Tổng hợp một số dẫn chất của 5 cloroisatin và thăn dò tác dụng sinh học

Bộ YTỂ B ộ G IÁ O DỤ C VÀ Đ À O TẠ O T R Ư Ờ N G Đ A• I H O• C Dươc • H À N Ở• I HỒNG LÊ HIẾU HẠNH Tổ NG Hợ• P Mộ• T Số DẪN CHẤT CỦA 5-CLOROISATIN VÀ THĂM DỊ TÁC DUNG SINH HOC • • L U • N V Ă N T H A• C SỸ CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ Dươc • H O• C D ược PH Ẩ M VÀ BÀ O C H Ế M à SỐ: 60.73.01 N gư ời hư ớng dẫn khoa học: Ts Trần Viết H ùng Ts Đ inh Thi• Thanh Hải TRƯỞNG ĐH DƯỢC HÀ NỘỈ T H Ư VSỆN Ngày rt tháng é ‘năm20Í.L Số HÀ N Õ• I 2010 ĐKCB: .CU^.CGn.SSỒ - LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc TS T rần Viết Hùng, TS Đinh Thị Thanh Hải - Bộ mơn Hóa hữu - Trường đại học Dược Hà Nội, thầy dành nhiều thời gian tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ động viên tơi q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quang Đạt, thầy cô anh chị kỹ thuật viên mơn Hóa hữu - Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ, động viên cho ý kiến vô quý báu thời gian nghiên cứu làm luận mơn Trong q trình thực khóa luận tơi nhận nhiều giúp đỡ cá nhân, đơn vị trường, xin chân thành cảm ơn: ThS Bùi Thị Nhung - phòng sắc ký khối phổ phân giải cao, ThS Nguyễn Thị Son phòng Hóa vật liệu - Khoa Hóa - Trường đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội ThS Đặng Vũ Lương - phòng cấu trúc - Viện Hóa học - Viện Khoa học công nghệ Việt Nam; PGS TS Lê Mai H uong phòng Thực nghiệm sinh học, Viện Hóa học họp chất thiên nhiên - Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp, người giúp đỡ động viên suổt năm học vừa qua tạo điều kiện đê hồn thành khóa học Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2010 Học viên Hoàng Lê Hiếu Hạnh MỤC LỤC Trang CHÚ GIẢI KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIế T TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH, s ĐỒ ĐẶT VẤN ĐÈ Chương i TỐNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu tác dụng sinh học dẫn chất Isatin 1.1.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng lao 1.1.2 Tác dụng kháng virus .7 1.1.3 Tác dụng kháng tế bào ung th 1.1.4 Tác dụng ức chế Monoamino-oxydase (M A O) 1.1.5 Các tác dụng k h ác 10 1.2 Các phương pháp tổng họp Isatin dẫn chất 10 1.2.1 Các phương pháp tống họp dị vòng isatin 10 1.2.2 Các phương pháp tổng họp dẫn chất isatin 13 Chương ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 22 2.1 Nguyên liệu nghiên c ứ u 22 2.2 Thiết bị nghiên c ứ u 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp tổng hợp dẫn chất 5-cloroisatin dẫn chất base M annich 23 2.3.2 Phương pháp xác định câu trúc .23 2.3.3 Phương pháp thử tác dụng sinh h ọ c 23 Chuông Kế T QUẢ NGHIÊN c ứ u 27 3.1 Tổng họp hóa học .27 3.1.1 Tổng hợp 5-cloroisatin 28 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất ngưng tụ 5-cloroisatin với 2-thioxo-4thiazolidinon imidazolidin-2,4-dion 30 3.1.3 Tổng hợp số dẫn chất base Mannich .32 3.2 Kiểm tra độ tinh khiết xác định cấu trúc .45 3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết chất tổng hợp .45 3.2.2 Xác định cấu trúc chất tổng hợp 46 3.3 Thử tác dụng sinh học 50 3.3.1 Thử tác dụng kháng khuân, kháng nâm 51 3.3.2 Thử hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay) 52 Chuong BÀN L U Ậ N 53 4.1 v ề tổng họp hóa học 53 4.1.1 v ề phản ứng tổng hợp 5-cloroisatin 53 4.1.2 v ề phản úng ngưng tụ 5-cloroisatin (1) với 2-thioxo-4thiazolidinon imidazolidin-2,4-dion 53 4.1.3 v ề phản ứng M annich 53 4.2 v ề xác định cấu t r ú c 55 4.2.1 v ề phổ hồng ngoại (IR) 55 4.2.2 v ề phổ khối lượng (MS) 56 4.2.3 v ề phổ cộng hưởng từ proton ('H-NMR) l3C (l3C-NMR) chất (2), (3) 61 4.3 v ề tác dụng sinh học 63 K ế t l u ậ N VÀ KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CHÚ GIẢI KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIế T TẮT AcOH Acid acetic l3C-NMR Phổ công hưởng từ hat nhân carbon 13 CFU Số đơn vị khuẩn lạc (Colony forming unit) CTPT Công thức phân tử DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxyd EtOH Ethanol ' h -n m r Phố cộng hưởng từ proron Hep-G2 Te bào ung thư gan người (Hepatocellular carcinoma) EI-MS Phổ khối iượng bắn phá electron IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) KLPT Khối lượng phân tử LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ MeOH Methanol MIC Nồng độ ức chế tối thiếu (Minimal inhibitory concentration) MS Phổ khối lượng (Mass spectroscopy) NMR Pho cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) PTL Phân tử lượng (Khối lượng phân tử) SKLM nnO nc Sắc ký lớp mỏng Nhiệt độ nóng chảy vsv Vi sinh vật I DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Hiệu suất số vật lý chất tổng hợp 43 Bảng 3.2 Tóm tắt kết phân tích sắc ký lớp mỏng 45 Bảng 3.3 Các dải hấp thụ đặc trưng phổ IR (cm"1) 47 chât tông họp Bảng 3.4 Số liệu phân tích phổ khối lượng chất tổng họp 48 Bảng 3.5 Số liệu phổ cộng hưởng từ proton ('H-NMR) 49 chât tông hợp Bảng 3.6 Số liệu phổ cộng hưởng từ carbon 13 ( 13C-NMR) 50 số chất tổng họp Bảng 3.7 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 51 số chất tổng họp Bảng 3.8 Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người số chất tổng họp 52 DANH MỤC CÁC HÌNH, s o ĐỒ Trang : Sơ đồ phân mảnh chất 57 Hình 3.2 : Sơ đồ phân mảnh chất 58 Hình 3.3 : Sơ đồ phân mảnh chất 59 Hình 3.4 : Sơ đồ phân mảnh chất 10 60 Hình 3.5 : Sơ đồ phân mảnh chất 12 61 Hình 3.1 ĐẶT VẨN ĐÈ Ngày nay, trình độ khoa học kỹ thuật cơng nghệ ngày phát triển, việc phát bệnh tật người khơng khó khăn trước Nhưng vấn đề nan giải đặt cho ngành Y tế nói chung ngành Dược nói riêng nghiên cứu kịp thời loại thuốc có hiệu phòng chữa bệnh Khi khoa học đại phát triển, bên cạnh thuốc có nguồn gốc tự nhiên thuốc có nguồn gốc tổng họp Hóa dược đóng vai trò quan trọng nghiên cứu phát triển thuốc Trong lĩnh vực tổng hợp Hóa dược, nhà nghiên cứu tìm cách tạo chất mới, dự đốn có hoạt tính cao độc tính giảm cách biến đổi cấu trúc chất có tác đụng dược lý biết đến sử dụng làm thuốc Những năm gần đây, isatin dẫn chất dãy chất hữu nhà nghiên cứu quan tâm tác dụng sinh học phong phú đa dạng Nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, kháng virus, kháng lao nhiều tác dụng dược lý khác có triển vọng Trong đó, dẫn chất 5-halogen isatin cụ thể 5-cloroisatin, dẫn chất Mannich, dẫn chất ngưng tụ với 2-thioxo-4-thiazolidin imidazolidin-2,4-dion ý nghiên cứu [2 - 13]; [1 - 18]; [20 28]; [31-35], Xuất phát từ nhũng thành tựu nghiên cứu trên, với mong muốn tìm dẫn chất isatin có hoạt tính cao, ứng dụng lâm sàng, chúng tơi thực đề tài: “Tống họp số dẫn chất 5-Cloroisatin thăm dò tác dụng sinh học” với mục tiêu sau đây: Tổng hợp 5-cloroisatin số dẫn chất Thăm dò tác dụng sinh học (kháng khuấn, kháng nấm kháng dòng tế bào ung thư người) chất tổng hợp Chúng hy vọng đề tài đóng góp nhỏ vào việc nghiên cứu, tìm kiếm chất có hoạt tính sinh học thuộc dãy chất isatin C h u o n g T Ố N G Q U A N 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN c ứ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA DẪN CHẤT ISATIN Isatin dẫn chất chất hữu nghiên cứu có hệ thống mặt hóa học tác dụng sinh học Rất nhiều cơng trình nghiên cứu tổng hợp thử tác dụng sinh học dẫn chất isatin cho thấy chúng có tác dụng phong phú đa dạng tác dụng kháng khuân, kháng nấm, kháng lao, kháng virus, chống phân bào, ức chế men Monoamino-oxydase (MAO) 1.1.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng lao Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, dẫn chất Isatin nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Năm 1980, 17 dẫn chất 5-iodo 5-cloro isatin Maysinger D cộng [32] tông họp: N -N H R X = ị C1 R = H, COCH3, CH3, CSNH2 X = I, C NRR' = NHCH2CH2OH , N(CH2CH2OH)2 , N(CH(CH3)2) N(CH2CH2CI)2 ,n o _ ỳ Thử tác dụng 11 chủng vi khuẩn chủng nấm, nhiều chất có tác dụng mạnh Trong số có dẫn chất base Mannich diisopropylamini dẫn chất 5-iodoisatin 5-cloroisatin có MIC 100|!g/ml Các tác giả H A N H -M -D M S O -1 H Ọ CD CNJ CN CO in T- Tf r - c p r - i v T t o i C v i ì u o i ^ T - o o c D C D c o ỉ c o i ũ N Ợ í T r o c p i ọ c o c v i ^ - r v i ^ T - c p c N i c o Ý ^ ^ P ^ ^ ^ ! ^ ! CO CO CO F'-'- CO CO LO op c ọ c p u } ^ ộ f O < N ^ a ì ọ S c p c p ^ Ợ ) ( ữ N c p ^ ^ O ( N T - p ( õ ^ N Ộ c o N c ọ ^ c ọ T - Ộ Õ Ị Õ C S Ị T - T - O O Ơ oo r r^- In IỌ LO 10 Tf ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ r - Ọ Ọ O Ọ Ọ Ó Q Ị C n ộ Ỉ ) S N S i n u ị T f T r T - r - L T t r í ^ T í c Ọ ( q i D C Ọ ) l Ọ T } ; r^ r^ r^ r^ f^ r^ r^ r^ r^ r^ r^ r^ r^ c õ c £ )< £ > c õ c D c õ c õ < £ > c £ > c õ c õ c ô c õ ULLLLL LU u I I I i J J JJJ J J J J J J JJJ J J J J J J J J C urrent Data P aram eters NAME HANH_M7 EXPNO p ROCNO F2 - Acquisition P aram eters D ate_ 20100920 Time 9.14 INSTRUM av500 PROBHD mm Multinucl PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 16 DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2769001 se c RG 161.3 DW 50.000 usee DE 6.00 u see TE 303.4 K -N H D1 1.00000000 sec MCREST MCWRK 0.00000000 s e c 0.01500000 se c ======== CHANNEL f1 ==== NUC1 1H P1 11.00 u see PL1 -3.00 dB SF O I 500.1335009 MHz F2 - Processing param eters SI 32768 SF 500.1300131 MHz WDW EM SSB 0.30 Hz LB GB 1.00 PC 15 14 13 12 11 10 ' I *’ ■r — 'T '-' / CD LO o T-— CD ỉIT ) 00 ịi— V h - CNl CjO o ó X— CO CNJ T— ppm o kp P ịcsi Phụ lục 29: Phổ cộng hu'O'ng từ proton (’H-NMR) chất 11.227 H A N H -M -D M S O -1 H O O N t- N - C O Ơ ) C O ( Ũ T - C O ỊO O) CO LO N i g ro ro ọ c p C N C M c p y — CO ùõ o o cr> lõ T- ạ> C O C O rO C Ọ ^ C Ọ T -ự D tíỌ Ợ Ị o co D ^ C Ộ ^ -^ - ^ -ríC Õ C Ọ C O O s l o 00 CỌ cọ C O r C O LjÓ lọ UT5 'Cj- C Ĩ C Ọ C\Ị Csi CNÌ CSJ C N CNJ C N CNi CsJ CNJ CNÌ CNJ csi ^^cõcôcõcõcõcôcõcôcõ is CN IJ —LJL J J-J C urrent D ata P a ram eters NAME HANH_M9 EXPNO PRO CNO F2 - Acquisition P aram eters D ate_ 20100710 Time 11.26 INSTRUM av500 PROBHD mm Multinucl PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT DMSO 16 NS DS 10964.912 Hz SWH 0.167311 Hz FIDRES 2.9885373 sec AQ RG 256 45.600 u see DW 6.00 u see DE 302.4 K TE 1.00000000 sec D1 0.00000000 s e c MCREST 0.01500000 sec MCWRK NUC1 P PL1 SF O I =CHANNEL f1 ===== 1H 11.00 u s e e -3.00 dB 500.1340010 MHz F2 - P ro cessin g param eters 32768 SI 500.1300051 MHz SF EM WDW SSB 0.30 Hz LB GB 1.00 PC 0 13 12 11 ppm 10 IỊ ro rf Ở > Ô CN CO Ị CĨ LỌ ị CĨ CsiI CNJ C\J CƠ Phụ lục 30: Phổ cộng hu’O’ng từ proton ('H-NMR) chất H A N H -M -D M S O -1 H COƠỈCDCNCOCnCŨCNiư^CO COCNt- t-^ C O C N J C vJ t-CT} r^ r-^ r-^ r^ r^ r^ h ^ r^ h ^ r^ C N IN N C O C N C O ^ Ơ IƠ iO Ọ O g T -O T n Ọ N b in ^ c Ĩ T íc õ õ r-x -o ợ Ịtõ p ^ ọ o ĩn r^ K N ữ ^ -^ ^ c o r-T -T -o o N N L O in in ^ c ó c ô c õ c ó c ó c ô c ô c r > c r > c ó c N C \ic N Ì c \ic \ic \i C urrent D ata P aram eters NAME HANH_M2 EXPNO PROCNO F2 - Acquisition P aram eters D ate_ 20100810 Time 16.16 INSTRUM av500 PROBHD mm Multinucl PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 32 DS SWH 10964.912 Hz FIDRES 0.167311 Hz AQ 2.9885373 s e c RG 322.5 DW 45.600 u see DE 6.00 u see TE 301.7 K D1 1.00000000 se c MCREST 0.00000000 s e c MCWRK 0.01500000 s e c ======== CHANNEL f1 ==== NUC1 1H P1 11.00 u see PL1 -3.00 dB SFOI 500.1340010 MHz F2 - P rocessing param eters SI 32768 SF 500.1300048 MHz WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 13 12 11 oo o 10 T" J r [kN / \ LO IT) N CO ppm O J ICO o p T_ T— 1T— / ' CD CĨ o ịo l^í* IS- ịCO 00 o iTf Phụ lục 31: Phổ cộng hưỏng từ proton ('H-NMR) chất 10 11.003 H ANH-H1-DM SQ -1H ir> N -ht-ũT irO o rLo cỌo T d^ oo rì^kcN O -ọc omc N r aCc Tó C c õi nòh^- rOo Tr -t CỌCĨCOCỌCOCỘCÕCỌCOCNỊ4CVJCNJCNCNJC\JCNI in o o ợ> to i f •'t ^ cn Ọ T- CN LO CN lib in ÌĨlộ un CO cò cõcó có CNI Csj COin V- h- LO" ọ ỠS COoo COS- to - LỌ xt i f ^ CN c \i c \j CN CN c \i o < ' Current Data Parameters NAME HANHH1 EXPNO PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20100920 Time 15.38 INSTRUM av500 PROBHD mm Multinucl PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT DMSO NS 16 DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2769001 sec RG 1611.3 DW 50.000 usee DE 6.00 usee TE 303.8 K D1 1.00000000 sec MCREST MCWRK 0.00000000 sec 0.01500000 sec ======== CHANNEL f1 ==== NUC1 1H P1 11.00 usee PL1 -3.00 dB SFOI 500.1335009 MHz F2 - Processing parameters SI 32768 SF 500.1300131 MHz WDW EM SSB 0.30 Hz LB GB 1.00 PC 12 11 ppm 10 y / \ N ^ 1^1* o ^ 1«^* LO CNỊ o CN Phụ lục 32: Phổ cộng huỏng từ proton (‘H-NMR) chất 11 HANH-H2-DMSO-1H -c—-t— X— C \J O > C Ũ ^ ^ O Ơ )ơ )( ^ (» C Ọ C O C O Ơ )C O C D O J C Ọ IỘ r -N a Ị(ũ < N C O N (Sj •*— o ĩ C ^ C N C N i r - O N C O O N D O Ơ Ì T - T - O Ơ Ì C O C O C O N ^ ^ ^ t N ^ ; I CD CD CO (D C O r-O CỌ CNỊ CNi O J c ọ I— ọ22 ọ w cọ Ũ_ŨC_ ^ ^ ^ ^ ^ T ^ c ọ ^ C N ^ T - ọ c T ịc D ^ L Ọ ^ T ^ ^ ^ ^ c ộ c ọ c ộ c ọ ^ c õ c ò c c ò c ò c ó c ò c ó c ò c c ò CNÌ csj CNÍ CNÌ Cvi CNÌ cvi CNÌ c\i CNÌ CNÍ CNJ T—- T—■ ũ l ũ l ũ ũ I I I I \ i ) J ) J J J - l ^ L i U L r U L a U i - J Current D ata P a m e te rs NAME HANHH2 EXPNO PROCNO F2 - Acquisition P aram eters D ate_ 20100920 Time 9.00 INSTRUM av500 PROBHD mm Multinucl zg30 PULPROG 65536 TD SOLVENT DMSO 32 NS DS 10000.000 Hz SWH 0.152588 Hz FIDRES AQ 3.2769001 se e 161.3 RG 50.000 usec DW DE 6.00 u sec 303.5 K TE D1 1.00000000 se e 0.00000000 s e e MCREST 0.01500000 se c MCWRK NUC1 P1 PL1 S F 01 1H 11.00 u sec -3.00 dB 500.1335009 MHz F2 - P rocessing p aram eters 32768 SI SF 500.1300131 MHz EM WDW SSB 0.30 Hz LB GB 1.00 PC ~rT " 11 / / k o o o T— ■"3co co X— 10 ‘ ‘ 1" 'rT II Ị! / ppm \ c o co o *^r CNJ o> l ò CNJ o o •c— hc :> oo 04 ^- xí* : co ị Cvi d3 Is"; r^UD có CNJ Phụ lục 33: Phổ cộng hưởng từ proton (’H-NMR) chất 12 H A N H —N T R —D M S O —C C P D \D VjO r- «sr LO *3< o r- cr> C \I •cr c o Ĩ CO CD I—I c \) '-D VC- o o r - ~ u L T ) r o « —( O r - Current Data Parameters NAME HANH_NTH EXPNO PROCNO \ F2 - Acqu isition Parameti 20100822 Date_ 14 02 Time avSOO INSTRUM ram Multinucl PROBHD zgpg30 PULPROG 65536 TD DMSO SOLVENT 256 NS DS 31446.541 : SWH 0.479836 ; FIBRES 1.0420883 AQ 8192 RG 15.900 « DW 6.00 ’ DE 304.7 ] TE 2.00000000 D1 0.03000000 dll 1.89999998 DELTA 0 0 0 0 M CREST 0.01500000 MCWRK Cl NUC1 PI PL1 SFOl CHA N N E L fl ===== 13C 8.00 ======== CHANNEL f2 waitzl6 CPDPRG2 1H NUC2 88 00 PCPD2 - 00 PL2 15.06 PL12 2 0 PL13 500.1320005 SF02 F2 - Proces s i n g paramete 32768 SI 7578538 SF EM WDW SSB 00 LB GB in 220 200 180 160 m m 140 120 100 80 Phụ lục 35: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 60 40 20 13c (13C-NMR) chất ppm -1 0 I 125.7716224 ! PHâ LC 36 PHIU TR LI KT QU TH HOẠTTÍNH KHÁNG VI SINH VẶT KIỂM ĐỊNH « Chú thích: Chất 2- NTR, chất 4-M3, chất 5-M4, chất -M , chất 7-M5, chất 8-M7, chất 9M9 KÉT QUẢ N ồng động ức chế tối thiểu (M IC : ng/m l) STT Kí hiệu mẫu Vi k h u ẩ n G r(-) E, coỉi Vi k h u ẩn G r(+ ) N ấm mốc N ấm m en p, aeruginosa B subtilỉis S aureus A, nìger F oxyspomm s cerevisiae c albicans (_) 50 25 (-) (-) (-) M3 M4 50 (-) 5u 25 (-) 50 (-) (-) M5 50 (-) 50 (-') (-) 50 ■(-) (-) M6 50 (-) 50 (-) (-) 50 (-) (-) s M7 50 (-) 50 (-) (-) 50 (-) (-) MS 50 (') 50 (-) (-) 50 (-) (-) M9 25 (-) 25 (-) (-) 50 (-) (-) N TR (-) (“) 50 25 í-ì V/ (-) (-) (-) (-) N hận xét: Mâu M3 NTR biêu hoạt tính kháng VSVKĐ Mầu MS, M 6, M7, M 8, M.9 biểu hoạt tính kháng VSVKĐ ^^fM ác-jiliận Viện Ịpịjở IG ‘Hí /:/'■ ;,'efeuẰH\Ý 50 'í HỢP u -y ị p * ft ị c k*'' Q; t ukềk Phụ trá c h phòng W ^ N guòl đọc k ết quă l/J J if! Ụ PG S.TS Lê M H ương ThS T rầ n Thị N h H ằng VIỆN KHOA HỌC VẢ CÔNG NGHỆ VIỆT NẮM VIỆN HOÁ IiỌ C CÁC HỢP CHÁT THIÊN NHIÊN Phòng Sinh học thực nghiệm Institute of Natural Products Chemistryi 1NPC) Vietnamese Academy of Science and Technology, Hanoi, Vietnam (VAST) The Bioassay Lab ! Hoàng Quốc Việt - cẩu Giấy - Mà Nội - Việt Nam Tel: 844-8361899; Fax: 844-7564390: Email: sinhoclhucnụhicmíếmahoo.com Sổ: /TLK.Ọ PH IẾU T R Ả LỜ I K ÉT QUA HỌA I TÍNH KHẢNG VI SINH' VẠT K IỂM ĐỊNH (AN TIM ICRO BIAL ASSAY) Người aửi mẫu: Nguyễn Minh Đức Địa chi: Trường Đại học Dược Loại mẫu: 08 mẫu tinh PHƯƠNG PHÁP PHẨN TÍCH Hoạt tính khảng Vi sinh vật kiểm định dược tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh mẫu chiết thực phiến vi lượng 96 giena (96-well microtiter plate) theo phương pháp dại Vandcr Berghcr Vlietlinck (1991), MCKane, L., & Kancỉcl (1996) Các chửng vi sinh vật kiếm định: -Vi khuẩn Gr (-): Escherichia colỉ (A 1CC 25922 ) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923 ) - Vi khuẩn Gr (+):Bacillus suhíiỉlis (ATCC 27212 ) Staphylococcus aureus (A T C C 12222) - Nấm sợi: Aspergillus niger (439) Fusariwn oxysporum (M42) - Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754) Saccharomyces cerevisiae (Sỉ l 20) C h n g d n g t in h : + Ampicilin cho vi khuẳn Gram (+) + Tctrreylin cho vi khuân Gram (-) + Nystatin Amphotericin B cho nấm sợi nấm men Kháng sinh pha DMS0100% với nồng độ thích hợp: Ampixilin: 50mM; Tciracylin: lOmM; Nystatin: 0,04mM Chứng âm tính: Vi sinh vật kiểm định khơng trộn kháng sinh chất thử Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: - Mơi trường đuv trì bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB)-Sigma cho nấm men nấm mốc Vi khuẩn môi trườrrn Trvpcasc Soya Broth (TSB)-Sigma - Mơi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mv) cho vi khuân, Mvco phi! (Difco, Mỹ) cho nấm Tiến hành thỉ nghiệm: Cốc chủna; kiểm định hoạt hoá pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Me H and tiến hành thí nẹhiệni, Đọc kết quá: Két đọc sau ủ phiến thí nghiệm tủ ẩm 37 G/24 cho vi khuẩn 30°C/48 ạiờ nấm sợi hẩm men Kết dương tính nồng độ mà khơng có vi sinh vật phát triển Khi ni cấy íại nồng độ môi trường thạch dĩa để kiếm tra cỏ giá trị CFƯ< Nồng (lộ ửc chế íối thiểu (MĩC-Mỉnimum inhibitory concentration) chat cỏ hoại tinh: Các mẫu có hoạt tinh sàng lọc ban đầu dược pha íỗng theo thang nona độ thấp đần, từ (5- 10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà đỏ vi sinh vật bị ức ché phát triển gần hồn tồn, Mầu thơ có MIC < 200 ỊJg/mí; mẫu tinh cỏ MIC < 50 ụg/ml có hoạt tinh PHỤ LỤC 37 PHIÉU TRẢ LỜI KÉT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH CÂY ĐỌC TÉ BÀO Chú thích: Chất 2- NTR, chất 4-M3, chất 5-M4, chất -M , chất 7-M5, chất 8-M7, chất 9M9 K Ẻ T Q U Ả T H ự e NGHIỆM Dòng tế bào Hep-G2 Kết luận Kí ỉliệu mẫu STT Cell survival (%) 100 ,0 +0,0 /ọì** Chúng (+) 1,47 ±0,3 Dương tính 'l NTR 56,7 ± 0,3 Âm tính M3 80,8 ± 0,7 Ầm tính M4 70,2 ± 0,8 Âm tính M.5 73,2 ± 0,4 Ảm tính M6 51,5+0.7 Âm tính M7 52.0 ± 0,2 Am tính 99,5 ± 0,5 Am tính 64,6 ± 0,9 Am tính oo 1i DM SO M9 10 Xác-nhận Viện >íifĩ Ỷ 'ơ o W - ptf' )N - Truỏìig lO N G HỢP ỊÍ* ỳ Ảm tính HĨA.ÍÌ0C 4\ ị \ ' , , r I Q(CÁCMil CHATi§l l/CL ‘ ll\TH!ẺN m f c f f f - • V *i f ( \k êẲ Ấ Ấ J^ r" / r',i • / »iể %'ẰnPGS.TS Lê Mai Hương 'ậMỳị p NginVi đọc kết // ThS Trần Thị Hồng Hà ị VÍỆN K H O A ỉ ỈỌC /VA CÔNG NGHỆ VII; I NAM VIỆN HOÁ n ọ c CÁC HỢP CHẮT TH IÊN NHIÊN P h ò n g S in h h ọ c th ự c n g h iệm INPC Vietnamese Academy of Science and Technology, Hanoi, Vietnam (VAST) institute of N atural Products Chem istry (INPC) The Bioassay Lab 18 Hoảng quốc Việt- c ầ u Giấy- Hà Nội- Việt Nam Tel: 844-8361899; Fax: 844-7564390; Email: sinhocthucnghiem@ yahoo.com Số: /T L K Q PHIÉU TRẢ LỜI KÉT QUÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỌC TE BÀO (CYTOTOXICITY ASSAY) Người gửi mẫu: Nguyễn Minh Đức Địa chỉ: Đại học D ợc Hà Nội Số lượng mẫu: 08 Loại mầu: Mầu tinh Ngày nhận mẫu: 5/5/2010 Ngày trả lời kết quả: 13/5/2010 PHƯƠNG PHÁP PHÁN TÍCH Theo phương pháp Skehan & c s (1990) Likhiwitayawuid & CS(1993) đư ợc áp dụng Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia Mỹ (NCI) vả trư ờng đại học Dược, đại học Tống hợp Illinois, Chicago, Mỹ * Dòng té i)ào Dòng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma - Ung thư gan) từ Viện VSDT TU M ôi trư n g n u ô i cấy tể bào DME'M (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) Có bồ xung L- glutamine, Sodium piruvat, NaH C 03, PSF(Peníxiỉlin- streptom ycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids): 10% BCS (Bovine Calf Serum) Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichioro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhọdamine B); Acid Acetic Các dụ ng cụ dù ng lần: Bỉnh nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giềng, pipet pasteur, đầu tuvp cho micropipet Chắt chuẩn chứng dương tính: Dùng chất chuấn cỏ khả náng diệt tế bào: Eliipithine, Vinblastine Taxol pha DMSO - Đọc máy ELISA bước sóng 495-515nm Tính k ế ỉ quả: Giá trị CS: khả sống sót tế bào nồng độ chất thử tinh theo % so với đối chửng Dựa kết đo chúng OD (ngày 0), DMSO 10% so sánh với giá trị OD trộn mẫu để tìm giá trị CS(%) theo cơng thức: OD (mâu) - OD (ngày 0) cs% = - X 100 OD (D M S O )-O D (ngày 0) Giá trị c s % sau tính theo cơng thức trên, đự 0’c đưa vào tính tốn Excel để tìm % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn phép thử lặp lại lần theo công thức Ducan sau: Độ lệch tiêu chuẩn I (Xi - X }2 Các mẫu có biểu hoạt tính (CS < 50%) chọn để thử nghiệm tiếp đề tim giá trị IC50 Giá trị ICso : dùng giá trị c s 10 thang nòng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang gía trị logarit đường cong phát triển tể bào nồng độ chất thử đễ tĩnh giá trị ỈC5p Công thức: 1/y=a+bínX Trong Y: nổnq độ chất thử; X: Giá trị c s (%) Đồ thị tính giá trị IC50 mẫu !£