Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất có khả năng có tác dụng kéo dài của artemisinin

* Điều trị sốt rét bằng các thuốc như chloroquin, meAoquin, pyrimethamin, artemisinin và các dẫn chất của nó...theo nguyên tắc điều trị sớm, kết hợp điều trị đặc hiệu với điều trị toàn t

B ộ YTẾ

NGUYỄN NGỌC SƠN

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP MỘT số DÂN CHÂT

CÓ KHẢ NÃNG CÓ TÁC DỤNG KÉO DÀI CỦA

ARTEMISININ

(KHOẮ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC sĩ KHOẮ 2 0 0 1- 2006)

Giáo viên hướng dẫn : Tiến sĩ NGUYỄN h ả i n a m

Thạc sĩ PHAN THỊ PHƯƠNG DUNG

Thời gian thực hiện : 10/2005 - 04/2006

HÀ NỘI 05/2006.

Lời cảm ơn

Çĩl^ưổe hẾl eltJỠ^ phjéfL té¿ đtiớíĩ Íừíụ iẲ lẦnự íỉiêí tín íâ ii iẨít tĩÁ lồi eảm đn

ehAn títành nkáí tM ÇîS^ OlạuụẴtL 'Tôcii OíxưtL^ Çîhji ^ k a rt Q'hi ^kưđtiự

<T)ung,f thầy e& đã tá$L tinh hưởng, dẫtt ỊỉỈL tẨỊẨ% ntẹi đĩẤií UíịtL thuán Lợi

ehs^ lôi quÁ tvìnA Ikựe hiè^L khởă Luătt- tói ngỉdỀp này

Çf&i ddtt ehÁtL ihìuiA eăm Ổ*L ê ả ' Qlhâtt: Mề Çîhi ^ĩkuự 'Tôçulhf S ĩ

QtạuụẪỆt Çîki '3ôuụỉrL (phồtiạ th í ỆiạíùÂm trurtạ tâm đai hjỡ^ nữưiổíí

'Tùà Qlội)f Ịíhồ^tạ fJtjà hề*iq, nqjơaiy pỊiầnụ khấi fdiÂf fdtỡ*tg, phẨ emiq

kưằttạ, từ hạt nhân — (J)lín ítaá hẹt^ đă ạiúp, tồi hờiưi thành khad Uíậrt

lế l nạhiệft neuf,

OôitL ehâtt thèưih eám đrt eáe tlvầụ fiầ ụiájô^f eAe, anh ùhi Uụ, thuật úiỀtL

'3ùờéi ílưđe ~ '^rưềttg, ^ ạ i Itỡc G)ườe 'Jôà, Q lồi đu ủttạ lọtì^ điêu kìỀtL thuùwL Lời Ípíị*ig, iẮiếl qẦiá, trình Làm íhưtL nụhiềtvL tạ i tĩẠ twiồ*t.

ũuối eùnụ,, æirt ehêưt thành íiẩni đrt gia ¿tinhf lịọti txỀ — nhữttq tiạưòi

lu&tt iíit íiátthf đệnụ oiỀTL, khíeh lẻ tồi m ạắttg, học lâftf ỉphấn đấu d¿

hờiuL thàỆik- kỉtứá Luận tối ếtạhiỀp,.

Jôà Qỉlội, tvạàụ 19 ihAttạ 5 Han't 2006

Sinh oiÃrt: (Mụujjền QLgjù^ S đ ti

1.4.2 Tác nhân acyl hoá và đặc điểm của chúng 11

Phần 3: THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 18

4.1.2 Xác định cấu trúc của các chất đã tổng hợp được 32

Phần 5; KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 42TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHU LUC

IR : Infrared spectroscopy (phổ hồng ngoại)

u v : Ultraviolet spectroscopy (phổ tử ngoại)

MS : Mass spectroscopy (phổ khối lượng)

EI : Electron Ionization

CI : Chemical Ionization

APCI : Atmospheric Pressure Qiemical Ionization(ion hoá

bằng hoá học dưới tác dụng áp suất khí quyển - một phương pháp đo khối phổ của chất kém bền)

’H-NMR : Nuclear magnetic resonance (phổ cộng hưỏfng từ

proton)BNSR : Bệnh nhân sốt rét

BNSRAT : Bệnh nhân sốt rét ác tính

Bảng 1 Diễn biến bệnh sốt rét từ 1991 - 2003 4

Bảng 3 Mối liên quan tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng với 21

hiệu suất

Bảng 4 Các dẫn chất ester của DHA tổng hợp được 29

Bảng 5 Kết quả thử hoạt tính sinh học của các dẫn chất tổng hợp 31

được

Bảng 6 Dữ liệu phổ hồng ngoại của các chất tổng hợp được 34

Bảng 7 Các thông số đo phổ u v của DHA và các dẫn chất tổng 35

hợp được

Bảng 8 Khối lượng các mảnh vỡ của chất V và VI 36

ffin h2 Công thức cấu tạo một số dẫn chất của artemisinin 7

Hình 3 Sơ đồ quá trình chuyển hoá của arteether 8

Hình 4 Hình ảnh sắc ký đồ tại các thời điểm khác nhau 22

ĐẶT VẤN ĐỂ

Sốt rét là một bệnh xã hội gây nhiều tác hại đến sức khỏe, lao động và

đời sống con người Bệnh do ký sinh trùng sốt rét (KST SR) Plasmođỉum gây

nên và là một trong những bệnh truyền nhiễm hàng đầu trên thế giới, ở Việt Nam, sau khi bệnh sốt rét xuất hiện trở lại, Nhà nước, ngành y tế, toàn dân đang nỗ lực khống chế sự lan tỏa của bệnh và đã thu được nhiều kết quả khả quan Tuy nhiên tình trạng kháng thuốc đang là vấn đề gây nhức nhối cho công tác điều trị để tiến tới thanh toán hoàn toàn bệnh sốt rét Công tác phòng chống bệnh sốt rét luôn được chú trọng và thường áp dụng những biện pháp cụ thể như:

* Phòng chống truyền bệnh như xử lý màn ngủ bằng tẩm hoá chất permethrin, deltamethrin, khói hương, kem xà phòng để tránh muỗi đốt Diệt muỗi bằng nhiều biện pháp như diệt nơi sinh sản bằng các công trình thuỷ lợi, diệt chỗ trú ẩn bằng phát quang bụi rậm, ngăn không cho muỗi vào nhà bằng lưới của sổ; dùng các chất hoá học diệt bọ gậy hoặc muỗi trưởng thành như DDT, malathion

* Điều trị sốt rét bằng các thuốc như chloroquin, meAoquin, pyrimethamin, artemisinin và các dẫn chất của nó theo nguyên tắc điều trị sớm, kết hợp điều trị đặc hiệu với điều trị toàn thân nâng cao sức đề kháng của cơ thể Dùng các thuốc vẫn chưa bị kháng và phải tuân thủ liều dùng

* Phải theo dõi các cơn tái phát gần và xa để kịp thời chẩn đoán, điều trị Điều trị tiệt căn và tiệt giao là một yêu cầu không những về lâm sàng mà còn

về dịch tễ để bệnh nhân không còn là nguồn lây bệnh

Trong những thuốc trên, artemisinin và các dẫn chất của nó được sử dụng rất nhiều trong các phác đồ điều trị sốt rét Theo dõi diễn biến bệnh của bệnh nhân người ta thấy rằng artemisinin có những ưu điểm nổi bật là cắt sốt và diệt

ký sinh trùng nhanh trong 24 giờ, độc tính thấp, ít tác dụng phụ, có thể sử dụng an toàn cho cả bệnh nhân sốt rét bị các bệnh tim, gan, thận Tuy nhiên loại thuốc này vẫn tồn tại nhược điểm là tỷ lệ tái phát của bệnh cao (10-4 7%) Nguyên nhân được cho là chúng bị phân huỷ và đào thải ra ngoài nhanh chóng (thời gian bán thải ngắn) Để khắc phục những nhược điểm trên, nhiều hướng nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất của artemisinin có thời gian bán thải dài hơn đã được tiến hành như: khử hoá nhóm -C = 0 thành -C-OH (được dihydroartemisinin (DHA) rồi tạo ra các dẫn chất ester, ether gắn dẫn chất vào chất mang polymer chitosan [11]

Với mong muốn tổng hợp ra dẫn chất của artemisinin có tác dụng kéo dài góp phần vào nâng cao hiệu quả điều trị bệnh sốt rét, chúng tôi tiến hành đề

tài: “Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất có khả năng có tác dụng kéo dài

của artemisinin” Mục tiêu của đề tài là:

* Tổng hợp một s ố dẫn chất ester của DHA với các acid no mạch thẳng.

* định cấu trúc của các dẫn chất đã tổng hợp.

* Sơ bộ thử hoạt tính sinh học (khả năng diệt KST SR) của các dẫn chất

tổng hợp được.

Phần 1: TỔNG QUAN

1.1 TÌNH HÌNH BỆNH SỐT RÉT ở CÁC N ư ớ c TRÊN THÊ GIỚI

VÀ VIỆT NAM.

1.1.1 Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới:

Sốt rét là bệnh truyền nhiễm do KST SR Plasmodium là mầm gây bệnh

Có 4 loài KST SR ở người là; Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax,

Plasmodium malariae và Plasmodium ovale Bệnh lây truyền qua đường máu

thông qua côn trùng trung gian là muỗi Anophen, qua truyền máu hoặc từ mẹ sang con trong lúc mang thai

Bệnh sốt rét phân bố rộng khắp tất cả các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới như: các nước phía nam sa mạc Sahara, Đông Nam Á, Ấti Độ, Châu Đại Dương, Trung và Nam Mỹ [18] Hiện nay bệnh lưu hành trên 100 quốc gia và vùng lãnh thổ, có từ 300-500 triệu người mắc sốt rét và khoảng 1-1,5 triệu người tử vong vì sốt rét [20, 21] Chiến lược thanh toán bệnh sốt rét trên toàn cầu đưa ra năm 1955 của tổ chức y tế thế giới đã có tác dụng khi kết hợp

sử dụng DDT diệt muỗi, sử dụng thuốc chống sốt rét và giám sát chặt chẽ công tác phòng và điều trị Nhưng sau vài năm bệnh bùng phát trở lại [17] Nguyên nhân chủ yếu là gia tăng sự kháng thuốc điều trị bệnh sốt rét, đặc biệt

là chủng p falciparum Nó không chỉ kháng chloroquin mà còn kháng

Fansidar (hỗn hợp sulfadoxin với pyrimethamin), giảm nhạy cảm với quinin

và mefloquin Tỷ lệ kháng cao xảy ra ở Thái Lan, Việt Nam, Campuchia, vùng

Amazon của vùng Nam Mỹ và đang gia tăng ở Đông Phi [14] Sự kháng thuốc

hiện nay đang là một trở ngại lớn cho công tác phòng điều trị bệnh sốt rét tại mỗi quốc gia và trên thế giới

1.1.2 Tình hình bệnh sốt rét ở Việt Nam:

Do đặc điểm khí hậu Việt Nam là nhiệt đới gió mùa ẩm nên rất thích hợp

cho sốt rét tồn tại và phát triển Hiện ở Việt Nam có hơn 3/4 diện tích và 1/3

dân số sống trong vùng có sốt rét lưu hành [7] Trước năm 1980, có nhiều biện pháp để phòng chống sốt rét nhưng bệnh sốt rét chỉ giảm một thời gian rồi bùng phát trở lại với đỉnh điểm là năm 1991, số người mắc lên tới một triệu người và đã có 4.464 người tử vong [6] Dưới đây là bảng diễn biến bệnh sốt rét từ 1991 đến năm 2003:

Bảng 1: Diễn biến bệnh sốt rét từ năm 1991-2003.

ở Việt Nam bệnh sốt rét chủ yếu do p falciparum (chiếm 80-85%) và loại này thường gây sốt rét ác tính p vivax chiếm 15-20%, còn lại là p

malariae 1-2% Bởi p falciparum có khả năng kháng thuốc rất mạnh nên làm

cho bệnh sốt rét ở Việt Nam diễn biến rất phức tạp Năm 1961 p falciparum

kháng thuốc chloroquin ở Nha Trang và đến năm 1995 thì đã xác định kháng chloroquin tại 100% vùng sốt rét ở các tỉnh phía Nam và lan rộng ra nhiều tỉnh

miền Bắc [10] Ngoài ra, p falciparum còn kháng mạnh với các thuốc như:

hỗn hợp sulfadoxin-pyrimethamin, primaquin, quinin Với Artemisinin và dẫn chất của nó người ta chưa thấy hiện tượng kháng thuốc Tuy nhiên do những nhược điểm về dược động học của chúng nên tỷ lệ tái phát sau điều trị cao Như vậy thuốc sốt rét đã có rất nhiều loại ứng dụng vào điều trị, song với tình

hình kháng thuốc của KST SR cộng thêm sự không thuận lợi về mặt dược động học của artemisinin và dẫn chất của nó thì việc nghiên cứu để tìm ra một thuốc điều trị sốt rét mới vừa tránh được kháng thuốc vừa có sinh khả dụng cao vẫn là một yêu cầu cấp thiết Và hướng bán tổng hợp ra các dẫn chất của artemisinin có đặc điểm dược động học thuận lợi đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học.

1.2 ARTEMISININ VÀ MỘT số DẪN CHẤT c ủ a a r t e m i s i n i n 1.2.1 Artemisinin:

1.2.1.1 Nguồn gốc:

Artemisinin được phân lập vào năm 1972 từ cây Thanh cao hoa vàng

{Artemisia anua L Họ cúc Asteraceae) bởi các nhà khoa học Trung Quốc

Cấu trúc của nó được xác định bằng tia X năm 1979 Trong Y học cổ truyền Trung Quốc, cây Thanh cao hoa vàng được sử dụng để điều trị cảm lạnh và sốt Hàm lượng artemisinin chiếm 0,01-0,5% khối lượng khô

1.2.1.2 Cấu trúc hoá học của artemisinin:

Công thức phân tử: CigHjaOj

CH3

P tl: 282,3

Hình 1: Công thức cấu tạo của artemisinin.

Artemisinin là một sequisterpen lacton có cầu peroxyd nội phân tử Cầu nối này quyết định đến hoạt tính chống KST SR của artemisinin

1.2.1.3, Tính chất của artemisinin:

Artemisinin là bột kết tinh trắng hoặc tinh thể hình kim không màu, không

mùi, vị hơi đắng Không tan trong nước, rất tan trong dicloromethan (DCM),

dễ tan trong aceton và ethyl acetat, tan trong cloroform

1.2.1.4 Artemisinin trong điều trị sốt rét:

* Tác duns:

Thuốc diệt thể phân liệt trong máu của KST SR, đặc biệt tốt với thể do

chủng p falciparum gây ra, kể cả chủng đã kháng chloroquin; thuốc có tác

dụng trên giai đoạn vô tính của KST ở hồng cầu

Artemisinin nhanh chóng làm sạch KST SR khỏi máu, loại trừ và cải thiện các triệu chứng sốt rét nhanh hơn cloroquin Thuốc có hiệu quả cao với bệnh nhân mang KST SR đã kháng cloroquin Artemisinin không có tác dụng đối

với giai đoạn phát triển ở gan của KST SR Do vậy artemisinin không được

dùng làm thuốc dự phòng và chính điều này đã làm tăng nguy cơ kháng thuốc của KST SR đối với artemisinin Artemisinin được chứng minh là có tác dụng

diệt giao tử bào ở giai đoạn phát triển đầu của p falciprum Tác dụng này góp

phần vào cắt đứt sự lây truyền bệnh sốt rét

Artemisinin được dùng để điều trị sốt rét não, sốt rét ác tính rất hiệu quả với tỷ lệ khỏi là khoảng 90%, cao hơn tỷ lệ khỏi của chloroquin và quinin Thời gian phục hồi khỏi hôn mê sau 21 giờ Thân nhiệt của bệnh nhân trở về bình thường sau 72 giờ điều trị, thể vô tính của KST SR bị loại trừ trong vòng

120 giờ Tuy nhiên tỷ lệ tái phát trong vòng một tháng của những bệnh nhân điều trị bằng artemisinin tương đối cao (21%) Artemisinin là thuốc dùng an toàn, ngay cả ở những bệnh nhân có biến chứng liên quan tới bệnh gan, tim, thận hoặc mang thai [5]

* Chỉ đinh:

- Trong điều trị sốt rét thể nhẹ và trung bình, ở vùng p falciparum kháng

nhẹ với chloroquin, artemisinin được dùng với liều như sau:

Viên artemisinin 0,25 g, ngày đầu uống 1,0 g, chia làm 2 lần; những ngày sau uống 0,5 g trong 24 giờ Uống 4-6 ngày, tuỳ theo sốt và KST cắt nhanh (sau một ngày) hay chậm (sau 2-3 ngày) Tổng liều là 3-4 g.

Cũng có thể phối hợp như sau: artemisinin với tetracyclin (hoặc doxycyclin), artemisinin với quinin, artemisinin với mefloquin

- Trong điều trị sốt rét ác tính (phối hợp với quinin): ngày đầu uống Ig, 4

ngày sau mỗi ngày 0,5 g Có thể hoà viên artemisinin vào nước và cho bệnh nhân uống hoặc đổ qua xông mũi - dạ dày nếu họ không uống được [4]

* Nhươc điểm của artemisinin:

úhg dụng lâm sàng của artemisinin bị hạn chế do tính chất dược động học không thuận lợi Artemisinin không ổn định trong hệ dung môi nước, rất dễ bị thuỷ phân vòng lacton trong dung môi phân cực Thuốc có thời gian bán thải ngắn (1-3 giờ) và thải trừ nhanh chóng ra ngoài cơ thể Khi điều trị sốt rét bằng artemisinin thì thấy rằng tỷ lệ tái phát nhanh và cao

1.2.2 Một sô dẫn chất của artemisinin trong điều trị sốt rét:

Công thức cấu tạo một số dẫn chất của artemisinin:

* Artesunat:

Dẫn chất này tan được trong nước, hấp thu nhanh hơn artemisinin, ư u điểm hơn artemisinin là có dạng thuốc tiêm nên sử dụng tốt trong điều trị sốt rét ác tính Tuy vậy, thời gian bán thải theo đường tĩnh mạch ngắn, khoảng 45 phút Dùng liều cao thuốc có thể gây nhiễm độc tim

* Artemether:

Là dẫn chất của artemisinin có thể hoà tan trong dầu lạc để bào chế dạng tiêm bắp thịt Thời gian bán thải cao hơn artemisinin (4-11 giờ) Tuy nhiên, artemether lại độc hơn artemisinin và artesunat, có thể gây ngộ độc tim Liều cao với súc vật thí nghiệm artemether có thể gây độc thần kinh

kinh Chẳng hạn như arteether, in vivo chuyển hóa thành DHA bởi Cytocrom

P450 thông qua phản ứng đề alkyl hoá Sau đó DHA mở vòng bán acetal tạo ra dẫn chất giống đường pyranose với nhóm hydroxyl tự do Chất này được đào thải dưới dạng liên hợp 12-glucuronid, đó là một chất gây độc với thần kinh

Hình 3: Sơ đồ quá trình chuyển hoá của arteether [12].

Như vậy trong điều trị sốt rét vẫn cần những dẫn chất của artemisinin có dược động học thuận lợi để cải thiện nhược điểm mà những dẫn chất trên gặp phải.

Thực tế đã có rất nhiều thuốc có tác dụng kéo dài đang áp dụng trong điều trị được tổng hợp dưới dạng những ester như: nandrolon decanoat, haloperidol decanoat, testosteron decanoat, Aupenthixol decanoat Điều đó đã gợi mở

cho chúng tôi hướng thực hiện đề tài là: tổng hợp ra dẫn chất ester của DHA ở

* Alcol tác dụng vói acid:

RCOOH + R'OH ^ RCOOR' + H2OĐây là phản ứng thuận nghịch cần có xúc tác là để cho hiệu suất cao hơn Phản ứng này không đi đến cùng, luôn có sự chuyển dịch cân bằng giữa hai bên Để tăng sự tạo thành sản phẩm người ta có thể cho dư một trong hai thành phần tham gia phản ứng hoặc là acid hoặc là alcol Ngoài ra một số cách khác để tăng lượng sản phẩm tạo thành cũng được dùng như loại nước sinh ra trong quá trình phản ứng, hoặc thu hồi ester Phản ứng này được áp dụng nhiều cho những trường hợp alcol bậc một và bậc hai

* Alcol tác dụng với acyl halogenid:

* Alcol tác dụng vói anhydrid acid:

Phương trình phản ứng:

Anhydrid acid là sản phẩm loại nước của hai phân tử acid carboxylic Đây

là những tác nhân acyl hoá mạnh, khi tác dụng với alcol sẽ tạo ra hợp chất ester và giải phóng một phân tử acid carboxylic Anhydrid acid hay dùng nhất

là anhydrid acetic Xúc tác cho phản ứng acyl hoá bởi các tác nhân này, người

ta cũng thường dùng các amin bậc ba có bản chất bazơ như: triethylamin, pyridin

* Alcol tác dụng với acid đã hoạt hoá bằng DCC (dicydohexyl carbodiimid) vói xúc tác DMAP (dimethyl amino pyridin):

Đây là phương pháp hay dùng khi các tác nhân acyl clorid hoặc anhydrid acid không có sẵn hoặc khó điều chế

acyl hoá để điều chế các ester của DHA sẽ có nhiều thuận lợi và phù hợp với điều kiện tiến hành phản ứng tại phòng thí nghiệm Vì vậy chúng tôi lựa chọn phản ứng acyl hoá làm phương pháp tổng hợp hoá học để thực hiện các mục tiêu đặt ra của đề tài Dưới đây chúng tôi xin được trình bày những nét cơ bản nhất về phản ứng acyl hoá.

1.4.1 Định nghĩa phản ứng acyl hoá:

Acyl hoá là quá trình thay thế nguyên tử H trong một hợp chất hữu cơ bằng nhóm acyl (R-CO-) Trong trường hợp hợp chất hữu cơ là các alcol R ’-

OH thì phương trình phản ứng tổng quát là:

1.4.2 Tác nhân acyl hoá và đặc điểm của chúng:

1.4.2.1 Tác nhân acyl hoá [1]:

Acyl là nhóm còn lại của các acid vô cơ có oxy, thường là acid carboxylic

đã loại đi nhóm -OH Tác nhân acyl hoá có công thức chung là:

o

Bảng 2: Các tác nhân acyl hoá thường gặp.

1.4.2.2 Đặc điểm của các tác nhân acyl hoá thường gặp:

* Các acid carboxvlic:

Các tác nhân loại này được dùng để acyl hoá các amin và alcol Nó không

có khả năng acyl hoá phenol Sản phẩm tạo ra là các amid hoặc ester Các acid hay được sử dụng là acid formic, acid acetic Trong phản ứng acyl hoá alcol, muốn nâng cao hiệu suất cẩn loại nước khỏi phản ứng bởi đây là phản ứng thuận nghịch tạo ra sản phẩm là nước Acyl hoá dùng tác nhân acid thường

được tiến hành ở nhiệt độ cao khoảng 2 0 0 vì những tác nhân này là những tác nhân tương đối yếu

* Các ester:

Đây không phải là những tác nhân acyl hoá mạnh nhưng được sử dụng trong một số phản ứng 0 -, N-, C- acyl hoá Tuy nhiên, trong công nghiệp người ta ít dùng ester để làm tác nhân N- acyl hoá Trừ trường hợp điều chế formamid và dimethyl formamid vì acid formic không thể tạo ra các anhydrid hoặc cloroacid tương ứng

NH3 +H C O O C H 3 - ► HCONH2 + CH3OH

* Các amid:

Chúng đều là những tác nhân acyl hoá yếu nên phạm vi sử dụng không được rộng rãi Hai tác nhân hay được sử dụng là formamid (HCONHj) và carbamid (H2NCONH2)

Carbamid được dùng để acyl hoá alcol tạo thành uretan:

C2H5OH +H2NCONH2.HNO3 - ► C2H5OCONH2 +NH4NO3

* Các anhydrỉd acid:

Anhydrid acid là những tác nhân acyl hoá mạnh, có thể acyl hoá được amin, alcol, và phenol không tạo ra nước trong quá trình phản ứng Chất hay được sử dụng nhất là anhydrid acetic Nhìn chung anhydrid acetic chậm thuỷ phân trong nước nên có thể acyl hoá trong môi trường nước và trong môi trường kiềm

Xúc tác cho phản ứng acyl hoá bởi các tác nhân này cũng thường là các amin bậc ba (triethyl amin, pyridin, 4-dimethyl amino pyridin)

* Các acvl haloeenid:

Đây là tác nhân acyl hoá rất mạnh Acyl halogenid thường là những chất lỏng, dễ bị phân huỷ trong nước Trong quá trình phản ứng acyl hoá với các alcol hoặc amid, acid hydrohalogenic (HX) được sinh ra nên người ta thường dùng các bazơ hữu cơ để làm chất hấp phụ như: pyridin, triethyl amin, quinolin, diethyl anilin

Trong acyl halogenid thì acyl clorid hay được sử dụng nhất Acyl clorid không tan trong nước nhưng khi rót vào nước thì đầu tiên chìm xuống và sau

đó phản ứng mạnh với nước Với các acyl clorid chậm bị thuỷ phân bởi nước (clorid acid của acid thơm) thì có thể acyl hoá trong dung dịch kiềm 10-2 0% hoặc carbonat kiềm

1.4.3 ứng dụng của phản ứng acyl hoá:

- Tạo ra những hợp chất có tính chất mới Ví dụ như khi acyl hoá anilin thu

được acetalnilid là thuốc hạ nhiệt ít độc hơn anilin nhiều lần Ure khi acyl hoá với các dẫn chất của acid malonic tạo thành nhiều loại thuốc ngủ và chống động kinh nhóm barbituric

- Tạo nhóm bảo vệ cho quá trình tổng hợp hoá học Ví dụ: trong tổng hợp các sulfamid, trước khi làm phản ứng sulíocloro hoá anilin, người ta phải bảo

vệ nhóm amin bằng phản ứng acetyl hoá

- Tạo hợp chất trung gian trong quá trình tổng hợp hoá học Ví dụ: amid của homoveratrilamin với các acid carboxylic khác nhau là trung gian để tổng hợp nhân isoquinolin trong tổng hợp các thuốc papaverin, emetin

1.5 ỨNG DỤNG PHẢN ÚNG ACYL HOÁ ĐỂ BÁN T ổN G HỢP CÁC DẪN CHẤT ARTEMISININ TỪDHA:

Nguyên liệu để thực hiện các phản ứng bán tổng hợp là dihydroartemisinin (DHA) và các tác nhân acyl hoá như: acyl clorid và anhydrid acetic DHA có công thức cấu tạo như sau:

Công thức cấu tạo trên cho thấy rằng DHA có một nhóm -O H alcol nên theo lý thuyết về phản ứng acyl hoá thì DHA có thể được ester hoá bằng các tác nhân thích hợp Việc ester hoá DHA bằng các acyl clorid và anhydrid acetic có thể được tiến hành dễ dàng bởi các tác nhân acyl hoá trên đều rất mạnh Vì vậy chúng tôi lựa chọn phản ứng acyl hoá DHA để điều chế các dẫn chất của artemisinin (ester của DHA)

Tác nhân acyl hoá dùng để thực hiện đề tài này bao gồm:

Anhydrid acetic C4H6O3Hexanoyl clorid Q H „C10Octanoyl clorid CgHisClONonanoyl clorid C9H17CIODecanoyl clorid CjgHjgClOLauroyl clorid C12H23CIOPhương trình phản ứng chung cho quá trình tổng hợp là:

OH của DHA Điều đó sẽ làm giảm hiệu suất của phản ứng tổng hợp Quá trình phân huỷ các tác nhân acyl hoá khi có sự xuất hiện của nước diễn ra theo

phản ứng dưới đây với X là cr hoặc -OOC-CH3:

ĩ

Do vậy để tránh ảnh hưởng của nước tới phản ứng thì cần tránh ẩm cho tác nhân acyl hoá (acyl clorid, anhydrid acetic) và nguyên liệu DHA, đồng thời phải làm khan các dung môi phản ứng, sấy khô dụng cụ phản ứng

Phản ứng tạo ra HX là một acid nên trong phản ứng phải dùng một bazơ để hấp thụ HX ở đây chúng tôi dùng pyridin - một dị vòng chứa nitơ Pyridin sẽ hấp thụ HX tạo ra theo phản ứng sau:

H

HX

Sản phẩm hấp thụ tan trong nước nên có thể tách loại nó bằng pha nước Pyridin là chất hút ẩm mạnh nên trong quá trình bảo quản cần tránh để tiếp xúc với ẩm, gây ảnh hưởng đến quá trình xúc tác và hiệu suất phản ứng

Phần 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 NGUYÊN LIỆU, DUNG MÔI HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN

2.1.2 Dung môi hoá chất:

- Dicloromethan, aceton, n-hexan, ethanol, pyridin, dung dịch acid hydrocloric 10%, dung dịch acid sulfuric 10%, dung dịch natri hydrocarbonat bão hoà, dung dịch nước muối bão hoà,

- Silica gel 70-230 mesh dùng cho sắc ký cột

- Hạt molecular sieve 0,3 nm cung cấp bởi công ty Metrohm, Ltd Thuỵ Sĩ

- Natri sulfat khan

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị:

- Cân kỹ thuật, cân phân tích (Precisa)

- Máy khuấy từ (IKA)

- Thiết bị cất quay (Bucchi R-200, B-490)

- Tủ sấy Binder

- Bình phản ứng hình cầu, cốc có mỏ, bình gạn, micropipet 5 ml và 0,1 ml, bình hút ẩm

- Bản mỏng sắc ký silica gel GF254

- Máy đo phổ ư v Lambada EZ210 Spectrophotometer

- Máy đo phổ hồng ngoại (Perkin Elmer)

- Máy đo khối phổ LC-MSD-Trap-SL

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

- Tổng hợp các dẫn chất ester của DHA với các acid no mạch thẳng

- Xác định cấu trúc của các dẫn chất đã tổng hợp

- Thử hoạt tính diệt KST SR trên chủng p falciparum.

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

- Sử dụng phương pháp tổng hợp hoá học để tổng hợp ra sản phẩm dự kiến trên nguyên tắc của phản ứng acyl hoá

- Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lófp mỏng (SKLM), phát hiện vết chất trên bản mỏng bằng cách nhúng trong dung dịch H2SO4 10% rồi đốt ở 105 °C; đánh giá sơ bộ hiệu suất phản ứng thông qua so sánh độ đậm của vết sản phẩm

và vết chất tham gia phản ứng

- Dùng kỹ thuật chiết tách để loại dần các tạp trong hỗn hợp sau phản ứng

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi thích hợp

- Xác định cấu trúc của chất tổng hợp được dựa trên dữ liệu phân tích phổ

u v , IR, MS, ‘H-NMR

- Thử tác dụng diệt KST SR in vitro với chủng p falciparum của các dẫn

chất tổng hợp được bằng phương pháp của Desjardins và cộng sự [16]

4ol U I í V

Phần 3: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 TỔNG HỢP HOÁ HỌC:

Để tổng hợp dẫn chất I chúng tôi sử dụng anhydrid acetic (một nguyên liệu sẵn có trong phòng thí nghiệm), còn với các chất II-VI chúng tôi sử dụng tác nhân acyl hoá là các acyl clorid Dưới đây là cách tiến hành các phản ứng acyl hóa để điều chế dẫn chất I-VI (ester của DHA):

3.1.1 Tổng hợp 12P-acetyI dỉhydroartemisinin (I):

Chiết tách: hỗn hợp phản ứng được chuyển sang bình chiết 100 ml, thêm

30 ml DCM, lắc với dung dịch acid hydrocloric 10% ba lần, mỗi lần 30 ml Gạn lấy lớp dưới rồi lắc với dung dịch NaHCOg bão hoà 3 lần, mỗi lần 30 ml

Để yên cho phân lớp rồi gạn lấy lớp dưới Dung dịch thu được lắc với 30 ml nước muối bão hoà và gạn lấy lớp DCM dưới Lớp dung dịch này cho đi qua chất hút ẩm natri sulfat khan đặt trên phễu lọc Dịch lọc được cô bớt dung môi bằng máy cất quay chân không thu được sản phẩm thô

Chuẩn bị cột sắc kỷ silica gel: nhồi cột silica gel cao 35 cm, đường kính 1

cm, khối lượng silica gel là 21 g bằng hệ dung môi n-hexan và aceton có tỉ lệ

là 30:1

Chạy sắc ký cột: hoà sản phẩm thô trong một lượng tối thiểu dung môi

aceton và rót nhẹ nhàng lên trên cột sao cho không làm xáo trộn lớp silica gel Dùng hệ dung môi n-hexan : aceton (8:1) làm pha động để chạy cột Mở van cho dịch chảy ra khỏi cột và thu hồi vào các ống nghiệm với thể tích là 2 ml

Sắc ký lớp mỏng: chấm sắc ký lófp mỏng các dịch trong ống nghiệm trên và

chạy sắc ký với hệ dung môi n-hexan : aceton (3:1) Sau một thời gian lấy bản mỏng ra và để cho bay hơi hết dung môi

Phát hiện vết chất trên SKLM: nhúng vào dung dịch acid sulfuric 10%

Đốt bản mỏng ở nhiệt độ 105 °c trong khoảng 10 phút, chất sẽ cháy tạo thành

vết đen dễ nhận biết

Chọn ra những ống nghiệm có duy nhất một vết chất trên sắc ký lớp mỏngvới độ phân giải (Rf) = 0,51 thu hồi lại và cất chân không để loại dung môi.Sản phẩm thu được dạng kết tinh màu trắng tinh khiết Khối lượng chất thu được là 0,34 g

* Kết quả:

- Hiệu suất phản ứng: 52%.

- Nhiệt độ nóng chảy; 110-112 °c.

- Độ tan: 12p—acetyl dihydroartemisinin không tan trong nước, tan trong ethanol, tan tốt trong aceton, DCM và cloroform.

- Rfi với hệ dung môi khai triển n-hexan : aceton (3:1) thì Rf của nó là 0,51

Do các tác nhân acyl clorid có tính chất rất giống nhau nên chúng tôi chỉ khảo sát đại diện phản ứng giữa DHA với lauroyl clorid làm cơ sở để thực hiện các phản ứng acyl hoá giữa DHA với các acyl clorid còn lại Việc khảo sát điều kiện thực hiện phản ứng nhằm mục đích chọn ra được một điều kiện phản ứng tối ưu Qua đó khi thực hiện phản ứng sẽ đảm bảo được sử dụng tiết kiệm hoá chất, dung môi mà vẫn thu được hiệu suất cao nhất, Các điều kiện chúng tôi khảo sát là:

a) Tỷ lê mol siữa lauroyl clorid và DHA tham sia phản ứns:

Theo lý thuyết về phản ứng giữa DHA và các tác nhân acyl clorid thì tỷ lệ

1:1 là đủ để phản ứng hoàn toàn Nhưng trên thực tế phản ứng khó có thể đạt được hiệu suất 100% Nguyên nhân có thể do các acyl clorid dễ bị phân huỷ trong môi trường nước, trong khi đó các dung môi sử dụng lại rất khó loại nước hoàn toàn được Để đạt được hiệu suất cao, người ta thường cho dư một trong hai chất Tiêu chí để chọn ra một chất dư trong phản ứng thường là rẻ tiền, dễ kiếm và dễ tách loại sau phản ứng Và các tác nhân acyl clorid có đủ các tiêu chí đó Vì vậy chúng tôi lấy dư lauroyl clorid, thực hiện 4 phản ứng với tỷ lệ mol lauroyl clorid và DHA khác nhau trong thời gian 24 giờ (để đảm bảo lượng sản phẩm tạo ra là nhiều nhất) Các phản ứng được tiến hành trong cùng một điều kiện Chiết tách bằng các hoá chất, dung môi thích hợp Chạy sắc ký cột silica gel thu được sản phẩm tinh khiết rồi tính hiệu suất phản ứng Kết quả thu được thể hiện ở bảng dưới đây:

DHA (mmol) Lauroyl clorid

(mmol)

Tỷ lệ lauroyl clorid/

DHA

Hiệu suất (%)

Bảng 3: Mối liên quan tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng với hiệu suất.

Qua bảng trên ta thấy rằng tỷ lệ mol lauroyl clorid/DHA = 3/1 cho hiệu suất cao nhất Vì vậy chúng tôi chọn tỷ lệ 3/1 để tiến hành phản ứng giữa lauroyl clorid với DHA để khảo sát thời gian phản ứng cho hiệu suất cao nhất

b) Khảo sát thời sian tiến hành phản ứns:

sân |.iliảm

DHA

Sau 30’ Ih 2h 3h 4h

Hình 4: Hình ảnh sắc ký đồ tại các thòi điểm khác nhau.

Tiến hành phản ứng tổng hợp lauroyl clorid vód DHA theo tỷ lệ mol là 3/1 Chấm sắc ký lớp mỏng với lượng dung dịch phản ứng như nhau tại các thời điểm 30 phút đầu, Ih, 2h, 3h, 4h trên cùng một bản mỏng Khai triển sắc ký trong hệ dung môi n-hexan : aceton với tỷ lệ 10:1 Do DHA và sản phẩm acyl hoá không hiện màu dưới đèn tử ngoại nên bản mỏng được nhúng vào dung

dịch acid sulfuric 10% rồi đốt nóng ở 105 °c trong 10 phút để hiện vết So sánh lượng sản phẩm tạo ra ở các thời điểm đó dựa vào độ đậm nhạt của các vết để tìm ra thời điểm phản ứng cho hiệu suất cao nhất Kết quả sắc ký lớp mỏng thu được như hình 4

Kết quả cho thấy ở thời điểm 3 giờ và 4 giờ vết sản phẩm là đậm nhất Tức

là khi đó lượng sản phẩm tạo ra là lớn nhất So sánh độ đậm của vết giữa hai thời điểm 3 giờ và 4 giờ thấy rằng lượng sản phẩm tạo ra không thay đổi, vì vậy có thể coi thòi điểm sau 3 giờ phản ứng xảy ra với hiệu suất cao nhất

Thông qua sự khảo sát hai điều kiện trên đây chúng tôi đã lựa chọn tỷ lệ acyl clorid/DHA = 3/1 và khoảng thời gian 3 giờ để tiến hành các phản ứng acyl hoá khác giữa DHA và các tác nhân acyl clorid.

3.I.2.I Tổng hợp lip-h exan oyl dihydroartemisinỉn (II):

Để phản ứng trong thời gian 3 giờ

Chiết tách: hỗn hợp phản ứng được chuyển sang bình chiết, thêm 30 ml

DCM rồi lắc với dung dịch acid hydrocloric 10% ba lần, mỗi lần 30 ml, gạn lấy lớp dưới Dịch gạn lại lắc 3 lần với dung dịch NaHCƠ3 bão hoà, mỗi lần

30 ml, để phân lớp rồi tách lấy lớp dưới Dịch thu được lắc với 30 ml nước

muối bão hoà, để phân lớp và gạn lấy lớp DCM ở dưới Lớp dịch này được làm

khan bằng cách cho đi qua natri sulfat khan đã chuẩn bị sẵn trên phễu Dịch

đã được làm khan sẽ được cất quay chân không để thu được sản phẩm thô

Chuẩn bị cột sắc ký silica gel: nhồi cột silica gel cao 35 cm, đường kính 1

cm, khối lượng silica gel là 21 g bằng hệ dung môi n-hexan và aceton có tỷ lệ

là 40:1

Chạy sắc kỷ cột: hoà sản phẩm thô trong một lượng tối thiểu dung môi

aceton và rót nhẹ nhàng lên trên cột sao cho không làm xáo trộn lớp silica gel Dùng hệ dung môi n-hexan : aceton (16:1) làm pha động để triển khai sắc ký cột Mở van cho dịch chảy ra khỏi cột và thu hồi vào các ống nghiệm với thể tích là 1,5-2 ml

Sắc ký lớp mỏng: chấm sắc ký lớp mỏng các dung dịch trong ống nghiệm

trên, chạy sắc ký ở hệ dung môi n-hexan : aceton (8:1) Sau một thời gian lấy bản mỏng ra, để bay hơi hết dung môi hữu cơ

Phát hiện vết chất trên SKLM: nhúng vào dung dịch acid sulfuric 10%

Đốt bản mỏng ở nhiệt độ 105 trong khoảng 10 phút, chất hấp phụ trên bản mỏng sẽ cháy và tạo thành vết đen dễ thấy

Chọn ra những ống nghiệm có duy nhất một vết chất duy nhất trên sắc kýlớp mỏng với Rf = 0,58 để cất quay chân không Sản phẩm tinh khiết thu đượcdạng dầu đặc, hơi vàng và có khối lượng là 0,50 g.

3.I.2.2 Tổng hợp 12ß-octanoyl dỉhydroartemỉsinin (III):

mmol) vào Sau khi phản ứng đủ thời gian 3 giờ, tiến hành các bước chiết tách, chuẩn bị cột sắc ký, chạy sắc ký cột, SKLM, phát hiện vết chất như 3.1.2.1 Điểm khác trong các bước đó là cột sắc ký được nhồi bằng silica gel trong hệ dung môi n-hexan : aceton có tỷ lệ 30:1, hệ dung môi dùng triển khai sắc ký cột là n-hexan : aceton có tỷ lệ 15:1 và hệ dung môi chạy SKLM là n-hexan : aceton có tỷ lệ 10:1 Thu hồi các ống nghiệm mà trên sắc ký đồ cho một vếtchất duy nhất với Rf = 0,52 để cất quay chân không loại dung môi Sản phẩmtinh khiết thu được thể lỏng, hơi vàng và có khối lượng là 0,50 g.

* Kết quả:

- Hiệu suất phản ứng: 61,3%.

- Độ tan: 12P-octanoyl dihydroartemisinin không tan trong nước, tan trong ethanol, methanol, tan tốt trong DCM, aceton và cloroform.

- Rf: với hệ dung môi khai triển n-hexan : aceton (10:1) thì Rf của nó là 0,52

3.I.2.3 Tổng hợp 12P-nonanoyl dihydroartemisiniĩi (IV):

mmol) vào Sau khi phản ứng đủ thời gian 3 giờ, tiến hành các bước chiết tách, chuẩn bị cột sắc ký, chạy sắc ký cột, SKLM, phát hiện vết chất như 3.1.2.1 Chỉ khác là cột sắc ký được nhồi bằng silica gel trong hệ dung môi n-hexan : aceton có tỷ lệ 20:1, hệ dung môi dùng triển khai sắc ký cột là n-hexan :

aceton có tỷ lệ 10:1 và hệ dung môi chạy SKLM là n-hexan : aceton có tỷ lệ

6:1 Thu hồi các ống nghiệm mà trên sắc ký đồ cho một vết chất duy nhất với

Rf = 0,51 để cất quay chân không Sản phẩm tinh khiết thu được thể lỏng, màuvàng và có khối lượng là 0,56 g