3 chất do chúng tôi tổng hợp đã được thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
tại phòng Sinh học thực nghiệm thuộc Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên (Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam).
* Nguyên tắc thử:
Thử sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm được tiến hành theo phưofng pháp của Vander Berger và Vlietlinck [41], thực hiện trên các phiến vi lượng 96
giếng, theo 2 bước sau đây:
- Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính.
- Ampicilin đối với vi khuẩn Gram (+). - Tetracyclin đối vói vi khuẩn Gram (-). - Nystatin đối vód nấm sợi và nấm men.
* Các chủng vỉ sình vật kiểm định bao gồm:
Vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212) Staphylococcus aureus (ATCC 12222) Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli (ATCC 25922)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923)
Nấm sợi: Aspergillus niger (493)
Fusarium oxysporum (M42)
Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754)
Saccharomyces cerevisiae (SH 20)
* Các bước tiến hành:
Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính. +) Chuẩn bị vi sinh vật:
Nấm và vi khuẩn được nuôi dưỡng trong môi trường dinh dưỡng Sabouraud dextrose broth và Trypease soya broth (TBS).
+) Chuẩn bị mẫu thử:
Các chất thử được hoà tan trong dung môi DMSO nguyên chất với nồng độ 4mg/ml.
Từ dung dịch gốc pha loãng thành 4 - 10 thang nồng độ rồi nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng.
Nhỏ vào mỗi giếng đã có sẵn dung dịch v s v đã được hoạt hoá và được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn vị McLand (khoảng 108 vsv/m l).
+) Chuẩn bị mẫu đối chứng dương:
Dãy 1: Môi trường.
Dãy 2: Kháng sinh Ampicilin + vi khuẩn Gram (+). Kháng sinh Tetracyclin + vi khuẩn Gram (-). Kháng sinh Nystatin + vi nấm kiểm định.
+) Chudn bi mäu doi chitng am:
Chi cö VSV kiem dinh, khong c6 khäng sinh hay chat thir.
+) Dgc ket qua:
Ket quä doc sau khi ü cäc phien thi nghiem trong tu äm 37°C/24 giö cho vi
khuän vä 30°C/48 giö doi vöi nä'm scd vä näm men. K6t quä diiöng tinh lä ö nöng
dö mä khi nhin bäng mät thiröng thä'y trong suöt khong thay cö vi sinh vät kiem dinh phät trien giöng nhu hinh änh ö cäc chöng gi6'ng dirorng. Khi nuöi cäy lai nong do näy tren möi truöfng thach dia de kiem tra, cö giä tri CFU<5.
Miic dirong ö buöc 1 se duöc tiep tue thir ö buöc 2 d^ tinh giä tri MIC.
Bu&c 2: Tim nong dg üc che toi thieu (MIC) cüa cäc chät cö hoqt tinh.
Cäc mäu dä cö hoat tinh duöc sang loc b buöc 1 duöc pha loäng theo cäc
nong dö thäp dän tii 5 - 10 thang nong do d^ tinh giä tri töi thi^u mä b dö vi sinh vat bi \xc ch6' phät tri^n gän nhu hoän toän.
Mäu chät tinh khi6t cö MIC < 50 |J.g/ml lä cö hoat tinh.
Ket qua: Chüng töi dä thir hoat tinh khäng Idiuan, khäng näm cüa 3 chät tong hop duoc tren 4 chüng vi khuän vä 4 chüng vi näm, dö lä cäc chät: (2), (3), (6). Ket
quä duöc trinh bäy b bäng 3.6. Ket quä cho thäy chät (2) vä chät (3) cö hoat tinh
khäng vi khuan S.aureus vä nä'm möc F.oxysporum vöi MIC cüa hai chät tren cä
2 chüng vi khuän vä vi näm lä 50|o,g/ml. Cön chät (6) khong cö hoat tinh khäng vi
sinh vät kiem dinh b miic MIC quy dinh cüa phep thü (MIC < 50|ig/ml).
Bäng 3.6: Ket quä thur hoat tinh khäng khuan, khäng näm cua mot so chät tong hop diiöc
Chät
Nong dp \icche töi thieu (MIC: |xg/ml)
Vi khuan Gr(-) Vi khuan Gr(+) Näm möc Näm men
E. coli P. aeruginosa B. subtillis s. aureus Asp. niger F. oxysporum S. cerevisiae C. albicans 2 (-) (-) (-) 50 (-) 50 (-) (-) 3 (-) (-) (-) 50 (-) 50 (-) (-) 6
3.3.2.Thử hoạt tính gây độc tê bào (Cytotoxicity assay).
Bước sang thế kỷ XXI, mặc dù nền y học đã có nhiều bước tiến vượt bậc, song bệnh ung thư vẫn là một trong những bệnh hiểm nghèo có tỷ lệ tử vong cao. Việc tìm kiếm các phương pháp điều trị ung thư hiệu quả, trong đó có các thuốc chống ung thư là vấn đề nghiên cứu đã và đang được quan tâm trên thế giói. Từ nhu cầu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người của một số chất tổng hợp được vód mong muốn góp phần tìm được các hoạt chất có tác dụng chống ung thư.
* Nguyên tắc:
Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư người được tiến hành theo phương pháp SBR của Likhiwitayawuid & c s [27] hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI).
Dòng tế bào nghiên cứu:
- Dòng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma - Ung thư gan). - Lu (Lung cancer - Ung thư phổi) từ Viện Vệ sinh dịch tễ TW
Chất chuẩn dương tính:
Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipithine, Vinblastine hoặc Taxol pha trong DMSO.
Chất thử: Do điều kiện có hạn, chúng tôi chỉ tiến hành thử hoạt tính gây độc
tế bào của 3 chất trong số những chất tổng hợp được, là các chất (2), (3), (6).
* Tiến hành:
+) Tế bào ung thư được duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn. Sau khi tế bào được hoạt hoá phát triển đến pha log sẽ được sử dụng cho thử test vód các chất thử đã chuẩn bị sấn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại 3 lần trên phiến vi lượng 96 giếng.
+) Mẫu thử nghiệm bao gồm: Tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử được ủ trong tủ ấm COj/ST^C để tế bào tiếp tục phát triển.
+) Sau 48 - 72h lấy ra, cố định tế bào, rửa, nhuộm và hoà lại bằng dung dịch chuẩn. Đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 495 - 515nm.
* Kết quả:
Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng 2 dòng tế bào ung thư ngưòi Hep-G2 và
Lu của 3 chất (2, 3, 6) được ghi ở bảng 3.7:
Bảng 3.7: Kết quả thử hoạt tính kháng tê bào ung thư người của một số chất tổng hợp được
STT Ký hiệu mẫu
Dòng tế bào
Cell survival (%) Kết luận
Hep-G2 Lu 1 DMSO 100,0±0,0 100,0+0,0 2 Chứng (+) 0,8±0,37 3,2+0,02 Dương tính 3 2 68,7+0,9 73,5+0,4 Am tính 4 3 74,1+0,2 81,9±0,1 Âm tính 5 6 58,5+0,7 89,8+0,05 Am tính Ghi chú: Chứng (+): Ellipithine
Kết quả cho thấy trong số 3 chất được thử nghiệm không chất nào có hoạt tính gây độc tế bào