãy, ngoài ra chúng còn có tác dụng kháng

nấm Candida albicans.

Năm 2000, các tác giả trên [10] tiếp tục nghiên cứu tổng hợp thăm dò tác dụng sinh học của 5-bromo-l-morphylinomethylisatin và các dẫn chất Kết quả cho thấy các chất này có tác dụng mạnh với 8 chủng vi sinh vật thử nghiệm với nồng độ lmg/ml.

Bên cạnh đó, tác dụng chống trực khuẩn lao của các dẫn chất isatin cũng được các nhà khoa học chú ý Nhiều thuốc chống lao có hiệu quả như Rimifon, Streptomycin, Rifampicin đã được đưa vào sử dụng Tuy nhiên, hiện nay, hiện tượng kháng thuốc chống lao ngày càng tăng, đặc biệt là hiện tượng kháng đa thuốc

Năm 1976, các tác giả Tomchin A B và cộng sự [38] đã thử tác dụng kháng lao của isonotinoylhydrazon của isatin Kết quả cho thấy chất này có

tác dụng ức chế Mycobacterium tuberculosis ở nồng độ 2|ig/ml Đặc biệt cho

thấy chất này có tác dụng vói cả chủng vi khuẩn lao đă kháng rimifon và streptomycin:

Năm 2000, các tác giả Nguyễn Quang Đạt, Trần Viết Hùng và cộng sự [6] đã nghiên cứu sâu tác dụng kháng lao của một số dẫn chất 3- thiosemicarbazon và isonicotinoylhydrazon của isatin và 5-halogenoisatin Kết quả cho thấy 12 dẫn chất có tác dụng mạnh với trực khuẩn lao (MIC = 0,2

- 50ụ.g/ml) và các dẫn chất thế có tác dụng mạnh hơn các dẫn chất không thế Trong đó, đáng chú ý nhất là một số chất có tác dụng với các vi khuẩn lao đã kháng rimifon (MIC = 5|ig/ml)

H

N ' 'O

J .

CH 2 NR 4 R 2

R = H , CH 3 , Br R3 = o , n n h c s n h 2

/ “ \

N R ,R 2 = N (C H 3)2 , — N 0 > í

-N

V

Nghiên cứu một số dẫn chất của isatin-3-thiosemicarbazon, Sadler p

w [36] thấy rằng dẫn chất N-methyl và N-ethyl có tác dụng ức chế virus

Sarcom rous Hai chất này cũng đã được tác giả thử tác dụng trên mô nuôi

cấy, trên súc vật và trên lâm sàng

Cơ chế tác dụng chống virus của các dẫn chất isatin chưa được nghiên cứu nhiều, song một số tác giả đã phát hiện ra cơ chế tác dụng của isatin-3- thiosemicarbazon là ức chế việc tổng hợp AND của virus.

1.1.3 Tác dụng kháng tế bào ung thư

Các chất tổng hợp có tác dụng chống ung thư được các nhà nghiên cứu chú ý nhằm tìm ra các chất có tác dụng điều trị căn bệnh đang có chiều hướng gia tăng này Nhiều dẫn chất của isatin, đặc biệt là các dan chat base Mannich

có tác dụng chống phân bào, chong khối u

Nhà nghiên cứu người Hoa Kỳ, Pop F D [35] đã tổng hợp và công bố tác dụng chống khối u của các dẫn chất 3-(o-nitrophenyl)hydrazonisatin Các

chất này kìm hãm sự phát triên của Carcinosarcoma walker 256.

Năm trong số các dẫn chất 5-(2-oxo-3-indolinyliden)-thiazolidin-2,4- dion-l,3-di-M annich đã được Eshba N H và Salama H M [18] tông hợp và thử tác dụng trên tế bào bạch huyết P388 của chuột Trong số các chất này, dẫn chất có nhóm thế dimethylalinomethyl ở vị trí 3 của nhân thiazolidindion

có hoạt tính chống ung thư cao nhất Kết quả thử cũng cho thấy việc thế brom vào vị trí 5 của nhân isatin làm tăng hoạt tính chống ung thư

Tại Việt Nam, Nguyên Quang Đạt và cộng sự [4] đã tổng hợp và thử

tác dụng chống phân bào trên mô phân sinh của rễ cây Raphanus satỉvus L

của một số dẫn chất hydrazon, base Mannich của 5-bromoisatin và 5- sulfamidoisatin, các azomethin của 5-nitroisatin Kết quả cho thấy các chất này kìm hãm phân sinh thực vật khá mạnh

1.1.4 Tác dụng ức chế Monoamino-oxydase (MAO)

Năm 1962, khi tiến hành so sánh indol với isatin, Mueller và cộng sự [25] thấy rằng, isatin có tác dụng ức chế MAO trong dịch đồng nhất của gan

Griberg A và cộng sự [21 ] đã tống họp 18 dẫn chất là các dẫn chất N- methyl, N-acetyl của isatin và các oxim của chúng Thử tác dụng trên ty lạp thế của gan lợn, các tác giả rút ra nhận xét:

- Khi thay thế nhóm |3-carbonyl bởi nhóm oxim cũng như thay thế nguyên tử H của nhóm NH sẽ làm giảm hoạt tính ức chế MAO

Dần chất Ị3-acethoxyimino có hoạt tính cao hơn dẫn chất [3- methoxyimino

- Khi phần nhân thơm được mở rộng sẽ làm tăng hoạt tính ức chếMAO

1.1.5 Các tác dụng khác

Ngoài các tác dụng đã nêu ở trên, các dẫn chất isatin còn có nhiều tác dụng khác như: an thần, chống co giật, chống viêm, điều trị suy nhược thần kinh, trị giun

5-Bromoisatin thử trên chuột có tác dụng giảm đau mạnh hơn aspirin ở liều 0,4g/kg Chất này cũng có tác dụng an thần ở liều 0,2g/kg [23],

Joshi K c và cộng sự [28] đã khảo sát tác dụng trên hệ thần kinh trung ương và tác dụng giảm đau cua một so base Mannich và base Schiff của các dẫn chất fluor của isatin Kết quả cho thấy, các chất có nhóm ceton tự do ở vị trí 2 và 3 có tác dụng ức chế thần kinh trung ương mạnh Hoạt tính này giảm

đi khi nhóm ceton ỏ' vị trí 3 bị thay thế bởi nhóm C=N và hoàn toàn biến mất khi nhóm ceton ở vị trí 2 bị thay thế tiếp bằng nhóm C=N Các dẫn chất có 1 hoặc 2 nhóm ceton tự do có tác dụng giảm đau LD50 của phần lớn các dẫn chất trên đều >1000mg/kg

Một số dẫn chất thiosemicarbazon, 3-hydrazon, 3-aryllimino của isatin được công bố có tác dụng chống co giật [23]

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÓNG HỌP ÍSATIN VÀ DẪN CHẤT

1.2.1 Các phưong pháp tống họp dị vòng isatin

1.2.1.1 Oxy hoủ Indigo

Isatin là một dị vòng có chứa nhân indol có công thức cấu tạo:

H ỉsatin ( lH-indol- 2 , 3 -dion'

Isatin là tên bắt nguồn từ cây chàm Châu Âu is at is tinctoria do Laurent

và Erdmant tìm ra năm 1841 [20] Các tác giả này đã tông hợp isatin bằng cách oxy hoá indigo với tác nhân oxy hoá là Na2Cr20 7

o

Sơ đồ phản ứng như sau :

H2SO4 đặc ở nhiệt độ 75 - 100°c tạo thành isatin-2-anilinyliden Thuỷ phân isatin-2-anilinyliden cho isatin

Pbo.

N —C — N H — C6H5 H

N = C = N — C 6H5

Isatin cũng có thể được tổng họp với hiệu suất tốt mà không cần qua giai đoạn tạo thành thioamid bằng cách cho N,N’-diphenylcyanoformamidin tác dụng với AICI3 khan trong dung môi là benzen, clorobenzen, dicloroethan

ở nhiệt độ 20 - 40°c.

Trong phương pháp này cần chú ý đến tạp chất vì sản phâm isatin-2- anilinyliden thu được theo phương pháp Sandmayer 1903 thường chứa tạp chất lưu huỳnh Tạp chất này được tách ra bằng cách chiết nhiều lần với dung môi carbon disulfid sôi.

1.2.1.4 Tồng hợp theo phân ứng Sandmayer 1919 [26Ị

Năm 1919, Sanđmayer đã đưa ra một phương pháp khác đê tông hợp isatin và dẫn chất Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và thường được ứng dụng trong thực tế Quá trình tống hợp đi qua hai giai đoạn :

- Giai đoạn 1: Tạo isonitrosoacetanilid bằng cách đun nóng amin thơm

với cloralhydrat và hydroxylamin hydroclorid trong môi trường acid

- Giai đoạn 2 : Đóng vòng isonitrosoacetanilid tạo isatin dưới tác dụng

của H2S 04 đặc

Sơ đồ phản ứng như sau:

1.2.1.4 Tống hợp theo phương pháp của Martinet [26Ị

Khi đun sôi arylamin bậc một hay bậc hai với este diethyl của acid mesoxalic trong acid acetic băng trong thời gian 20 - 30 phút, thu được isatin Trong nhiều trường họp sản phẩtn được tạo thành với hiệu suất trung bình

H ^NOH

H

H

hoặc thấp Tuy nhiên, phương pháp này vẫn được sử dụng, đặc biệt với các isatin khó tong họp.

' n h 2

x o o c 2 h 5 'C00C2H5

R—

' N 'IH

- C 2 H 5 OH

R—

'N 'ìH

ệ= 0

I,c = o

X — COOC2H5 SOH

COOC 2 H 5 -OH

- HiO

►

R-'N o I

n

4 ”o

Một số dẫn chất isatin nhận được bằng phương pháp Martinet: 5- methyl và 5,7-dimethylisatin, 5-methoxyisatin, 6-ethylisatin, 5 và 6- phenylisatin, naphtyl-isatin-l,2,6-oxy và 8-oxynaphtylisatin-l,2

1.2.2 Các phương pháp tổng họp dẫn chất của isatin

Các dẫn chất tạo thành do phản ứng thế nguyên tử hydro của nhóm NH

Các dẫn chất tạo thành do phản ứng thế ái điện tử của nhân benzen

- Các dẫn chất tạo thành do phản ứng của nhóm carbonyl ở vị trí 3

1.2.2 ĩ Phán ứng thế ái điện tử vào nhân benzene.

Các phản ứng thế ái điện tử vào nhân benzen của isatin thường xảy ra ở

vị trí 5 hoặc 7, các phản ứng thường gặp như thế brom, thế nitro

1.2.2.2 Phản ứng ngung tụ của isatin với 2 - thioxo - 4- thiazolidinon và imidazoỉidin-2,4-dion

2-thioxo-4-thiazolidinon (a) và imidazolidin-2,4-dion (b) có công thức cấu tạo như sau:

Nhóm methylen ở vị trí 5 trong nhân 2-thioxo-4-thiazolidinon và imidazolidin-2,4-dion hoạt động rất mạnh, nó có thể dễ dàng tham gia phản ứng ngưng tụ với các họp chất có nhóm > c = 0 , dẫn chất nitroso, dẫn chất formamidin

Phản ứng ngưng tụ được tiến hành trong dung môi acid acetic băng, xúc tác là natri acetat khan, đun hồi lưu trong 6 giờ.

- Cơ chê phản ứng:

Phản ứng xảy ra theo 2 giai đoạn:

+) Giai đoạn cộng hợp:

Nhóm methylen ở vị trí 5 rất hoạt động, các nguyên tử hydro linh động

có thể dễ dàng tách ra khỏi carbon khi có xúc tác kiềm hoặc anion B', hình thành nên tác nhân ái nhân mạnh

CH + HB

B = AcO'Anion (II) sẽ tấn công vào carbon mang điện tích dương của nhóm carbonyl trong isatin và dẫn chất hình thành nên sản phấm cộng hợp (IV):

Dưới tác dụng proton, một phân tử nước bị loại ra tạo thành dây nốikép.

Phản ứng Mannich là phản ứng aminomethyl hóa các hợp chất hữu cơ

có nguyên tử H linh động bằng tác dụng của HCHO (hoặc các aldehyd khác)

và các amin bậc 1, amin bậc 2 hoặc NH3

Môi truồng acid

Trong môi trường acid, phản ứng xảy ra qua hai bước theo cơ chế sau:

Bước ỉ: Amin phản ứng với formaldehyde tạo ra dẫn chất hydroxyl-

methyl, dẫn xuất này gắn proton và loại ra một phân tử nước để tạo ra cation aminomethyl:

Cation aminomethyl

Bước 2: Cation aminomethyl phản ứng với hợp chất có hydro linh động

theo 2 trường hợp sau:

+ Trường hợp hợp chất có hydro linh động có the tạo enol (hydro linh động nằm bên cạnh nhóm carbonyl của phân tử) thì cation aminomethyl là tác nhân

ái điện tử tấn công vào liên kết đôi c=c của dạng enol tạo ra hợp chất chứa nhóm aminomethyl (base Mannich):

tử mang H linh động tạo ra sản phẩm base Mannich:

R - H + H2C - N - ► R — H2C — n ' + H'

Môi truồng base

TRƯỜNG ĐH DƯỢC HÀ NỘI

Trong môi trường base, họp chất có H linh động tách loại tạo thanh carbanion.

*t* Đặc điểm của các chất tham gia phản ứng Mannich

Trong phân tử Mannich có 3 chất tham gia phản ứng là hợp chất có hydro linh động, aldehyd và amin

Amin

Amin tham gia phản ứng phải có ít nhất 1 nguyên tử H linh động, vì vậy amin tham gia phản ứng Mannich có thể là ammoniac, hydrazin hoặc dẫn chất của hydroxylamin, thường gặp là amin bậc 1 (hở hoặc thơm) và amin bậc

2 Việc lựa chọn amin tùy thuộc vào tính base và cấu trúc gốc hydrocarbon của amin

Với amin bậc 2 sản phẩm tạo là base Mannich, dẫn chất amin bậc 3 sản phẩm tạo là base Mannich có thể dự đoán được và cho hiệu suất cao.

Với amin bậc 1, base Mannich tạo thành có thể tiếp tục phản ứng tạo thành dẫn chất amin bậc 3 Amoniac cũng có thể sử dụng nhưng thường cho phản ứng liên tiếp là amin bậc 1, bậc 2, bậc 3

- Aldehyd

Formaldehyd thường, được dùng trong phản ứng Mannich Một vài aldehyd cao hơn cũng được dùng và có kết quả như aldehyd succinic được dùng trong tong hợp atropin

Tuy nhiên, phản ứng Mannich với các aldehyd khác formaldehyd sẽ có các ảnh hưởng đến khả năng phản úng, đến điều kiện phản ứng và tạo thành sản phẩm phụ không mong muốn Gốc hydrocarbon khác H gây cản trở không gian làm giảm tốc độ phản ứng aminoalkyl hóa Gốc R cũng có the gây

ra hiệu ứng điện tử làm giảm tốc độ phản ứng Hóa lập thể của sản phẩm tạo thành cũng bị ảnh hưởng Phản ứng Mannich tạo thành liên kết C-C mới nghĩa là có thể tạo thành các trung tâm không trùng vật ảnh, nếu trong họp chất chứa H linh động hoặc amin đã có 1 c bất đối thì sẽ tạo thành đồng phân base Mannich không đối quang Phản ứng phụ có thể xảy ra là phản ứng ngưng tụ aldol giữa sản phấm ị3-aminoaldehyd tạo thành với aldehyd ban đầu

- Hop chất có nguyên tủ’ H linh động

Bao gồm nhiều loại hợp chất khác nhau chứa H linh động đi từ các liên kết C-H khác nhau thường là C-H ở cạnh nhóm chức của aldehyd, ceton, acid, phenol, hợp chất dị vòng, dẫn chất acetylen hoặc đi từ liên kết N-H của một

số amin, amid; từ liên kết S-H của một số dẫn chất thiol; từ P-H của một số dẫn chất phosphinic Tương ứng với các loại hydro linh động nêu trên ta có

các quá trình: C-aminomethyl hóa, N-aminomethyl hóa, S-aminomethyl hóa, P-aminomethyl hóa.

♦♦♦ Điều kiện của phản ứng Mannich

- Tính ái nhân của amin

Phản ứng Mannich chỉ xảy ra khi trong phản ứng tính ái nhân của amin mạnh hơn tính ái nhân của hợp chất chứa nguyên tử H linh động, nếu ngược lại thì aldehydformic sẽ phản ứng ưu tiên với tác nhân methylen trong một sô phản ứng aldol hóa

♦> ứng dụng của phản ứng Mannich trong

Tổng họp các dẫn chất base Mannich của 5-cloroisatin vói 2- thioxo-4-thiazolidinon

Nhóm -N H amid của nhân 5-cloroisatin và -NH imid của nhân 2- thioxo-4-thiazolidinon có H linh động có thể tham gia phản ứng Mannich tạo

ra các dẫn chat base di-Mannich và mono-Mannich theo sơ đồ sau:

Do có 2 nhóm carbonyl hoạt hóa nên H ở -NH imid (N-3) linh động hơn ở -NH amid (N -l), do đó phản ứng Mannich ở N-3 dễ dàng hơn ở N -l.

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỬU

2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỪƯ

■ Các hoá chất chính (p-íluoroanilin, p-cloroanilin, piperidin, morpholin, /7-toluidin, aniline, dimethylamin 33%/H20 ) là các hoá chất dùng trong tổng hợp hoá học có hàm lượng từ 98 - 99,5% của hãng Merck (Đức)

■ Cloralhydrat (99%) của công ty hoá dược BDH (Anh)

■ Các hoá chất khác (hydroxylamin hydroclorid, natrisulfat, natri acetat)

và dung môi (ethanol, acid acetic băng, aceton, cloroform, DMF,

m ethanol ) của Trung Quốc

2.2 THIẾT BỊ NGHIÊN c ứ u

■ Bình 3 cổ với các kích cỡ khác nhau, sinh hàn hồi lưu, nhiệt kế, máy

khuấy từ gia nhiệt, cân kỹ thuật, bơm hút chân không, tủ sấy

■ Sắc ký lóp mỏng tiến hành trên bản mỏng Silicagel Kieselgel 6OF254

■ Phổ khối lượng (MS) ghi trên các máy HP - 989B - MS và máy LC - MSD - Trap - SL tại Phòng Phân tích cấu trúc - Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và trên máy LTQ Orbitrap XL™ tại Phòng Sắc ký khối phổ phân giải cao - Khoa Hoá học - Trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia Hà Nội

■ Phổ cộng hưởng từ proton 'H-NMR và cộng hưởng từ hạt nhân l3C- NMR ghi trên máy Bruker - AV500 tại Phòng Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨƯ

2.3.1 Phương pháp tổng hợp các dẫn chất 5-cIoroisatin và các dẫn chất base Mannich

■ Sử dụng các phương pháp thực nghiệm trong hoá học hữu cơ đê tông họp các sản phẩm dự kiến

■ Dùng phương pháp kết tinh lại để tinh chế sản phẩm thu được

■ Dùng SKLM để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng Soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm để nhận biết vết sắc ký

■ Xác định độ tinh khiết của các sản phâm tông hợp được băng phương pháp SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy

2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc

■ Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phântích phổ IR, MS, 'H-NMR, 13C-NMR Các số liệu phổ của các chấttổng họp được đối chiếu với tài liệu

vi lượng 96 giếng, theo 2 bước sau đây:

- Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính

- Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính

* Klĩáng sinh đối chiếu

- Ampicilin đối với vi khuấn Gram (+).

- Tetracyclin đối với vi khuan Gram (-)

- Nystatin hoặc Amphotericin B đối với nấm mốc và nấm men.

* Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm

Vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212)

Staphylococcus aureus (ATCC 12222)

Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli (ATCC 25922)

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923)

Nam raoc: Aspergillus niger (493)

+) Chuân bị mâu đôi chứng dương:

Dãy 1: Môi trường

Dãy 2: Kháng sinh Ampicilin + vi khuan Gram (+)

Kháng sinh Tetracyclin + vi khuân Gram (-)

Kháng sinh Nystatin + vi nấm kiểm định

+) Chuẩn bị mẫu đổi chứng âm:

Chỉ có v s v kiểm định, không có kháng sinh hay chất thử.

+) Đọc kết quả:

Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37 C/24 giờcho vi khuẩn và 30°C/48 giờ đối với nấm mốc và nấm men Kết quả dươngtính là ở nồng độ mà khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt không thấy có

vi sinh vật kiểm định phát triển giống như hình ảnh ở các chứng giếng dương Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa đê kiêm tra, có giá trị CFU<5

Mức dương ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử ở bước 2 đế tính giá trị MIC

Rước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các chất có hoạt tính

Các mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ở bước 1 được pha loãng theo các nồng độ thấp dần từ 5 - 10 thang nồng độ để tính giá trị tối thiểu mà ở đó

vi sinh vật bị ức chế phát triển gàn như hoàn toàn

Mau chất tinh khiết có MIC < 50 Ịig/ml là có hoạt tính

2.3.3.2 Phương pháp thử hoạt tính gãy độc tế bào (Cytotoxicity assay)

* Nguyên tắc

Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư người được tiến hành theo phương pháp của Likhiwitayawuid & c s [28] hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI)

- Dòng tê bào nghiên cứu:

Dòng Hep-G2 từ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

thử đã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại 3 lần trên phiến

OD (mầu) - OD (ngàv 0)cs% = -,, f - X 100

OĐ (D M SO ) -OD (ngày 0)

Giá trị c s % sau khi tính theo công thức trên, được đưa vào tính toán

Excel đế tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3

lần theo công thức của Ducan như sau : Độ lệch tiêu chuân ơ

Các mẫu có biếu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra đem thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50 Giá trị IC50: dùng giá trị logarit của đường cong phát triển tể bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50

Chưong 3 KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ ư

3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC

Trong luận văn này, chúng tôi đã tiến hành tổng họp các dẫn chất của 5-cloroisatin và một số dẫn chat base Mannich của chúng, theo sơ đồ sau:

Chúng tôi tiến hành tổng hợp 5-cloroisatin bằng phản ứng Sandmayer

1919 theo sơ đồ sau:

Quá trình tông họp gôm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Cho /?-cloroaniiin phản ứng với cloralhydrat và hydroxylamin

trong môi trường acid thu được /?-cloroisonitrosoacetani 1 id (1’)

- Giai đoạn 2 : Đóng vòng /?-cloroisonitrosoacetanilid tạo ra 5-cloroisatin (1) dưới tác dụng của H2SO4 ở 80°c

80°c'O

cách thuỷ và khuấy cho tan hoàn toản Thêm từ từ dung dịch của 12,76g (0,lm ol) /7-cloroanilin trong 60ml nước cất và 8 ,6ml acid hydroclorid đặc Cuối cùng cho từ từ dung dịch 22g (0,316mol) hydroxylamin hydroclorid trong 100ml nước Khuấy và đun nóng cách thuỷ Hỗn hợp được đun nóng ở 90°c khoảng 40 - 45 phút, rồi đun sôi mạnh dung dịch phản ứng trong 2 phút thì kết thúc phản ứng Để nguội Lọc hút Rửa tủa bằng nước lạnh Kết tinh lại trong nước, sấy khô thu được 17,03g sản phẩm là tinh thế hình kim màu trắng

xám, có nhiệt độ nong chảy 163 - 165°c, hiệu suất 85,8% tính theo p-

cloroanilin

b Tông hợp 5-cỉoroisatin

Cho 62ml acid sulfuric đặc vào bình cầu Đun nóng đến khoảng 60°c Vừa khuấy, vừa thêm từ từ 13g (0,065mol) /?-cloroisonitrosoacetanilid đã sấy khô vào, duy trì nhiệt độ trong khoảng 60 - 70°c Khi thêm hết thì tăng nhiệt

độ lên 80°c Duy trì ở nhiệt độ này trong 15 phút thì kết thúc phản ứng Để nguội hỗn họp phản ứng đến nhiệt độ phòng rồi rót từ từ vào cốc có 845g nước đá Đe yên 30 phút Lọc hút, rửa tủa bằng nước lạnh cho đến hết phản ứng acid Kết tinh lại trong ethanol, sấy khô thu được 10,64g sản phẩm là tinh tlìể hình kim màu đỏ gạch, có nhiệt độ nóng chảy 252 - 254°c, hiệu suất 80,6% tính theo chất (1’)

Khả năng hòa tan trong một so dung m ôi: Sản phâm khó tan trong

nước; tan trong methanol, ethanol, aceton; dễ tan trong DMF

Độ tinh khiết: Kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với hệ dung môi khai

triển là CHC13 : MeOH (13 : 1), dung môi hoà tan là aceton Soi đèn tử ngoại thu được một vết rõ có Rj = 0,60

3.1.2 Tổng họp dẫn chất ngưng tụ của 5-cloroisatin với 2-thioxo-4- thiazolidinon và imidazolidin-2,4-dion

5-cloroisatin có nhóm carbonyl ở vị trí (3 có khả năng tham gia phản ứng ngưng tụ với 2-thioxo-4-thiazolidinon và imidazolidin-2,4-dion có nhóm

methylen hoạt động ở vị trí 5, để tạo hợp chất (2), (3).

Phản ứng được tiến hành trong dung môi acid acetic băng, với sự có

m t của natriacetat khan

3.1.2.1 Tổng hợp 5-(2 ’-0X0-5 ’-cloro-3 ’-indolií yliden)-2-thioxo-4-thiazolidi- non (2)

Sơ đô phản ứng:

■ Dụng cụ gồm: Bình cầu 3 cô dung tích 250ml, sinh hàn hồi lưu, máy

khuấy từ gia nhiệt, nhiệt kế

■ Tiến hành:

Cho vào bình cầu 6,7g (0,04mol) 5-cloroisatin, 9,84g (0,12mol) natri acetat khan, 5,43g (0,04mol) 2-thioxo-4-thiazolidinon và 80ml acid acetic băng Đun hồi lưu cách cát trong vòng 6h Sau 6h thì kết thúc phản ứng, đố hỗn hợp ra cốc có mỏ dung tích 250ml Đe nguội cho kết tinh, sau đó đem lọc hút chân không, rửa bằng nước đá đến khi hết acid, sấy khô, kết tinh lại trong hồn hợp dung môi EtOH : DMF (1 : 1), sấy khô, thu được 10,15g sản phẩm

+ Hiệu suất: 85,6%

+ Nhiệt độ nóng chảy 336 - 338°c

+ Khả năng hòa tan trong một số dung môi: Dễ tan trong DMF, tan trong aceton, ít tan trong ethanol lạnh, tan nhiều hơn trong ethanol nóng, khó tan trong nước

+ Độ tinh khiết: Kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi khai triển CHCI3

: MeOH (20 : 1), soi đèn tử I.goại cho một vết gọn, rõ có Rf = 0,75

■ Dụng cụ gồm: Bình cầu 3 cố dung tích 250ml, sinh hàn hồi lưu, máy

khuấy từ gia nhiệt, nhiệt kế

■ Tiến hành:

Tổng hợp tương tự chất (2), hỗn hợp phản ứng gồm: 7,25g (0,04mol) 5- cloroisatin, 9,84g (0 ,12mol) natri acetat klian, 4g (0,04mol) imidazolidin-2,4- dion, 80ml acid acetic băng

Kết tinh lại trong EtOH : DMF (1 : 2), sấy khô, thu được 6,lg sản phẩm

có màu vàng cam

■ Kết quả:

+ Hiệu suất: 58,1%

+ Nhiệt độ nóng chảy: 396 - 398°c.

+ Khả năng hòa tan trong một số dung môi: Dễ tan trong DMF, tan trong aceton, ít tan trong ethanol lạnh, tan nhiều hơn trong ethanol nóng, khó tan trong nước

+ Độ tinh khiết: Kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi khai triển CHCI3 : MeOH (20 : 1), soi đèn tử ngoại cho một vết gọn, rõ có Rf = 0,78

3.1.3 Tổng họp một số dẫn chất base Mannich

3.1.3.1 Tồng hợp dẫn chất base mono-Mannich của 5-(2’-oxo-5’-cloro-3’- indolinyỉìden)-2-thioxo-4-thiazoỉidinon (4-10)

Trong cấu tạo phân tử chất (2) có hai nguyên tử hydro linh động Đó là

H ở nhóm -N H amid của họp phần 5-cloroisatin và H của nhóm -N H imid của hợp phần 2-thioxo-4-thiazolidinon, vì vậy theo dự kiến khi tham gia phản ứng Mannich với amin thơm và formaldehyd hai nguyên tử hydro này đều có khả năng tham gia phản ứng đe tạo thành dẫn chat base di-Mannich Tuy nhiên, qua quá trình thực nghiệm và phân tích phổ, chúng tôi nhận thấy rằng ở điều kiện nhiệt độ 60-70° c , dung môi là ethanol, thời gian phản ứng thích hợp 2-6 giờ thì sản phẩm tạo thành là dẫn chất base mono-Mannich với vị trí phản ứng là H của nhóm -N H imid của hợp phần 2-thioxo-4-thiazolidinon theo sơ đồ sau:

o Cl

■ Dụng cự Bình cầu 3 cổ dung tích 100ml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy

từ gia nhiệt, nhiệt kế

■ Tiến hành:

Cho vào bình cầu 40ml ethanol, 0,38g (0,0045mol) piperidin, khuấy trộn đều, thêm 0,5ml (0,006mol) formol Thêm từ từ 0,593g (0,002mol) chất (2) khuấy ở nhiệt độ phòng trong vòng lh Tiếp tục tăng nhiệt độ hỗn họp phản úng lên 60°c khuấy trong 2h, đổ ra cốc thủy tinh Đe kết tủa Lọc hút