Tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất n hydroxypropenamid mang khung 3 hydroxymino 2 oxoindolin

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN HÒA TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT N- HYDROXYPROPENAMID MANG KHUNG 3-HYDROXYIMINO-2- OXOINDOLIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN HÒA TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT N- HYDROXYPROPENAMID MANG KHUNG 3-HYDROXYIMINO-2- OXOINDOLIN Ngƣời hƣớng dẫn: DS. Đỗ Thị Mai Dung Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy cô và các bạn, những ngƣời đã đồng hành, hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian qua. Trƣớc hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời cám ơn chân thành đến PGS.TS. Nguyễn Hải Nam, DS. Đỗ Thị Mai Dung – Bộ môn Hóa Dƣợc – trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, những ngƣời thầy, cô đã trực tiếp hƣớng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dƣợc – trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, Khoa Hóa – Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, Khoa Dƣợc – Đại học Quốc gia Chungbuk – Hàn Quốc đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2105 Sinh viên Nguyễn Văn Hòa MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) 2 1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase 2 1.1.2. Phân loại các HDAC 3 1.1.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và hoạt động bất thƣờng của HADC 4 1.1.4. Cấu trúc trung tâm hoạt động của các HDAC 5 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 7 1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC 7 1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 8 1.2.2.1. Các chất HDACi ức chế chu trình tế bào, hoạt hóa các chƣơng trình biệt hóa 9 1.2.2.2. Các chất HDACi điều hòa sự gây chết tế bào theo chƣơng trình 10 1.2.2.3. Các chất HDACi ức chế sự tạo mạch 11 1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 12 1.2.4. Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC 13 1.3. MỘT SỐ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI 14 CHƢƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 17 2.1.1. Hóa chất 17 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 17 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17 2.2.1. Tổng hợp hóa học 17 2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp đƣợc 18 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1. Tổng hợp hóa học 18 2.3.2. Thử tác dụng sinh học 19 2.3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC 19 2.3.2.2. Thử độc tính tế bào 20 2.3.3. Đánh giá mức độ giống thuốc của chất tổng hợp đƣợc 22 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KÊT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1. HÓA HỌC 23 3.1.1. Tổng hợp hóa học 23 3.1.2: Kiểm tra độ tinh khiết 29 3.1.3. Xác định cấu trúc 30 3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 37 3.2.1. Thử hoạt tính sinh học 37 3.2.1.1. Tác dụng ức chế HDAC 37 3.2.1.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro 37 3.3. BÀN LUẬN 37 3.3.1. Tổng hợp hóa học 37 39 3.3.2.1: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC 39 3.3.2.2: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro 41 3.3.2.3: Phân tích mối liên quan giữa tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các chất tổng hợp đƣợc 42 3.3.2.4. Phân tích mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng ức chế HDAC2 của các chất tổng hợp đƣợc 43 3.3.2.5. Đánh giá sự khác nhau về độc tính trên tế bào ung thƣ bằng việc thay đổi cấu trúc PXD-101 ở nhóm khóa hoạt động và cầu nối. 43 3.3.3. Đánh giá mức độ giống thuốc theo quy tắc Lipinski 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AML Ung thƣ tế bào máu dòng tủy cấp tính 13 C-NMR Phổ cộng hƣơng từ carbon 1 HNMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton APL Ung thƣ bạch cầu tiền tủy bào cấp tính AsPC-1 Dòng tế bào ung thƣ tuyến tuỵ CTCL U tế bào lympho T dƣới da (Cutaneous T cell lymphoma) DCM Dicloromethan DHFR Dihydrofolat reductase DMF Dimethylformamid DMSO Dimethyl sulfoxid HAT Histon acetyltranferase HDAC Histon deacetylase HDACi Histon deacetylase inhibitors HDACs HDAC của nấm men IR Phổ hồng ngoại MeOH Methanol MS Phổ khối lƣợng NSCLC Ung thƣ phổi tế bào tế bào không nhỏ (non-small lung cell) NST Nhiễm sắc thể PC-3 Dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt SAHA Acid sulberoylanillid hydroxamic SW620 Dòng tế bào ung thƣ đại tràng TLC Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng T o nc Nhiệt độ nóng chảy TSA Trichosatin A DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng 8 2 Bảng 1.2: Kết quả thử tác dụng ức chế các loại HDAC của CN89 và CN107 15 3 Bảng 1.3: Kết quả thử độc tính trên các dòng tế bào ung thƣ ngƣời của các dẫn chất N-hydroxy-(4-oxime)-cinnamid 16 4 Bảng 3.1: Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic từ ester 29 5 Bảng 3.2: Giá trị R f và nhiệt độ nóng chảy (T o nc ) của các chất 3a-d 30 6 Bảng 3.3: Kết quả phân tích phổ IR của các chất 3a-d 32 7 Bảng 3.4: Kết quả phân tích phổ MS của các chất 3a-d 32 8 Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR của các chất 3a-d 35 9 Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR của các chất 3a-d 36 11 3.7: 3a-d 41 3.8 ử 42 12 Bảng 3.9: Khả năng ức chế HDAC2 và các tế bào ung thƣ SW620, PC-3,AssPC-1 44 13 Bảng 3.10: Kết quả thử độc tính trên tế ủa bào ung thƣ của các chất 4a,4b,4c,4g 44 Bảng 3.11 : So sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ SW620 của 2 dãy 4a, 4b, 3c,4g và 3a, 3b, 3c, 3d. 45 Bảng 3.12: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 3a-d theo qui tắc Lipinski 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1: Cấu trúc của histon trong nucleosom 2 2 Hình 1.2: Quá trình deacetyl hóa nhờ HDAC và quá trình aceyl hóa nhờ HAT 3 3 Hình 1.3: Phân loại các nhóm I, II và IV HDACs theo cấu trúc và vị trí 4 4 Hình 1.4: Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I 6 6 5 Hình 1.5:Một số chất ức chế HDAC điển hình 7 6 Hình 1.6: Mô hình phiên mã các hoạt động chống ung thƣ của HDACi 10 7 Hình 1.7: Cấu trúc cơ bản của chất ức chế HDAC 13 8 Hình 1.8: Cấu trúc một số chất ức chế HDAC 13 15 9 Hình 1.9: Cấu trúc và sơ đồ tổng hợp CN89 và CN107 15 15 10 Hình 3.1: Đánh giá mức độ ức chế HDAC theo phƣơng pháp Western blot 40 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ STT Tên sơ đồ Trang 1 Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng hợp chung 23 2 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ tổng hợp chất 2a 23 3 Sơ đồ 3.3: Sơ đồ tổng hợp chất 3a 24 4 Sơ đồ 3.4: Sơ đồ tổng hợp chất 2b 26 5 Sơ đồ 3.5: Sơ đồ tổng hợp chất 3b 26 6 Sơ đồ 3.6: Sơ đồ tổng hợp chất 2c 27 7 Sơ đồ 3.7: Sơ đồ tổng hợp chất 3c 27 8 Sơ đồ 3.8: Sơ đồ tổng hợp chất 2d 28 9 Sơ đồ 3.9: Sơ đồ tổng hợp chất 3d 28 10 Sơ đồ 3.10: Sự phân mảnh ở chất 3c và 3d 33 11 Sơ đồ 3.11: Cơ chế phản ứng tạo hợp chất 2a-d 37 12 Sơ đồ 3.12: Cơ chế phản ứng tạo hợp chất 3a-d 38 [...]... -3- (4-((7-chloro -3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin- 1-yl)methyl)phenyl)-Nhydroxyacrylamid(3d) 2. 2 .2 Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp đƣợc - Thử tác dụng ức chế HDAC - Thử độc tính tr n một số tế bào ung thƣ: ung thƣ đại tràng (SW 620 ), ung thƣ tuy n ti n liệt (PC -3) , ung thƣ tuy n tụy (AsPc-1) - Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các chất tổng hợp đƣợc 2 .3 PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU 2 .3. 1 Tổng hợp hóa học 2 .3. 1.1 Tổng hợp - Dựa tr n những nguy n tắc và. .. nhƣ 3- hydroxyimino- 2oxoindolin cho hoạt tính in vitro rất khả quan [2] .Mới đây belinostat (PXD-101) do Novartis tổng hợp đã đƣợc chứng minh là có tác dụng ức chế mạnh các HDAC nhóm I và II[50] Tr n cơ sở các nghi n cứu tr n, chúng tôi ti n hành thay thế nhóm nh n di n bề mặt của PXD-101 vớ - - - Tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số d n chất Nhydroxypropenamid mang khung 3- hydroxyimino -2- oxoindolin ... N- hydroxy -3- (4-( (3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin- 1- yl)methyl)phenyl)acrylamid(3a) a Tổng hợp chất 2a Chất methyl 3- (4-( (2 ,3- dioxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)acrylat (2a) đƣợc tổng hợp từ isatin (1a) qua ph n ứng thế ái nh n với methyl 3- (4bromomethyl)phenyl)prop -2- enoat với xúc tác là base K2CO3 theo sơ đồ 3. 2: O O OCH3 O N H + O K2CO3 24 h OCH3 O N O Br 1a 2a Sơ đồ 3. 2: Sơ đồ tổng hợp chất 2a * Ti n hành ph n ứng: 24 - Hòa tan... trình bày trong bảng 3. 1 - Chất 3a tổng hợp đƣợc đƣợc xác định cấu trúc bằng các phổ IR, MS, 1HNMR, 13C-NMR Kết quả cụ thể đƣợc trình bày trong ph n 3. 1 .3 3.1.1 .2: Tổng hợp 3- (4-((5-fluoro -3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin- 1- 26 yl)methyl)phenyl) -N- hydroxyacrylamid (3b) a Tổng hợp chất 2b Để tổng hợp chất 3b c n tổng hợp chất methyl 3- (4-((5-fluoro -2, 3dioxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)acrylat (2b) O OCH3... phổ 1H-NMR và 13C-NMR 2. 2 N I DUNG NGHI N CỨU 2. 2.1 Tổng hợp hóa học 18 * Tổng hợp 4 chất: - N- hydroxy -3- (4-( (3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin- 1-yl)methyl)phenyl)acrylamid (3a) -3- (4-((5-fluoro -3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin- 1-yl)methyl)phenyl)-Nhydroxyacrylamid(3b) -3- (4-((5-chloro -3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin- 1-yl)methyl)phenyl)-Nhydroxyacrylamid(3c) -3- (4-((7-chloro -3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin- 1-yl)methyl)phenyl)-Nhydroxyacrylamid(3d)... N N HN CH3 H3C CN107 panobinostat Hình 1.9:Cấu trúc và sơ đồ tổng hợp CN89 và CN107 Bảng1 .2: Kết quả thử tác dụng ức chế các loại HDAC của CN89 và CN107 Hợp chất CN89 CN107 HDAC1 4.01 5.01 0.19 HDAC2 11. 02 32 . 02 1.15 HDAC3 3. 00 3. 40 0 .38 HDAC6 2. 20 5. 02 1.60 HDAC7 428 00. 03 44488.01 20 44.01 HDAC8 1 020 .01 150. 02 1044.04 HDAC9 IC50[nM](1) SAHA 70000. 02 16904. 03 4849. 02 Ghi chú: 1N ng độ tối thiểu các chất. .. F K2CO3 OCH3 O N 24 h O Br N H 2b 1b Sơ đồ 3. 4:Sơ đồ tổng hợp chất 2b Qui trình tổng hợp chất 2b từ 0,1 637 g (1 mmol) chất 5-fluoroisatin (1b) đƣợc thực hi n tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất 2a * Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: - Cảm quan: bột màu vàng - Hiệu suất: 77, 13% (0 ,26 15 g) - Rf = 0,57 (hexan/aceton = 6/4) b Tổng hợp chất 3b N OH NH2OH.HCl , NaOH O F F O OCH3 N MeOH, THF, H2O -5oC, 1.5 - 2 h NHOH O N O... N- hydroxy -3- (4-( (3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin- 1-yl)methyl) phenyl)acrylamid(3a) đƣợc tổng hợp bằng ph n ứng tạo acid hydroxamic giữa chất 2a với hydroxylamin hydroclorid theo sơ đồ 3. 3 nhƣ sau: NH2OH.HCl , NaOH O O OCH3 N MeOH, THF, H2O -5oC, 1.5 - 2 h N OH NHOH O N O O 2a 3a Sơ đồ 3. 3:Sơ đồ tổng hợp chất 3a * Ti n hành ph n ứng - Cho 0,1600 g (0,5 mmol) chất 2a vào trong bình cầu đáy tr n dung tích 100 25 ml và hòa tan với h n hợp dung môi... Tổng hợp hóa học Quá trình tổng hợp 4 chất trong khóa lu n đƣợc thực hi n theo sơ đồ chung nhƣ sau (sơ đồ 3. 1): O O i O R R OCH3 O N N H O 1a-d 2a-d N OH ii R NHOH O N O 3a-d Sơ đồ 3. 1.Quy trình tổng hợp chung Tác nh n và điều ki n: i) methyl 3- (4-(bromomethyl)phenyl)prop -2- enoat, K2CO3, DMF, 24 h;ii) Hydroxamin hydroclorid, NaOH, MeOH, THF, H2O, -5oC, 1,5 - 2 h 3. 1.1.1 Tổng hợp N- hydroxy -3- (4-( (3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin- 1-... nhƣ sau: 1 Tổng hợp N- hydroxy -3- (4-( (3- (hydroxyimino) -2- oxoindolin- 1- yl)methyl)phenyl)acrylamidvà các d n chất 2 Thử độc tính tế bào, tác dụng ức chế HDAC của các chất tổng hợp đƣợc 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) Tất cả bộ gen của ngƣời đƣợc gói vào trong nhiễm sắc thể (NST), một phức hợp đại ph n tử (protein-AND) có cấu trúc động NST bao gồm các proteinhiston và protein không . PXD-101 vớ - - - Tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất N- hydroxypropenamid mang khung 3- hydroxyimino-2 -oxoindolin với hai mục tiêu nhƣ sau: 1. Tổng hợp N-hydroxy -3 - ( 4-( ( 3- (hydroxyimino )-2 -oxoindolin- 1- yl)methyl)phenyl)acrylamidvà. HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN HÒA TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT N- HYDROXYPROPENAMID MANG KHUNG 3- HYDROXYIMINO- 2- OXOINDOLIN. hoạt tính sinh học 37 3. 2.1.1. Tác dụng ức chế HDAC 37 3. 2.1.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro 37 3. 3. BÀN LUẬN 37 3. 3.1. Tổng hợp hóa học 37 39 3. 3.2.1: Kết quả thử tác dụng ức