3.2.1.1. Tác dụng ức chế HDAC
Các acid hydroxamic 3a-d đƣợc thử tác dụng ức chế HDAC tại khoa Dƣợc, Đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc).Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.10 trong phần bàn luận.
3.2.1.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro
Các chất 3a-d đƣợc đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thƣ ngƣời trên các dòng tế bào ung thƣ: ung thƣ đại tràng (SW 620), ung thƣ biểu mô tuyến tiền liệt (PC-3) và ung thƣ tuyến tụy (AsPc-1). Kết quả giá trị IC50 cụ thể của các chất đƣợc trình bày trong bảng 10 trong phần bàn luận.
3.3. BÀN LUẬN
3.3.1. Tổng hợp hóa học
Các acid hydroxamic 3a-d đƣợc tổng hợp qua 2 bƣớc:
- Bƣớc 1 là phản ứng alkyl hóa giữa isatin và các dẫn chất thế ở vị trí số 5 và 7 với methyl 3-(4-bromomethyl)phenyl)prop-2-enoat, phản ứng đƣợc thực hiện theo cơ chế thế ái nhânSN2 với sơ đồ sau:
R Br K2CO3 N H O O N O O R N O O + Br 1a-d 2a-d R R R
Sơ đồ 3.11: Cơ chế phản ứng tạo hợp chất 2a-d
Chất 2a-d có màu vàng và đƣợc sử dụng cho bƣớc tiếp theo.
- Bƣớc 2 là phản ứng thế SN2 ở hợp chất ester, phản ứng thế nhóm methoxyl bằng tác nhân NH2OH và nó phải đƣợc giải phóng dƣới dạng tự do từ NH2OH.HCl trong dung dịch NaOH. (Vì NH2OH không bền do đó không sử dụng trực tiếp mà
phải xử dụng gián tiếp qua dạng muối clorid bền hơn). Cơ chế phản ứng nhƣ sau: NH2OH.HCl + NaOH NH2OH + NaCl + H2O
Sơ đồ 3.12:Cơ chế phản ứng tạo hợp chất 3a-d
Các chất 3a-d và các chất trung gian đã tổng hợp đƣợc nhìn chung là các chất có cấu tạo phức tạp, có mạch C dài, có các nhóm chức nhạy cảm với các yếu tố của môi trƣờng phản ứng. Vì vậy, trong quá trình tổng hợp cần đảm bảo nghiêm ngặt về điều kiện phản ứng. Cụ thể:
- Các phản ứng tổng hợp ester trung gian 2a-d là các phản ứng alkyl hóa, xảy ra khá dễ dàng và đạt hiệu suất tƣơng đối cao (72-96%). Tuy nhiên, do sản phẩm và chất tham gia có nhóm chức ester nên khi tiến hành phản ứng cần đảm bảo dụng cụ phải khô hoàn toàn, các hóa chất và dung môi phải khan nƣớc để tránh việc nhóm chức ester bị thủy phân. Đồng thời cần theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng để xác định thời điểm kết thúc phản ứng, tránh tạo ra sản phẩm phụ trong quá trình phản ứng. Hơn nữa, trong quá trình thực hiện phản ứng, nhận thấy rằng việc hòa tan dẫn chất isatin và methyl 3-(4-(bromomethyl)phenyl)acrylat hoàn toàn trong DMF trƣớc rồi sau đó cho K2CO3 đã nghiền nhỏ vào, tránh sự vón cục của K2CO3 sẽ cho sản phẩm ester tƣơng đối tinh khiết và hiệu suất cao hơn.
- Với các phản ứng tổng hợp acid hydroxamic 3a-d: để tránh phân hủy ester thành acid carboxylic bởi dung dịch NaOH đậm đặc, hỗn hợp chất phản ứng 2a-d
và NH2OH.HCl và dung dịch NaOH cần đƣợc làm lạnh đến 0-5oC trong hỗn hợp đá muối trƣớc khi cho vào bình phản ứng.Khi nhỏ NaOH cần phải nhỏ từ từ để tránh dung dịch trong bình phản ứng bị quá nhiệt và lƣợng NaOH dƣ quá nhiều (tính tại thời điểm tức thời/đơn vị thể tích) dẫn tới nhóm chức ester của chất tham gia, NH2OH và nhóm chức amid của sản phẩm bị phân hủy do nhiệt độ tăng cao. Hơn nữa, phản ứng cũng cần đƣợc tiến hành ở nhiệt độ thấp (0oC) trong thời gian ngắn
để tránh bị phân hủy nhóm chức amid. Lƣợng NaOH cần dùng dƣ để chuyển hết NH2OH.HCl thành dạng NH2OH tan và đồng thời đảm bảo các acid hydroxamic tạo thành tan hết trong dung dịch phản ứng.
Ngoài ra, phản ứng cũng cần đƣợc theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng để xác định thời điểm kết thúc phản ứng, tránh thực hiện phản ứng quá lâu, dẫn tới tạo thành sản phẩm phụ.
3.3.2:
3.3.2.1: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC
Các enzym HDAC điều khiển quá trình deacetyl hoá histon, do đó dựa trên mức độ ức chế quá trình deacetyl hoá histon có thể đánh giá khả năng ức chế HDAC của các chất tổng hợp đƣợc. Mức độ ức chế quá trình deacetyl hoá histon của các dẫn chất 3a-d ở nồng độ 3 μM đƣợc đánh giá dựa trên phƣơng pháp Western blot.
Các chất3a-d đƣợc đem đi thử tác dụng ức chế HDAC tại khoa Dƣợc, Đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc).Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 10 và hình 3.1.
Trên hình ảnh điện di (hình 3.1), có sự xuất hiện vết của cả 4 chất 3a-d, sự xuất hiện vết biểu thị sự có mặt của acetyl-histon H3 và acetyl-histon H4. Kết quả trên cho thấy các dẫn chất 3a-d đã ức chế HDAC nên acetyl-histon H3 và acetyl-histon H4 không bị deacetyl hoá hoàn toàn. Nhƣ vậy, cả 4 dẫn chất 3a-d đều làm cho hoạt tính enzym bị ức chế khi thử tại nồng độ 3µM.
Dựa trên kết quả thử theo phƣơng pháp Western blot, các dẫn chất 3a-d tiếp tục đƣợc đem định lƣợng nồng độ ức chế 50% hoạt động deacetyl hoá của HDAC (IC50). Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.7.
Hình 3.1: Đánh giá mức độ ức chế HDAC theo phương pháp Western blot
Ghi chú: Dòng tế bào thử nghiệm: SW620; Nồng độ mẫu thử: 3 μM; Thời gian thử: 24 h.VH: mẫu trắng; SAHA: acid suberoylanilid hydroxamic; GAPDH: glyceraldehyd 3-phosphat
dehydrogenase. 3.7: 2 3a-d N N O O NHOH OH R R Tác dụng ức chế HDAC HDAC2(IC50)1 (µg/ml) (µM) 3a H + 0,039 0,116 3b 5-F + 0,054 0,152 3c 5-Cl + 0,032 0,086 3d 7-Cl + 0,166 0,447 SAHA + 0,486 1,840
:1Nồng độ (µM) làm ức chế 50% sự phát triển của tế bào.
Bảng trên cho thấy tất cả các chất này đều có tác dụng ức chế hoàn toàn HDAC2 ở nồng độ dƣới 10 µg/mL, khả năng ức chế HDAC2 ở nồng độ dƣới 0.5 μM và đều có tác dụng tốt hơn SAHA khoảng hơn 6 lần.Khả ứng ức chế HDAC2 mạnh nhất là chất 3c với IC50 = 0,086 μM, chất 3a và 3b gần nhƣ tƣơng tự 3c, chất có khả năng ức chế HDAC2 yếu nhất là 3d.So sánh với kết quả dựa theo phƣơng
pháp Western blot ta thấy có sự tƣơng đồng. Chất 3a-c cho vết rất đậm trong khi đó chất 3d cho vết rất nhạt.
Tuy nhiên để có thể gây ra độc tính với tế bào, các chất phải có khả năng thấm qua màng sinh học và tiếp cận đƣợc với HDAC. Do đó chúng tôi tiếp tục hành thử độc tính tế bào in vitro ế bào: ung thƣ đạ
li - (AsPC- . Kết
quả đƣợc trình bày ở bảng 9:
3.3.2.2: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro
3.8 thử N N O O NHOH OH R R (IC50)1 SW6202 PC-33 AsPC-14 (µg/ml) (µM) (µg/ml) (µM) (µg/ml) (µM) 3a H 0,761 2,26 0,450 1,33 0,322 0,95 3b 5-F 0,322 0,91 0,459 1,29 0,517 1,46 3c 5-Cl 0,336 0,90 0,174 0,47 0,302 0,81 3d 7-Cl 0,832 2,24 0,723 1,94 0,626 1,68 SAHA 0,976 3,26 0,426 1,75 0,665 3,19
Ghi chú: :1Nồng độ (µM) làm ức chế 50% sự phát triển của tế bào. Các kết quả được lấy trung bình qua 3 lần thử nghiệm với độ sai lệch không quá 10%; 2Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư SW620; 3Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư PC- 34Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư AsPC-1.
Thử nghiệm tiến hành trên 3 dòng tế bào ung thƣ đạ
t PC-3 AsPC-1cho thấy IC50 của các
3a-d đều nhỏ hơn 1 µg/ml, tức là cả 4 chất đều có hoạ ế bào ung thƣ SW620, PC-3, AsPC-1.
Dựa vào số liệu của bảng 3.8 ta thấy:
- Trên dòng tế bào ung thƣ đại tràng SW620: Chất 2b, 3c có hoạt tính mạnh nhất lần lƣợt với IC50 là 0,91 và 0,90 µM.
-3: Chất 3c có hoạt tính mạnh nhất với IC50 = 0,47 µM.Trên dòng AsPC-1: Chất 3c có hoạt tính mạnh nhất, chất 3a hoạt tính gần với 3c. 3.3.2.3: Phân tích mối liên quan giữa tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các chất tổng hợp đƣợc
Bảng3.9: Khả năng ức chế HDAC2 và các tế bào ung thư SW620, PC-3,AssPC-1.
N N O O NHOH OH R Chất R Tỷ lệ IC50 (µM): SAHA/dẫn chất HDAC2 (IC50)1 LogP SW620 PC-3 AsPC-1 3a H 1,44 1,32 3,36 0,116 2,77 3b 5-F 3,58 1,35 2,18 0,152 2,97 3c 5-Cl 3,63 3,72 3,94 0,086 3,41 3d 7-Cl 1,46 0,90 1,90 0,447 3,41 SAHA 1 1 1 1,840 1,84
:1Nồng độ (µM) làm ức chế 50% sự phát triển của tế bào
* Nhận xét:
Dựa vào bảng 3.9ta thấy:
Khả ứng ức chế HDAC2 mạnh nhất là chất 3c, chất 3a và 3b gần nhƣ tƣơng tự
3c, chất có khả năng ức chế HDAC2 yếu nhất là 3d.
Chất 3c luôn có hoạt tính kháng ung thƣ cao nhất ở cả 3 dòng tế bào.Chất 3d
có hoạt tính kháng ung thƣ gần nhƣ thấp nhất ở cả 3 dòng tế bào. Chất 3b có hoạt tính kháng ung thƣ cao hơn chất 3a ở 2 dòng tế bào SW620 và PC-3, hoạt tính cao hơn hoặc tƣơng tự chất 3d.Ta thấy khả năng ức chế HDAC2 của các chất này lớn hơn 6 lần so với SAHA, tuy nhiên hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các chất trên so với SAHA tối đa không quá 4 lần, thậm chí đối với chất 3d hoạt tính kháng tế bào ung thƣ PC-3 còn kém hơn SAHA. Nhƣ vậy khả năng ức chế HDAC tốt không đồng nghĩa với hoạt tính kháng tế bào ung thƣ cao, và nó phụ thuộc vào từng loại tế bào ung thƣ.
3.3.2.4. Phân tích mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng ức chế HDAC2 của các chất tổng hợp đƣợc các chất tổng hợp đƣợc
Kết quả thử độc tính tế bào cũng cho thấy sự thay đổi nhóm thế R làm thay đổi tác dụngức chế HDAC2 khá rõ rệt. Lấy số liệu từ bảng 3.7 và 3.9 cho ra kết quả nhƣ sau:
Nhận thấy mối liên hệ giữa vị trí nhóm thế và nhóm thế có ảnh hƣởng tới khả năng ức chế HDAC2 nhƣ sau: thế nhóm thế vào vị trí số 5” đa số cho hoạt tính cao hơn so với không thế;thay F bằng Cl ở vị trí 5” làm tăng tác dụng kháng HDAC2; thế ở vị trí 7” làm giảm rõ rệt khả năng ức chế HDAC2.
Giả thiết do các nguyên nhân sau đây:
Vị trí 7” có cấu trúc không gian không phù hợp với cấu trúc không gian trung tâm hoạt động của HDAC và vị trí 5” lại phù hợp với cấu trúc không gian trung tâm hoạt động của HDAC cho nên thế ở vị trí 5” cho tác dụng ức chế tốt hơn khi thế ở vị trí 7” .Dẫn chất cloro kích thƣớc lớn hơn dẫn chất fluoro do đó làm tăng lực Van der Waals với kênh enzym vì vậy thế bẳng 5-Cl cho tác dụng ức chế tốt hơn khi thế bằng 5-F. Việc thế hydro ở nhân thơm bằng các nhóm hút điện tử nhƣ -Cl, -F tạo nên hệ số phân bố dầu-nƣớc thích hợp, dẫn tới chúng dễ thấm qua màng tế bào vào trong tế bào gây ra tác dụng.
3.3.2.5. Đánh giá sự khác nhau về độc tính trên tế bào ungthƣbằng việc thay đổi cấu trúc PXD-101 ở nhóm khóa hoạt động và cầu nối. đổi cấu trúc PXD-101 ở nhóm khóa hoạt động và cầu nối.
3 chấ - - -
6 carbon trong báo cáo của Trần Thị Lan Hƣơng và cộng sự trên Tạp chí Nghiên cứu dƣợc & Thông tin thuốc, năm 2014, số 6[2], kết quả so sánh đƣợc hiển thị trong bảng 3.10 và bảng 3.11.
Bảng 3.10: Kết quả thử độc tính trên tế của bào ung thư của các chất 4a,4b,4c,4d N O NOCH3 O NHOH R 4a: R = H 4b: R = 5-F 4c: R= 5-Cl 4d: R =7-Cl Chất R / SW620 (IC501µM) 4a H 0,64 4b 5-F 0,11 4c 5-Cl 0,65 4d 7-Cl 1,05 SAHA 3,70
: 1Nồng độ (µM) làm ức chế 50% sự phát triển của tế bào. Các kết quả được lấy trung bình qua 3 lần thử nghiệm với độ sai lệch không quá 10%.
Bảng 3.11 :So sánh tác dụng kháng tế bào ung thư SW620 của 2 dãy 4a, 4b, 3c,4d và 3a, 3b, 3c, 3d. N N O O NHOH OH R N O NOCH3 O NHOH R 4a,b,c,g 3a-d 4a: R = H 4b: R = 5-F 4c: R= 5-Cl 4d: R =7-Cl 3a: R = H 3b: R = 5-F 3c: R = 5-Cl 3d: R =7-Cl TT Chất SW620 1 4a / 3a 4,0 2 4b / 3b 9,4 3 4c / 3c 1,6 4 4d / 3d 2,4
: 1Nồng độ (µM) làm ức chế 50% sự phát triển của tế bào. Các kết quả được lấy trung bình qua 3 lần thử nghiệm với độ sai lệch không quá 10%.
Nhận xét: Kết quả so sánh cho thấy sự thay đổi cầu nối từ mạch 6 carbon sang mạch (4-methylphenyl)vinyl dựa trên cấu trúc của PXD-101 có sự giảm hoạt tính trên tế bào ung thƣ SW620, hoạt tính của chất 3c và 4c không thay đổi nhiều. Tất cả các chất đều có độc tính trên SW620 mạnh hơn SAHA. Nhƣ vậy việc thay đổi nhóm khóa hoạt động dựa trên PXD-101 vẫn cho kết quả khá khả quan về khả năng ức chế HDAC và khối u. Với những kết quả thu đƣợc có thể việc thay đổi cầu nối carbon mạch thẳng có độ dài 6C giữa nhóm khóa hoạt động và nhóm NHOH của SAHA bằng cầu nối có chứa nhân thơm cũng nhƣ việc thay thế nhân phenyl của SAHA bằng khung 3-hydroxyimino-2oxoindolin là phù hợp để mang lại hoạt tính ức chế HDAC cũng nhƣ độc tính trên tế bào ung thƣ. Những sự thay thế này mang lại nhiều triển vọng sẽ là những hƣớng đi mới nhằm tìm ra các chất ức chế HDAC có hoạt tính tốt.
3.3.3. Đánh giá mức độ giống thuốc theo quy tắc Lipinski
Các quy tắc của Lipinski bao gồm các tiêu chí về cấu tạo để một thuốc có khả năng đạt đƣợc sự hấp thu và thấm tốt qua màng tế bào. Theo thống kê, khoảng 80% thuốc đang sử dụng đạt các tiêu chí của quy tắc Lipinski [41]. Nhƣ vậy, nếu một dẫn chất có hoạt tính sinh học tốt và thoả mãn quy tắc Lipinski, tỷ lệ thành công trở thành thuốc sẽ cao hơn nhiều lần so với các chất không thoả mãn quy tắc này.Kết quả đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 3a-d theo qui tắc Lipinski (bảng 3.12)
Nhận xét: Tất cả các chất đều thỏa mãn đƣợc 4 yêu cầu của qui tắc Lipinsky về mức độ giống thuốc. Cùng với kết quả thử hoạt tính sinh học in vitro tốt, các chất có nhiều triển vọng cho việc nghiên cứu cứu cận lâm sàng và lâm sàng của các chất sau này.
Bảng 3.12: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 3a-dtheo qui tắc Lipinski
N N O O NHOH OH R Chất R LogP KLPT Số NH, OH Số N, O 3a H 2,77 337 3 7 3b 5-F 2,97 355 3 7 3c 5-Cl 3,41 371 3 7 3d 7-Cl 3,41 371 3 7
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày có thể rút ra một số kết luận sau:
1.1. Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc
* Đã tổng đƣợc 4 chất nhƣ dự kiến, trong đó 4 chất 3a-d chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ tài liệu nào:
-N-hydroxy-3-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl) phenyl)acrylamid (3a). -3-(4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)-N- hydroxyacrylamid(3b). -3-(4-((5-chloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)-N- hydroxyacrylamid(3c). -3-(4-((7-chloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)-N- hydroxyacrylamid(3d).
* Đã khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp đƣợc nhờ phân tích các dữ liệu phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR.
1.2. Về hoạt tính sinh học
* Đã thử tác dụng ức chế HDAC2 và hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của các chất tổng hợp đƣợc, kết quả cho thấy:
- Về tác dụng ức chế HDAC2: cả4 chất đều có tác dụng ức chế HDAC với nồng độ dƣới 1µM..
- Về tác dụng kháng tế bào ung thƣ: cả4 chất đều có hoạt tính ức chế vớ 3
dòng tế bào ung thƣ đạ -
AsPC1. Trong đó chất 3c có tác dụng mạnh nhấ , mạnh gấp 3- 4 lần so với SAHA; chất 3d có hoạt tính kháng ung thƣ gần nhƣ thấp nhất trong 4 chất.
II. KIẾN NGHỊ
- Tiến hành thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣin vitro của các chất tổng hợp