Bán tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất của nuciferin

Quy trình đề xuất cho phản ứng O-alkyl hóa chất II để tổng hợp sản phẩm thế của nuciferin: 2-Hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin V……… 33 Hình 27.. 1.2.3.2 Tác dụng dược lý của dịch chiết s

NGUYỄN ĐẮC TÙNG

BÁN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA

NUCIFERIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

NGUYỄN ĐẮC TÙNG

BÁN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA

NUCIFERIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Trước hết cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn

chân thành nhất đến PGS.TS Nguyễn Đình Luyện, TS Nguyễn Văn Hải, ThS Đào Nguyệt Sương Huyền – những thầy cô giáo trực tiếp hướng dẫn

tôi, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình làm thực nghiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Văn Giang, ThS Phạm Thị Hiền cùng các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên của Bộ môn Công

nghiệp dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thiện được đề tài nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập ở trường

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đặc biệt là các bạn cùng làm đề tài tốt nghiệp tại phòng Tổng hợp hóa dược - Bộ môn Công nghiệp dược đã luôn là chỗ dựa vững chắc, là những nguồn động viên to lớn đối với tôi trong cuộc sống, trong học tập và trong công việc

Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Nguyễn Đắc Tùng

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Cây Sen và một số chế phẩm từ lá cây 3

1.1.1 Cây sen 3

1.1.2 Chiết xuất , tinh chế và phân lập alkaloid trong lá sen 4

1.1.2.1 Chiết xuất .4

1.1.2.2 Tinh chế và phân lập 5

1.1.3 Một số chế phẩm từ lá cây 6

1.2 Hợp chất Nuciferin 6

1.2.1 Công thức, tính chất 6

1.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dược liệu 7

1.2.3 Tác dụng dược lý 7

1.2.3.1 Aporphin alkaloid (aporphinoid) .7

1.2.3.2 Tác dụng dược lý của dịch chiết sen và của nuciferin .8

1.2.3.3 Một số tác dụng dược lý đã được nghiên cứu ở sản phẩm demethyl hóa 10

1.3 Tổng quan về các phương pháp demethyl hóa 11

1.3.1 Phương pháp O-demethyl hóa các aryl-methyl ether 11

1.3.2 Các phương pháp demethyl hóa nuciferin 14

1.4 Các phương pháp O-alkyl hóa bằng tác nhân 2-cloroethanol 16

1.4.1 Phương pháp sử dụng K 2 CO 3 trong dung môi Acetonitril 16

1.4.2 Phương pháp sử dụng K2CO3 trong dung môi DMF 17

1.4.3 Phương pháp sử dụng NaOH trong nước 17

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên vật liệu 19

2.2 Thiết bị và dụng cụ 20

2.3.3 Thực hiện O-alkyl hóa sản phẩm O-demethylnuciferin bằng tác nhân EC 21

2.3.4 Thử tác dụng sinh học 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Bán tổng hợp dẫn chất của nuciferin 22

2.4.2 Xác định cấu trúc sản phẩm 23

2.4.3 Thử tác dụng sinh học 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 Chiết, phân lập và tinh chế nuciferin từ lá sen 24

3.1.1 Quy trình chiết nuciferin 24

3.1.2 Tinh chế Nuciferin 24

3.2 Bán tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-hydroxy-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin (N-methyl-asimilobin, II) 24

3.2.1 Demethyl hóa Nuciferin sử dụng tác nhân HBr 24

3.2.2 Tiến hành demethyl hóa nuciferin sử dụng tác nhân HBr xúc tác KI 27

3.2.3 Đề xuất quy trình bán tổng hợp sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid 27

3.3 Tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-(2-hydroxyethyl)-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin (2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin, V) 28

3.3.1 Sử dụng môi trường NaOH loãng 29

3.3.2 Sử dụng dung môi DMF, xúc tác K2CO3 31

3.3.3 Sử dụng dung môi acetonitril, xúc tác K2CO3 31

3.3.4 Đề xuất quy trình 32

3.4 Kết quả phân tích cấu trúc của nuciferin và các sản phẩm bán tổng hợp 34

3.5 Kết quả thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid (II) và sản phẩm 2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (V) 37

BÀN LUẬN 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……….…49

1 KẾT LUẬN 49

2 ĐỀ XUẤT 49

(International Union of Pure and Applied Chemistry)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số alkaloid trong lá sen……… 4 Bảng 2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm 19 Bảng 2.2 Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm………… 20 Bảng 3.1 Khảo sát lượng HBr 48% (ml) ảnh hưởng đến thời gian phản ứng bán

tổng hợp (II)……… 26 Bảng 3.2 Khảo sát lượng KI ảnh hưởng đến thời gian phản ứng monodemethyl

hóa nuciferin……… 27 Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin (IR, KBr)………

34 Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của

nuciferin………

34

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của N-methyl-asimilobin

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm

N-methyl-asimilobin hydrobromid (1H-NMR, DMSO)……… 36 Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm 2-

Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH……… 38 Bảng 3.9 Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD……… 39 Bảng 3.10 Tác dụng dọn gốc tự do DPPH ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và

Bảng 3.11 Tác dụng dọn gốc tự do SOD ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC 50

của mẫu thử……… 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)……… 3

Hình 2 Công thức chung các alkaloid phổ biến trong lá sen ……… … 4

Hình 3 Công thức cấu tạo của nuciferin ……… 6

Hình 4 Công thức cấu tạo nhân aporphin……… 7

Hình 5 Công thức cấu tạo N-methyl-asimilobin……… 11

Hình 6 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiI và quinolin……… 12

Hình 7 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiCl và DMF………… 12

Hình 8 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlCl3 trong CH3CN… 12 Hình 9 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlBr3 trong CH3CN… 13 Hình 10 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng H2SO4……… 13

Hình 11 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% và NaI……… 14

Hình 12 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% và AcOH……… 14

Hình 13 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng EtSNa trong DMF… 15

Hình 14 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HI 57% và Ac2O ……… 15

Hình 15 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% 16

Hình 16 Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K2CO3 trong dung môi CH3CN …… 16

Hình 17 Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K2CO3 trong dung môi DMF ………… 17

Hình 18 Phản ứng O-alkyl hóa trong môi trường NaOH loãng……… 17

Hình 19 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng HBr 48% 25

Hình 20 Cấu trúc sản phẩm phụ (III) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin 26 Hình 21 Cấu trúc sản phẩm phụ (IV) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin 26 Hình 22 Sơ đồ dụng cụ đề xuất cho phản ứng demethyl hóa nuciferin……… 28

Hình 23 Sơ đồ phản ứng tạo sản phẩm O-alkyl hóa nuciferin……… 29

Hình 24 Cấu trúc sản phẩm phụ (VI) của phản ứng O-alkyl hóa……… 30

Hình 25 Cấu trúc sản phẩm phụ (VII) của phản ứng O-alkyl hóa……… 31

Hình 26 Quy trình đề xuất cho phản ứng O-alkyl hóa chất (II) để tổng hợp sản phẩm thế của nuciferin: 2-Hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (V)……… 33

Hình 27 Vai trò xúc tác của KI trong phản ứng demethyl hóa……… 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ở nhiều quốc gia trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, xu thế con người bắt đầu sử dụng nhiều các loại thuốc chữa bệnh và bồi dưỡng sức khỏe có nguồn gốc từ thảo dược hơn là sử dụng thuốc tân dược vì nó ít độc hại hơn và ít tác dụng phụ hơn Hơn nữa, hiện còn nhiều triệu chứng và bệnh hiểm nghèo chưa có thuốc đặc hiệu để chữa trị, người ta hi vọng rằng từ nguồn động thực vật tự nhiên hoặc từ vốn trí tuệ bản địa của các cộng đồng, qua nghiên cứu sàng lọc có thể cung cấp cho nhân loại những hợp chất có hoạt tính sinh học cao để làm ra các loại thuốc mới có hiệu quả chữa bệnh như mong muốn [1]

Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn dược liệu phong phú đa dạng làm thuốc với những bài thuốc y học cổ truyền đã có hiệu quả trong việc phòng và chữa trị nhiều bệnh Những tác dụng cũng như chất lượng của những bài thuốc đang dần dần được chứng minh và kiểm soát

Trong rất nhiều loại dược liệu được sử dụng để chữa bệnh, có Sen là một

loài rất phổ biến ở Việt Nam Sen tên khoa học là Nelumbo nucifera Gaertn.,

họ Sen – Nelumbonaceae Từ xưa đến nay sen đã được sử dụng trong rất nhiều

bài thuốc y học cổ truyền ở các nước phương Đông như Việt Nam, Trung Quốc, Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của sen Trong cây sen, các alkaloid chiếm tới 0,7-0,8%, với nuciferin là alkaloid chính Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra được rất nhiều tác dụng mới của dịch chiết các bộ phận cây sen cũng như của nuciferin, điển hình như tác dụng chống ung thư [36], chống HIV [41], chống tăng lipid máu [36], hay có tác dụng chống oxy hóa mạnh [37]

Nhờ có ưu thế về nguồn nguyên liệu cây sen cũng như là tiềm năng của

nó trong y dược học, cây sen trong những năm gần đây được đưa vào nghiên cứu rất nhiều ở Việt nam Với nguồn nguyên liệu nuciferin sẵn có và dễ tách

chiết với hiệu suất cao, việc bán tổng hợp các dẫn chất của nuciferin đang là một hướng phát triển để tìm ra các hoạt chất mới có tác dụng chữa bệnh Đề tài

“Bán tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất của nuciferin” được

thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Bán tổng hợp một số dẫn chất nuciferin

2 Thử tác dụng chống oxy hóa của các dẫn chất bán tổng hợp được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Cây Sen và một số chế phẩm từ lá cây

1.1.1 Cây sen

Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen – Nelumbonaceae

Phân bố: Vùng nhiệt đới

châu Á, Châu Mĩ và ở Việt

lên khỏi mặt nước, cuống dài có

gai, đính ở giữa phiến lá, mép lá

uốn lượn tròn Hoa to màu hồng

hay trắng có mùi thơm Nhiều

lá noãn chứa trong một đế hoa chung hình nón ngược sau thành quả có vỏ cứng màu nâu đen Cây Sen được trồng ở các ao hồ khắp nơi trong nước ta Mùa thu hái: tháng 7 – 9 [6,7]

Thành phần hóa học: Lá sen có chứa alcaloid (0,77 – 0,84%), trong đó có

nuciferin, nor-nuciferin, roemerin, anonain, liriodenin, pronuciferin, norciferin, armepavin, N-nor-armepavin, methyl-corlaurin, nepherin,

O-dehydroemerin, dehydronuciferin, dehydroanonain, N-methylisocorlaurin

Trong đó nuciferin là alcaloid chính Ngoài ra trong lá sen còn có flavonoid, tanin, acid hữu cơ Trong tâm sen có nhiều alcaloid (0,85 – 0,96%), trong đó

có liensinin, isoliensinin, neferin, lotusin, nuciferin, pronuciferin, methylcorypallin, demetylcorlaurin [3,6,7,12]

Hình 1 Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)

Công dụng: Alcaloid toàn phần trong lá sen có tác dụng an thần, hạ huyết

áp nhẹ Lá sen được dùng để sắc uống chữa mất ngủ với liều 15 – 20 g/ngày

Lá sen kết hợp với một số dược liệu khác làm thuốc an thần Tâm sen chữa mất ngủ, an thần, di mộng tinh Ngày dùng 4 – 10 g dưới dạng thuốc hãm hay sắc uống [6,7]

1.1.2 Chiết xuất , tinh chế và phân lập alkaloid trong lá sen

1.1.2.1 Chiết xuất

- Phương pháp chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở môi trường kiềm: Chiết xuất alcaloid toàn phần từ lá sen, tâm sen, gương sen theo cùng qui trình sau: Bột dược liệu được làm ẩm bằng NH4OH 10% sau đó chiết bằng cồn 70o Dịch chiết cồn được cất dưới áp suất giảm để thu hồi cồn Hòa tan cắn vào nước, acid hóa bằng HCl 5% đến pH = 2 Lọc loại bỏ cặn Dịch lọc acid được chiết bằng ether dầu hỏa để loại tạp Dich chiết acid được thêm NH4OH 10% đến pH

Bảng 1.1 Một số alkaloid trong lá sen

= 10 – 11 rồi chiết bằng CHCl3 Dịch chiết CHCl3 được cất thu hồi dung môi, còn lại cắn alcaloid toàn phần [5]

- Phương pháp chiết bằng cồn: Bột lá sen được chiết bằng cồn lạnh trong

4 ngày Dịch chiết được cô thành cắn dưới áp suất giảm Sau đó hỗn hợp được chiết cân bằng giữa 2 pha CHCl3 và dung dịch NH4OH 5% Lấy pha hữu cơ, rửa lại bằng nước, lắc vài lần với HCl 2N vài lần (pha acid sẽ lấy đi tạp dạng dầu màu nâu) Pha CHCl3 được cô ở áp suất giảm thu được cặn, nghiền nhỏ trong dung dịch NH4OH ấm sau đó chiết bằng CHCl3 Lấy pha hữu cơ, làm khan, cô dưới áp suất giảm thu được cắn alkaloid toàn phần [6, 11]

1.1.2.2 Tinh chế và phân lập

- Phân lập alcaloid bằng sắc kí cột sử dụng silica gel 60 GF254(Merck):

Hoạt hóa silica gel ở nhiệt độ 110o

C trong 1 giờ Lắc silica gel với hệ dung môi đã chọn thành hỗn dịch, rót từ từ vào cột, sau đó cho dung môi chảy qua liên tục với thời gian là 5 giờ để ổn định cột Cắn alkaloid toàn phần ở trên được hòa vào một lượng nhỏ với hệ dung môi đã chọn tạo thành dịch alkaloid đậm đặc rồi trộn với một lượng silica gel vừa đủ đưa vào cột sắc kí đã chuẩn bị ở trên Rửa giải bằng hệ dung môi đã chọn theo tỉ lệ độ phân cực tăng dần Tốc độ chảy khoảng 30 giọt/phút, hứng mỗi phân đoạn khoảng 5 ml vào các ống nghiệm riêng và kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng Chọn riêng các phân đoạn chỉ có một vết trên sắc kí đồ, bốc hơi dung môi thu được cắn alcaloid Kết tinh lại nhiều lần sẽ thu được alkaloid tinh khiết Riêng các phân đoạn có 2 hoặc 3 vết được tiến hành phân lập tiếp bằng sắc kí lớp mỏng điều chế [3,6]

- Phân lập alcaloid bằng sắc kí lớp mỏng điều chế:

Chấm dung dịch chứa 2 hoặc 3 vết lên những bản mỏng có kích thước

20 x 20 cm được tráng chất hấp phụ là silica gel G (Merck), đã hoạt hóa ở 110o

C trong 1 giờ Hệ dung môi khai triển là CHCl3 : MeOH : NH4OH = 50 : 9 : 1 Bản mỏng để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó phun thuốc thử Dragendorff lên

một góc để phát hiện và đánh dấu vết alcaloid Cạo lấy silica gel chứa chất cần tách, phản hấp phụ bằng CHCl3 và lọc Để CHCl3 bốc hơi tự nhiên, sau đó hòa tan lại bằng cồn ethanol rồi để tủ lạnh, cho kết tinh lại nhiều lần thu được 2 alcaloid tinh khiết là KN1 và KN2 Qua phân tích cấu trúc nhận dạng được KN1 là nuciferin [3,6]

1.1.3 Một số chế phẩm từ lá cây

Một số sản phẩm chứa cao lá sen: Chế phẩm Sen vông của xí nghiệp dược phẩm Trung ương 2 chứa cao lá sen, cao lá Vông, lưu hành tại thị trường Việt Nam và xuất khẩu; chế phẩm Sevona của xí nghiệp dược phẩm Trung ương 25 chứa cao lá sen và một số dược liệu khác, lưu hành tại Việt Nam và xuất khẩu sang các thị trường Nhật, Cuba, một số nước Châu Âu; chế phẩm trà thuốc Seivo của trường Đại học Dược Hà Nội chứa cao tâm sen, cao củ bình vôi và ích mẫu; chế phẩm thuốc an thần Seroga của xí nghiệp dược phẩm Trung ương

25 chứa cao tâm sen, cao củ bình vôi, cao táo nhân và cao thiên ma

- Tính chất lí – hóa: Nuciferin là chất kết tinh, tinh thể hình khối, màu vàng nhạt, không mùi, không vị, tan tốt trong CHCl3, MeOH, EtOH nóng, hầu như không tan trong nước, nhiệt độ nóng chảy 164 - 165 0

C, phổ UV (đo trong MeOH) cho λmax tại bước sóng 210 nm, 228 nm, 270 nm [2,3]

- Phổ 1

H-NMR (CDCl3): δ (ppm) 7,48 (3H, s, N-CH3), 6,40 (3H, s, C1OCH3), 6,16 (3H, s, C2-OCH3), 3,38 (1H, s, C3-H) 2,74 (3H, m, C8-H +

-C9-H + C10-H) 1,60 (1H, d, C11-H) [3,11,12]

1.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dược liệu

- Chiết xuất: Sủ dụng phương pháp chiết như phần 1.2.2.1 thu được

alkaloid toàn phần

- Phân lập và tinh chế: Sử dụng phương pháp kết tinh lại trong cồn nóng thu được tinh thể màu trắng ánh xanh nhạt

1.2.3 Tác dụng dược lý

1.2.3.1 Aporphin alkaloid (aporphinoid)

Trong những năm gần đây, tác dụng của các

alkaloid có nhân aporphin đang là chủ đề của rất

nhiều nghiên cứu bởi mối liên hệ với cấu trúc

nhân apomorphin cũng như là các tác dụng không

thể không thừa nhận của các bài thuốc y học cổ

truyền có chứa những alkaloid trên, chính vì thế

nhiều nghiên cứu về các aporphinoid đã được thực

hiện Sau đây là một số tác dụng được lý chung

của các aporphinoid đã được tìm thấy:

- Tương tác với các receptor thuộc hệ dẫn truyền thần kinh

- Tác dụng gây co cơ

- Ảnh hưởng đến hoạt động của nhiều enzym

- Tác dụng chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do

Hình 4 Công thức cấu tạo nhân aporphin

- Ảnh hưởng đến quá trình kết tập tiểu cầu

- Hạ huyết áp và chống loạn nhịp tim

- Tác dụng kháng khuẩn và kháng virus

- Gây độc tế bào và tác dụng chống khối u

- Tác dụng miễn dịch

- Tác dụng chống viêm và tác dụng vảo vệ tế bào

- Tác động gây đột biến, gây độc cho gen và phá hủy cấu trúc nhiễm sắc thể [22,39]

1.2.3.2 Tác dụng dược lý của dịch chiết sen và của nuciferin

Với y học cổ truyền, người ta sử dụng các bộ phận của cây sen trong những bài thuốc khác nhau dung để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau, ngày nay khoa học đã chứng minh được nhiều tác dụng của những bài thuốc cổ truyền có nguồn gốc từ các alkaloid có trong sen (nuciferin là alkaloid chính) cũng như tìm ra nhiều tác dụng mới của sen

- Tác dụng chống HIV: Với một số alkaloid được phân lập từ lá Nelumbo

nucifera ( Nymphaceae ), người ta đã chứng minh được tác dụng chống HIV

tốt thông qua các đánh giá các giá trị EC50 và TI (chỉ số điêu trị) Nuciferin là

alkaloid chính trong lá và phôi của Nelumbo nucifera, đây là một alkaloid

aporphin, tác dụng chống HIV ở EC50 là 0,8 µg/ml và TI là 36 [41]

- Tác dụng chống oxy hóa: Một nghiên cứu đã sử dụng dịch chiết cồn của

hạt Nelumbo nucifera để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa trên mô hình in

vitro và in vivo Tổng hàm lượng của các phenolic trong dịch chiết được tìm

thấy là 7,61 ± 0,04% ( kl/kl) Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng dọn gốc

tự do tốt thể hiện qua các giá trị IC50 thu được Tác dụng chống oxy hóa sử dụng phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) cho IC50 có giá trị là 6,12 ± 0,41 µg/ml Còn với phương pháp sử dụng nitric oxid là 84,86 ± 3,56 µg/ml Các giá trị IC50 ở trên đều ít hơn so với giá trị IC50 ở rutin trong thử tác

dụng chống oxy hóa với các phương pháp tương tự Ngoài ra, người ta đánh giá độc tính cấp của dịch chiết ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ , không thấy có dấu hiệu độc tính ở liều uống lên đến 1000 mg/kg trọng lượng cơ thể [37]

- Tác dụng chống sốt rét và kháng nấm của một số alkaloid được chiết được từ lá sen đã được thử nghiệm Kết quả cho thấy trong số các alkaloid đã được thử nghiệm thì một vài alkaloid có tác dụng chống sốt rét hoặc chống nấm Tuy nuciferin không có tác dụng này, nhưng người ta phát hiện ra một mối liên hệ cấu trúc và tác dụng có liên quan mật thiết với nhóm thế ở vị trí C1

và C2 trên vòng aporphin (hình 5) Đây được coi là một hướng nghiên cứu mới với việc gắn nhóm thế vào 2 vị trí này ở nuciferin [40]

- Kích thích tiết insulin: Nuciferin chiết từ lá sen có tác dụng kích thích

tiết insulin in vitro tốt hơn Glyburid Cơ chế kích thích tiết insulin bằng cách

đóng các kênh K+

- ATP , giải thích tác dụng chống bệnh tiểu đường của

Nelumbo nucifera [27,28]

- Dịch chiết ethanol của sen có tác dụng chống béo phì ở người, đồng thời

có tác dụng chống béo phì và chống oxy hóa ở chuột được cho ăn một chế độ giàu chất béo [19]

- Dịch chiết lá sen có đặc tính ức chế mạnh CYP2D6 in vitro (CYP2D6 là

một enzyme trong hệ thống Cytochrome P450 có liên quan đến chuyên hóa các thuốc trong cơ thể) Kết quả cho thấy dịch chiết cồn ức chế mạnh mẽ CYP2D6 với giá trị IC50 là 12,05 µg/mL và ức chế yếu các enzym khác Ngoài ra, phần alkaloid trong dịch chiết gây một tác dụng ức chế rõ rệt hơn về hoạt động CYP2D6 với giá trị IC50 là 0,96 µg/mL Ba alkaloid aporphin phân lập từ hỗn hợp alkaloid (nuciferin, nornuciferin, và 2-hydroxy-1-methoxyaporphin) ức chế đáng kể CYP2D6 với giá trị IC50 tương ứng là 3,78 , 3,76 và 3,15 µM [32]

- Một nghiên cứu tổng quan vào năm 2007 trên ―Journal of Agricultural

Technology‖ đã chỉ ra rất nhiều tác dụng của sen theo y học cổ truyền như: lợi

tiểu, bài tiết mồ hôi, kháng nấm, hạ sốt, điều trị tiêu chảy, nôn mửa, bệnh phong… Lá được sử dụng như thuốc hiệu quả cho các chứng nôn ra máu , chảy máu cam , ho ra máu , tiểu máu và băng huyết cơ thể trong thời gian sốt

và viêm da… Ngoài ra, các tác dụng khác cũng được chứng minh bằng kỹ thuật hiện đại như: Chống oxy hóa, chống ung thư, kháng virus, chống béo phì,… [36]

Có thể kết luận sen và các hoạt chất có trong sen, đặc biệt là các alkaloid với nuciferin là thành phần chính có thể có rất nhiều tác dụng sinh học, tác dụng tốt với nhiều bệnh mà hiện con người vẫn còn đang trong quá trình nghiên cứu và chưa tìm ra phương pháp chữa hiệu quả, sen và các alkaloid trong sen có một giá trị tiềm năng lớn về mặt khoa học trong tương lai

1.2.3.3 Một số tác dụng dược lý đã được nghiên cứu ở sản phẩm demethyl hóa

- Thành phần alkaloid từ nụ hoa và lá của hoa sen ( Nelumbo nucifera,

Nymphaeaceae) có khả năng ức chế hoạt động tạo melanin trong các tế bào

khối u ác tính B16: Dịch chiết methanol từ nụ hoa và lá của hoa sen (Nelumbo

nucifera, Nymphaeaceae) đã được chứng minh là có tác dụng ức chế hoạt động

tạo của khối u ác tính tế bào B16 4A5 ở chuột Trong số các thành phần phân

lập được, nuciferin, N-methyl-asimilobin, lirinidin, và 2-hydroxy-1-

methoxy-6a, 7-dehydroaporphin đã cho thấy: Nuciferin và N-methyl-asimilobin ức chế

sự biểu hiện của mRNA tyrosinase ở nồng độ 3-30 µM, N- methyl-asimilobin

ức chế sự biểu hiện của TRP -1 mRNA nồng độ 3-30 µM, và nuciferin ức chế

sự biểu hiện của TRP- 2 mRNA ở nồng độ 10-30 µM [15]

5 Công thức cấu tạo N-methyl-asimilobin

- Các alkaloid aporphin phân lập từ Nelumbo nucifera có tác dụng ức chế

acetylcholinesterase và theo điều tra ban đầu thấy có một mối tương quan giữa

cấu trúc và tác dụng: N-methyl-asimilobin (1), một cất ức chế mạnh

acetylcholinesterase (AChE), cùng với hai alkaloid aporphin có tác dụng kém

hơn là nuciferin (2) và nornuciferin (3) được tách ra từ Nelumbo nucifera N-

methyl-asimilobin (1) ức chế 50% hoạt động của AChE ở nồng độ 1,5 ± 0,2

µg ml -1 trong khi giá trị IC50 tiêu chuẩn của Physostigmine là 0,013 ± 0,002

µg ml -1.[17]

1.3 Tổng quan về các phương pháp demethyl hóa

1.3.1 Phương pháp O-demethyl hóa các aryl-methyl ether

A Phương pháp thế ái nhân

a Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Kirschk và cộng sự (1995)

Điều kiện phản ứng: Sử dụng LiI và quinolin ở nhiệu độ 140–180o

C trong 10–30 phút Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được sản phẩm demethyl hóa với hiệu suất 65–88% [29,38]

Hình 6 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiI và quinolin

b Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Bernard và cộng sự (1989)

Điều kiện phản ứng: Sử dụng tác nhân LiCl trong dung môi DMF, 4–72 giờ Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được sản phẩm demethyl hóa với hiệu suất 98% [8]

Hình 7 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiCl và DMF

B Phương pháp acid-base Lewis

a Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Parker và cộng sự (1981)

Điều kiện phản ứng: Sử dụng AlCl3 trong CH3CN, phản ứng diễn ra trong 3 giờ ở 0o

C Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được sản phẩm monodemethyl hóa với hiệu suất 75% Sử dụng phương pháp này có thể demethyl hóa chọn lọc ở acetophenol [24,38]

Hình 8 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlCl 3 trong CH 3 CN

b Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Horie và cộng sự (1975)

Điều kiện phản ứng: Giống như phản ứng của Parker và đồng sự, ở đây tác giả sử dụng AlBr3 trong dung môiCH3CN [18]

Hình 9 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlBr 3 trong CH 3 CN

C Phương pháp base trên một acid Bronsted

a Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Li và cộng sự (2000)

Điều kiện phản ứng: phản ứng diễn ra trong môi trường H2SO4 ở nhiệt

độ 70o

C trong 14 giờ Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được sản phẩm monodemethyl hóa với hiệu suất 52% [31]

Hình 10 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng H 2 SO 4

b Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Guigen và cộng sự

(1993)

Điều kiện phản ứng: Sử dụng HBr 48% với xúc tác NaI ở nhiệt độ 90–

94oC, bình kín Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được sản phẩm demethyl hóa với hiệu suất 90,2 % [16,38]

c Phản ứng demethyl hóa aryl – methyl ether của Kawasaki và cộng sự

(1971)

Điều kiện phản ứng: phản ứng diễn ra trong môi trường 48% HBr, AcOH, đun hồi lưu trong 30 phút Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được sản phẩm didemethyl hóa với hiệu suất 85%.[25,38]

Hình 12 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% và AcOH

1.3.2 Các phương pháp demethyl hóa nuciferin

Hình 11 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% và NaI

a Phương pháp monodemethyl hóa nuciferin của Feutrill và cộng sự

(1970)

Hình 13 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng EtSNa trong DMF

Tiến hành phản ứng: Cho nuciferin và natri thioethoxide (lượng gấp 2,6- 2,7 số mol của nuciferin) vào dung môi DMF đun hồi lưu (sục N2) ở nhiệt độ

100oC trong 3 giờ Kết thúc phản ứng: Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được sản phẩm monodemethyl nuciferin với hiệu suất khoảng 94-98% [14,26]

b Phương pháp didemethyl hóa nuciferin của Neumeyer và cộng sự

(1973)

Hình 14 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HI 57% và Ac 2 O

Tiến hành phản ứng: 4g Nuciferin, 6 ml HI 57% và 4,5 ml Ac2O được làm nóng ở 140o

C trong 30 phút Kết thúc phản ứng: Xử lý thu được sản phẩm didemethyl nuciferin (hiệu suất 82%) tinh thể hình kim không màu, tonc 286oC (C17H17NO2HI) [21,33]

c Phương pháp tridemethyl hóa nuciferin của Joseph và cộng sự (1975)

Tiến hành phản ứng: Nuciferin ( 0,48 g, 0,0015 mol) được làm nóng trong 25 ml HBr 48% (sục khí trơ N2) ở nhiệt độ 120 – 125 oC trong 3 giờ Kết thúc phản ứng: Xử lý hỗn hợp phản ứng bằng cách loại bỏ dung môi, hòa tan vào cồn, tẩy màu bằng than hoạt, bay hơi hết dung môi Sau đó kết tinh lại

trong n-Butanol-heptan, thu được sản phẩm tridemethyl nuciferin (hiệu suất

87%) có tonc 222 – 224 oC (C16H18BrNO2) [23]

1.4 Các phương pháp O-alkyl hóa bằng tác nhân 2-cloroethanol

2-cloroethanol là một tác nhân alkyl hóa quan trọng, đặc biệt nhất là tác nhân để tạo ra nhiều thuốc chống ung thư như Clorambucil, Melphalan,…

Một ví dụ quan trọng khác là Troxerutin – một hoạt chất có ý nghĩa quan trọng trong điều trị suy tĩnh mạch mạn tính, là sản phẩm của quá trình O-alkyl hóa rutin bằng tác nhân 2-cloroethanol

Dưới đây là một số phản ứng quan trọng có cơ chế tương tự với phản ứng O-alkyl hóa tạo dẫn chất của nuciferin:

1.4.1 Phương pháp sử dụng K 2 CO 3 trong dung môi acetonitril

Cho vào bình cầu nguyên liệu, dung môi acetonitril Thêm vào tác nhân 2-chloroethanol và xúc tác K2CO3 Đun hồi lưu phản ứng trong 18 giờ

Hình 15 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48%

Hình 16 Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K2 CO 3 trong dung môi CH 3 CN

Kết thúc phản ứng: lọc lấy dịch lọc đi bốc hơi và xử lý thu được sản

phẩm với hiệu suất 99% theo lý thuyết [34]

1.4.2 Phương pháp sử dụng K 2 CO 3 trong dung môi DMF

Nguyên liệu và 2-cloroethanol được hòa tan trong DMF (5 mL), bổ xung

K2CO3, phản ứng ở 100o

C trong 50 giờ Sau 12 giờ, thêm tác nhân cloroethanol để phản ứng tiếp tục diễn ra

2-Kết thúc phản ứng: Thêm nước cất vào hỗn hợp phản ứng, chiết bằng

CHCl3 Làm khan pha hữu cơ có chứa sản phẩm bằng Na2SO4 Bốc hơi dung

môi và xử lý thu được sản phẩm với hiệu suất 99,4% [35]

1.4.3 Phương pháp sử dụng NaOH trong nước

Cho vào bình cầu nguyên liệu cùng một lượng nước cất, khuấy tạo huyền phù

và sục khí N2 liên tục Thêm vào NaOH và nâng nhiệt độ lên 55oC Thêm tác

Hình 18 Phản ứng O-alkyl hóa trong môi trường NaOH loãng

NaOH

+ HO-CH2-CH2 -Cl

Hình 17 Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K2 CO 3 trong dung môi DMF

nhân 2-cloroethanol để phản ứng diễn ra Sau khi cho hết tác nhân alkyl hóa,

duy trì ở nhiệt độ trong thời gian 2 giờ

Kết thúc phản ứng: Xử lý hỗn hợp phản ứng thu đƣợc sản phẩm với hiệu suất khoảng 75-78% [4]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu

Nguyên liệu: lá Sen mua tại phố Lãn Ông, Hà Nội đã được phơi khô Qua quá trình chiết, phân lập và tinh chế tại phòng Tổng hợp Hóa dược Bộ môn Công nghiệp Dược- Trường Đại học Dược Hà Nội thu được nuciferin làm nguyên liệu cho các phản ứng bán tổng hợp

Các hóa chất và dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm đã được

thống kê trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm

5 Bản mỏng Silica gel 60 F254 Merck – Đức

7 Dimethylformamid Trung Quốc

9 Acid hydrobromic 48% Trung Quốc

12 Natri carbonat Trung Quốc

13 Natri hydroxyd Trung Quốc

Bảng 2.2 Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm

16 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker

AV-500MHz

Mỹ

18 Máy đo phổ khối lượng LC/MSD Trap - SL và

LC/MS/MS - Xevo TQ

Mỹ

19 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Đức

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Chiết nuciferin từ lá sen

- Thực hiện chiết alkaloid toàn phần trong lá sen

- Phân lập và tinh chế alkaloid toàn phần thu được nuciferin

- Kiểm tra độ tinh khiết của nuciferin bằng phương pháp SKLM và đo to

nc

2.3.2 Thực hiện demethyl hóa nuciferin

- Thực hiện demethyl hóa nuciferin bằng HBr 48%, khảo sát lượng HBr 48% và xúc tác KI ảnh hưởng đến hiệu suất và thời gian phản ứng

- Tách, tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm demethyl hóa thu được

- Xác định cấu trúc sản phẩm thông qua dữ liệu phân tích các phổ 1

NMR, phổ MS và phổ IR

H-2.3.3 Thực hiện O-alkyl hóa sản phẩm O-demethylnuciferin bằng tác nhân

EC

- Thực hiện phản ứng trong môi trường NaOH loãng, dung môi DMF và dung môi acetonitril

- Tách sản phẩm tinh khiết bằng phương pháp sắc ký điều chế

- Xác định cấu trúc sản phẩm thông qua dữ liệu phân tích các phổ 1

NMR, phổ MS

1 = dicloromethan : methanol = 9 : 1; Hệ dung môi 2 = n-butanol : acid acetic :

methanol = 9 : 2 : 2,5); pha dung dịch thử và dung dịch mẫu (hòa tan chất thử, chất mẫu vào methanol nồng độ khoảng 0,25%); để khô bản mỏng ngoài không khí sau đó triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 10 cm; quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm để theo dõi tiến triển của phản ứng và

sơ bộ xác định độ tinh khiết

- Sử dụng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt để sơ bộ định tính và xác định độ tinh khiết

- Sử dụng các phương pháp kết tinh, sắc ký điều chế để tách và tinh chế sản phẩm

Tổng hợp hóa học thực hiện tại Phòng Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội

2.4.2 Xác định cấu trúc sản phẩm

Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được được xác định bằng các phương pháp phổ: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân tử (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1

H-NMR)

- Phổ hồng ngoại (IR)

Được ghi tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1 Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm

- Phổ khối lượng phân tử (MS):

Được ghi theo phương pháp ESI tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy LC/MSD Trap - SL và máy LC/MS/MS-Xevo TQ

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1

H - NMR):

Được ghi tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Brucker AV-500MHz, sử dụng dung môi là DMSO và MEOD với chất chuẩn nội là tetramethylsilan

2.4.3 Thử tác dụng sinh học

Thử tác dụng chống oxy hóa: Phương pháp đánh giá tác dụng dọn gốc tự

do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ) và SOD (superoxide)

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Chiết, phân lập và tinh chế nuciferin từ lá sen

3.1.1 Quy trình chiết nuciferin

- Nguyên liệu: 4 kg lá sen được xay nhỏ thành bột

- Quy trình: Bột lá sen được làm ẩm bằng nước vôi trong (ủ trong 24 giờ

để thấm đều dược liệu), sau đó chiết nóng bằng dầu hỏa: mỗi mẻ 1kg bột lá sen với 6 lít dầu hỏa ở nhiệt độ khoảng 130o

C trong 2,5 giờ Dịch chiết dầu hỏa được lắc với 0,5 lít acid H2SO4 0,5% Sau đó gạn lấy lớp dầu đổ lại vào chiết tiếp bã lá sen vừa rồi sau đó lại gạn lấy lớp dầu và chiết bằng 0,5 lít acid

H2SO4 0,5% Như vậy cứ mỗi kg lá sen sẽ sử dụng 6 lít dầu hỏa và 1 lít H2SO4

0,5% (chiết 2 lần) Gộp dịch acid thu được, kiềm hóa dịch acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa cho đến pH 8, lọc thu được tủa alkaloid toàn phần, sấy khô ở 70oC

- Kết quả: Khối lượng alkaloid toàn phần thu được từ 4 kg lá sen là 25 g (0,625%)

3.1.2 Tinh chế Nuciferin

- Sử dụng phương pháp kết tinh lại trong cồn

- Cứ 5g alkaloid toàn phần hòa tan nóng hoàn toàn vào 250 ml cồn 96o

để lạnh cho kết tinh sau 24 giờ lọc thu được 3,45g nuciferin

- Kiểm tra độ tinh khiết của nuciferin thu được

 Đo to

nc: 166-167oC

 Độ tinh khiết kiểm tra sơ bộ bằng SKLM (triển khai bản mỏng bằng

Hệ dung môi 1): Quan sát bản mỏng dưởi đèn tử ngoại thấy trên bản mỏng có một vết duy nhất là nuciferin

3.2 Bán tổng hợp

5,5a,7,8-tetrahydro-2-hydroxy-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin (N-methyl-asimilobin, II)

3.2.1 Demethyl hóa Nuciferin sử dụng tác nhân HBr

- Phương trình phản ứng:

Hình 19 Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng HBr 48%

Chuẩn bị phản ứng: Cho nuciferin (0,48g, 0,0015 mol), HBr 48% (25

ml) vào bình cầu 2 cổ 100 ml, khuấy từ, có thiết bị sục khí N2 và sinh hàn hồi lưu

Tiến hành phản ứng: đưa phản ứng lên nhiệt độ 120 – 125 o

C trong 4 giờ

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Hỗn hợp được cất dưới áp suất giảm đến kiệt

dung môi Chất rắn thu được hòa tan trong cồn 96o (khoảng 250ml) nóng và được xử lý bằng than hoạt tính Sau đó cất thu hồi bớt dung môi còn 50 ml dịch thì để lạnh kết tinh Sau khoảng 24 giờ lọc lấy tinh thể, sấy ở 70o

C

Kết quả:

 mII = 0,37g (hiệu suất 62,9%)

 tonc = 214-217oC

 SKLM (triển khai với hệ dung môi 1) chấm 2 vết: vết dung dịch

mẫu là chất (I), vết dung dịch thử là chất (II) Kết quả cho thấy

sản phẩm tinh khiết với Rf (I)= 0,67 và Rf (II)= 0,60

Kết luận: Sau khi phân tích cấu trúc sản phẩm bằng phổ IR, MS, 1

H-NMR (mục 3.4) chúng tôi chứng minh được sản phẩm là

5,5a,7,8-tetrahydro-2-hydroxy-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin

Nhận xét: Thời gian phản ứng cũng là một yếu tố quan trọng trong

việc tạo thành sản phẩm (II) thể hiện ở chỗ:

 Một mặt: Nếu thời gian ngắn có thể phản ứng

không xảy ra hoàn toàn.

 Mặt khác: Thời gian kéo dài có thể xảy ra sự

O1-demethyl hóa của (II) để tạo thành sản

phẩm O1,O2-didemethyl hóa (III) hoặc xảy ra

sự N-demethyl hóa của (II) để tạo thành sản

phẩm O2, N-didemethyl hóa (IV)

Chính vì thế chúng tôi quyết định khảo sát lượng

HBr 48% (ml) ảnh hưởng đến thời gian phản ứng

Kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Khảo sát lượng HBr 48% (ml) ảnh hưởng đến thời gian phản ứng bán tổng

Nhận xét: Lượng HBr 48% cho vào phản ứng tỉ lệ nghịch với thời gian

phản ứng Tuy nhiên, một mặt lượng HBr không ảnh hưởng nhiều tới hiệu suất của phản ứng Mặt khác HBr 48% có nhiệt độ sôi ở 122o

C, khó để cất đi trong

Hình 20 Cấu trúc sản phẩm phụ (III) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin

Hình 21 Cấu trúc sản phẩm phụ (IV) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin

quá trình tinh chế sản phẩm Chính vì vậy chúng tôi quyết định chọn điều kiện phản ứng theo tỉ lệ 0,48 g nuciferin : 25ml HBr 48%

3.2.2 Tiến hành demethyl hóa nuciferin sử dụng tác nhân HBr xúc tác KI

- KI có tác dụng tạo ion I

là tác nhân ái nhân có vai trò xúc tác làm tăng tốc độ phản ứng Chính vì thế chúng tôi quyết định khảo sát lượng KI (mmol) ảnh hưởng đến thời gian phản ứng monodemethyl hóa nuciferin

- Thiết kế thí nghiệm: Tương tự như phần 3.2.1, kết quả khảo sát được

(ml)

KI (mmol)

Thời gian phản ứng (giờ)

Hiệu suất (%)

Chuẩn bị phản ứng: Cho nuciferin (0,48g, 0,0015 mol), KI (0,28g,

0,0017 mol), HBr 48% (25 ml) vào bình cầu 2 cổ 100 ml, khuấy từ, có thiết bị sục khí N2 và sinh hàn hồi lưu

Tiến hành phản ứng: đưa phản ứng lên nhiệt độ 120 – 125 o

C trong 3 giờ

Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Cất sạch dịch trong phản ứng thu được cặn

chất rắn màu vàng Hòa tan tủa vào 250 ml cồn 96o

nóng, xử lý màu bằng than hoạt tính Bay hơi bớt dịch còn khoảng 50ml, để lạnh kết tinh thành tinh thể hình kim, mịn Sau 24h lọc lấy tinh thể, sấy khô ở 70o

5,5a,7,8-tetrahydro-2-(2-hydroxyethyl)-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin (V) là sản phẩm O-alkyl hóa chất (II) bằng tác nhân

2-cloroethanol (EC)

Phương trình phản ứng:

Hình 23 Sơ đồ phản ứng tạo sản phẩm O-alkyl hóa nuciferin

3.3.1 Sử dụng môi trường NaOH loãng

Chuẩn bị phản ứng: Cho vào bình cầu 0,1 g chất (II) (0,28 mmol), thêm

11,6 ml NaOH 0,05M

Tiến hành phản ứng: Khuấy hỗn hợp trong 20 phút (sục N2 ) Thêm 0,16

ml EC (1,65 mmol) Theo dõi qua trình phản ứng bằng SKLM Kết thúc phản ứng sau 24 giờ

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sử dụng dicloromethan chiết hỗn hợp phản

ứng Lấy pha dicloromethan bốc hơi dung môi đến kiệt Hòa tan hỗn hợp thu được trong methanol, xử lý tạp màu bằng than hoạt tính Bay hơi hết dung môi, thêm 3ml dicloromethan để hòa tan Sử dụng sắc ký điều chế tách sản phẩm từ dịch dicloromethan

Kết quả:

 Dịch trước sắc ký điều chế: thử độ tinh khiết bằng SKLM (triển khai hệ dung

môi 2, dịch mẫu là chất (II), dịch thử là dịch xử lý của phản ứng trước sắc ký

điều chế), soi dưới đèn tử ngoại thu được 2 vết

- Vết 1 là (II), Rf= 0,53

- Vết 2 là (V), Rf= 0,46

 Sau sắc ký điều chế:

- Thu được 0,01g chất (V), hiệu suất 10%

- Kiểm nghiệm bằng SKLM cho thấy vết tách được là chất (V), chất tinh

khiết

*Sắc ký điều chế tách sản phẩm được tiến hành như sau: Chấm dung dịch sau xử lý phản ứng chứa 2 hoặc 3 vết lên những bản mỏng có kích thước 20 x 20 cm được tráng chất hấp phụ là silica gel G (Merck), đã hoạt hóa ở 110 o

C trong 1 giờ ( một bản mỏng cho một phản ứng với 0,1g nguyên liệu) Hệ dung môi khai triển là CHCl3 : MeOH (60 : 1) Bản mỏng để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó soi dưới “đèn soi UV sắc kí CN6” đánh dấu vùng chứa sản phẩm Cạo lấy silica gel chứa chất cần tách, phản hấp phụ bằng CHCl3 : MeOH (60 : 1) và lọc lấy dịch Bay hơi hết dung môi thu được sản phẩm cần tổng hợp

Nhận xét:

a Về sắc ký theo dõi phản ứng trong quá

trình phản ứng (triển khai hệ dung môi 2):

- Trên bản mỏng sắc ký thu được 4 vết

sản phẩm ký hiệu là V1 - V2 - V3 - V4 với giá

trị Rf lần lượt là: 0,53 – 0,46 – 0,40 – 0,32 ,

trong đó V1 là nguyên liệu (II) chưa phản ứng

- Sau khi chiết hỗn hợp phản ứng bằng

dicloromethan thì V1 và V2 chuyển sang pha

hữu cơ, dự đoán V2 là vết của sản phẩm (V)

cần tổng hợp Bởi trong môi trường base thì alkaloid tồn tại ở dạng base, có thể chiết dễ dàng sang pha hữu cơ, còn V3, V4 dự đoán là sản phẩm phụ, dự đoán

là chất (VI) và chất (VII) (muối amin bậc 4 của alkaloid, tan trong pha nước)

Hình 24 Cấu trúc sản phẩm phụ

(VI) của phản ứng O-alkyl hóa

b Về phương pháp sử dụng dung dịch NaOH loãng làm môi trường phản ứng: Dung dịch NaOH có thẻ là tác nhân kiềm mạnh nên dễ tạo sản phẩm phụ muối amin bậc 4 làm giảm hiệu suất phản ứng

3.3.2 Sử dụng dung môi DMF, xúc tác K 2 CO 3

Chuẩn bị phản ứng: Cho vào bình cầu

0,1 g chất (II) (0,28 mmol), 0,8 g K2CO3 (khan)

thêm 15 ml DMF (sục N2)

Tiến hành phản ứng: Khuấy hỗn hợp

trong 30 phút (sục N2 ) ở nhiệt độ 100oC Thêm

0,8 ml EC Theo dõi qua trình phản ứng bằng

SKLM Kết thúc phản ứng sau 45 giờ

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Lọc hỗn hợp

phản ứng loại muối vô cơ, dịch thu được đem

cô dưới áp suất giảm, thêm nhiều lần cồn 96o

để cất cùng làm quá trình bay hơi hết dịch tốn ít thời gian hơn Thêm nước và dicloromethan vào hỗn hợp thu được lắc và chiết lấy pha hữu cơ dicloromethan Sau đó xử lý pha

dicloromethan như phần 3.3.1 và tách lấy sản phẩm bằng sắc ký điều chế

Kết quả: Thu được 0,03g chất V, hiệu suất 30% Thử tinh khiết bằng

SKLM cho thấy sản phẩm thu được tinh khiết

Nhận xét:

- Sử dụng SKLM theo dõi quá trình phản ứng cho thấy lượng sản phẩm phụ tạo ra rất ít V3 và không tạo ra V4

- Dung môi DMF nhiệt độ sôi khá cao (152-154o

C) nên gây khó khăn trong quá trình xử lý hỗn hợp sản phẩm giai đoạn ngay sau phản ứng cần bay hơi hết dung môi

3.3.3 Sử dụng dung môi acetonitril, xúc tác K 2 CO 3

Hình 25 Cấu trúc sản phẩm phụ

(VII) của phản ứng O-alkyl hóa