2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất dung môi dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng trong tổng hợp đƣợc nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Các hóa chất này đƣợc sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm. Bao gồm:
Các isatin - isatin - 5-Fluoroisatin - 5-Cloroisatin - 7-Cloroisatin methyl 3-[4-(bromomethyl)phenyl]prop-2-enoat hydroxylamin hydroclorid
Các hóa chất và dung môi khác: N,N-Dimethylformamid (DMF), aceton, dicloromethan, acid acetic, ethanol, methanol, NaOH, HCl, nƣớc cất, FeCl3.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 Ml có nút mài, bình nón, pipet, phễu thủy tinh, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC).
- Máy khuấy từ gia nhiệt.
- Máy cất quay chân không Buchi R-200. - Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu. - Tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm, bể điều nhiệt.
- Bản mỏng silicagel Merck 70 – 230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng.
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital) để xác định nhiệt độ nóng chảy.
- Máy Perkin Elmer để xác định phổ IR.
- Máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap để ghi phổ MS.
- Máy cộng hƣởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ 1H-NMR và 13C-NMR.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1. Tổng hợp hóa học 2.2.1. Tổng hợp hóa học
* Tổng hợp 4 chất: - N-hydroxy-3-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)acrylamid (3a). -3-(4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)-N- hydroxyacrylamid(3b). -3-(4-((5-chloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)-N- hydroxyacrylamid(3c). -3-(4-((7-chloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)-N- hydroxyacrylamid(3d). 2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp đƣợc - Thử tác dụng ức chế HDAC.
- Thử độc tính trên một số tế bào ung thƣ: ung thƣ đại tràng (SW 620), ung thƣ tuyền tiền liệt (PC-3), ung thƣ tuyến tụy (AsPc-1).
- Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các chất tổng hợp đƣợc.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.3.1. Tổng hợp hóa học 2.3.1. Tổng hợp hóa học
2.3.1.1. Tổng hợp
- Dựa trên những nguyên tắc và phƣơng pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất theo thiết kế.
- Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
2.3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết
- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và đo nhiệt độ nóng chảy.
2.3.1.3. Xác định cấu trúc các chất tổng hợp đƣợc
Các chất tổng hợp đƣợc đƣợc xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR.
- Phổ hồng ngoại (IR): đƣợc ghi tại Khoa Hóa, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000- 600 cm-1. Các mẫu rắn đƣợc phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200
rồi ép dƣới dạng film mỏng dƣới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm. - Phổ khối lƣợng (MS): đƣợc đo bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap của Viện Hóa học Việt Nam, chế độ đo LC-MS, dung môi methanol.
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 1H-NMR và carbon 13C-NMR đƣợc ghi trên máy Bruker AV-500 tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dung môi DMSO-d6. Độ chuyển dịch hóa học (δ) đƣợc biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million - ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).
2.3.2. Thử tác dụng sinh học
2.3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC
a. Đánh giá theo phương pháp Western blot (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thƣ đại tràng (SW620). Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định đƣợc tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng.chi tiết cách tiến hành dựa trên phƣơng pháp đã đƣợc công bố trƣớc đây [36].
b. Định lượng nồng độ enzym HDAC2 bị ức chế
Tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất tổng hợp đƣợc thử tại Khoa Dƣợc Trƣờng Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc.Phân tích dựa vào phƣơng pháp huỳnh quang trên đĩa 96 lỗ, sử dụng bộ kit định lƣợng enzym HDAC2 (Flour de Lys® - LIFE SCIENCES).Các bƣớc tiến hành đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ Kit thử nghiệm.
Tóm tắt các bƣớc nhƣ sau: enzym HDAC2 đƣợc ủ với cơ chất tripeptid có gắn flourescenc ở nồng độ 30 ng / µL và hòa tan trong 50 mM tris(hydroxymethyl)aminoethan (TRIS), 138 mM NaCl, 10% glycerol, PH 8.0. Phản ứng deacetyl hóa đƣợc tiến hành trong dung dịch đệm chứa 50 mM TRIS / Cl, PH 8.0, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2. Enzym HDAC2 và cơ chất hòa tan trong DMSO đƣợc trộn lẫn trong giếng và ủ ấm. Phần huỳnh quang sẽ đƣợc tách ra sau deacetyl hóa.Cƣờng độ huỳnh quang đƣợc đo bằng thiết bị lọc đĩa huỳnh quang. Dữ liệu đƣợc phân tích và tính toán để xác định nồng độ mẫu thử tối thiểu có thể ức
chế đƣợc 50% hoạt động của enzym HDAC2, từ đó tính đƣợc giá trị IC50. Dữ liệu đƣơc phân tích và tính toán bằng phần mềm GraphPad Prism.Trong phép thử này sự sai lệch mật độ huỳnh quang giữa các lần đo không quá 10%.
2.3.2.2. Thử độc tính tế bào
Thử hoạ ế bào ung thƣ (thử độ ế bào) in vitro đƣợc thực hiện tại Khoa Dƣợc, trƣờng Đại họ , Cheongju, Hàn Quố
Sulforhodamin B ị IC50 đƣợ GraphPad Prism [15Error! Reference source not found.,41].
ế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thƣ đại tràng), PC-3 (tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến) và AsPC-1 (tế bào ung thƣ tuyến tuỵ).
ế bào ung thƣ đƣợc lấy từ Ngân hàng tế bào ung thƣ của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB).
* Nguyên tắc thử
Dựa trên khả năng gắn của thuốc nhuộm với các acid amin cơ bản của protein trong tế bào, sử dụng phƣơng pháp đo màu để tính tổng lƣợng protein, từ đó suy ra số lƣợng tế bào. Ƣu điểm của phƣơng pháp này so với các phƣơng pháp khác bao gồm: độ nhạy tốt, độ tuyến tính cao, điểm kết thúc ổn định và không yêu cầu độ chính xác về thời gian, giá thành thấp. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này nằm ở bƣớc thêm acid tricloroacetic (TCA) để cố định tế bào.Nếu TCA không đƣợc thêm vào từ từ, nhẹ nhàng, TCA có thể làm vỡ tế bào trƣớc khi tế bào đƣợc cố định, làm giải phóng các thành phần có thể làm ảnh hƣởng đến kết quả định lƣợng [15].
* Các bước tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị tế bào (đĩa A)
- Sử dụng các tế bào đang ở pha logarit (300-500.103 tế bào/ml) hoặc đƣợc trypsin hoá (với các dòng tế bào bám dính).
- Nuôi cấy dòng tế bào trong môi trƣờng RPMI 1640 với 10% FBS (huyế ), 1% glutamin, 1% pen/strep (100 U/mL penicillin và 100 μg/mL streptomycin) hoặc các môi trƣờng phù hợp khác.
và 1% pen/strep.
- Từ 100 000 tế bào trong 10 ml môi trƣờng, dùng pipet hút 100 μg hỗn dịch tế bào và môi trƣờng vào mỗi giếng để có 1000 tế bào ở mỗi giếng.
- Hàng đầu tiên đƣợc sử dụng làm mẫu trắng, hàng tiếp theo là các mẫu đối chứng (không có mẫu thử).
Bước 2: Chuẩn bị mẫu (đĩa B)
- Dùng pipet thêm 125 μl môi trƣờng RPMI 1640 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng.
- Thêm 125 μl mẫu thử vào mỗi giếng ở hàng đầu tiên, trộn đều, sau đó lấy 125 μl hỗn hợp ở hàng đầu tiên thêm vào các giếng ở hàng thứ hai, lặp lại quá trình này cho đến hàng cuối cùng để có đƣợc các nồng độ pha loãng.
- Hút 100 μl ở hàng cuối cùng đĩa B thêm vào hàng cuối cùng của đĩa A (để dung dịch nồng độ nhỏ hơn ít ảnh hƣởng đến nồng độ dung dịch đƣợc hút ở các lần tiếp theo), lần lƣợt nhƣ vậy.
- Thêm 100 μl môi trƣờng RPMI 1640 (không chứa mẫu thử) vào hàng mẫu đối chứng để đƣợc 200 μl hỗn dịch với 10% FBS trong mỗi giếng.
- Thêm 200 μl môi trƣờng vào hàng mẫu trắng.
Bước 3: Tiến hành thử:
- Chuẩn bị dung dịch gốc 50% TCA, làm lạnh ở 4oC rồi thêm 50 μl dung dịch đã làm lạnh vào mỗi giếng chứa 200 μl hỗn dịch tế bào và môi trƣờng để tạo nồng độ 10% TCA ở mỗi giếng.
- Đặt đĩa 96 giếng ở 4oC trong 1 h để cố định tế bào.
- Chuẩn bị dung dịch 0,4% SRB (kl/tt) trong 1% acid acetic và thêm 70 μl dung dịch này vào mỗi giếng, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Rửa đĩa với 1% acid acetic 5 lần để rửa trôi lƣợng SRB chƣa gắn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-Chuẩn bị dung dịch gốc 10 mM base Trizma
(tris(hydroxymethyl)aminomethan) và thêm 200 μl dung dịch này vào mỗi giếng để hoà tan các SRB đã gắn. Đặt đĩa 96 giếng vào máy lắc trong ít nhất 10 phút.
của nền (đĩa microplate) ở bƣớc sóng 620 nm.
* Tính kết quả
ị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở ộ hấp thụ giảm đi 50% so với mẫu đối chứ ị IC50 đƣợ ựa trên phần mềm GraphPad Prism.
2.3.3. Đánh giá mức độ giống thuốc của chất tổng hợp đƣợc
Tính giá trị logP của các chất tổng hợp đƣợc bằng phần mềm EPIsuite cung cấp bởi US Environment Protection Agency’s Office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC). Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 4.0 của ACD labs sau đó đƣa Smile notation vào phần mềm EPIsuite để tính các giá trị logP.
Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinski [37]: - Khối lƣợng phân tử của chất không lớn hơn 500g/mol.
- Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) không lớn hơn 10. - Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) không lớn hơn 5. -Giá trị của logP của chất không lớn hơn 5.
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KÊT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. HÓA HỌC
3.1.1. Tổng hợp hóa học
Quá trình tổng hợp 4 chất trong khóa luận đƣợc thực hiện theo sơ đồ chung nhƣ sau (sơ đồ 3.1): N H O O N O O O OCH3 N N O O NHOH OH R R R i ii 1a-d 2a-d 3a-d
Sơ đồ 3.1.Quy trình tổng hợp chung
Tác nhân và điều kiện: i) methyl 3-(4-(bromomethyl)phenyl)prop-2-enoat, K2CO3, DMF, 24 h;ii) Hydroxamin hydroclorid, NaOH, MeOH, THF, H2O, -5oC, 1,5 - 2 h.
3.1.1.1. Tổng hợp N-hydroxy-3-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)methyl)phenyl)acrylamid(3a)
a. Tổng hợp chất 2a
Chất methyl 3-(4-((2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)acrylat (2a) đƣợc tổng hợp từ isatin (1a) qua phản ứng thế ái nhân với methyl 3-(4- bromomethyl)phenyl)prop-2-enoat với xúc tác là base K2CO3 theo sơ đồ 3.2:
O OCH3 Br + K2CO3 24 h N H O O N O O O OCH3 2a 1a Sơ đồ 3.2:Sơ đồ tổng hợp chất 2a * Tiến hành phản ứng:
- Hòa tan 0,1470 g (1 mmol) isatin và 0,2460 g (2 mmol) K2CO3 với 2 ml DMF trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml, sau đó hoạt hóa ở nhiệt độ phòng trong vòng 45 phút đến 1 h.
- Tiếp tục cho 0,2540 g (1 mmol) methyl 3-[4-(bromomethyl)phenyl]prop-2- enoat hòa tan trong 1 ml DMF vào bình phản ứng.
- Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 h.
- Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với pha động là DCM/MeOH = 9/1. Kết thúc phản ứng khi kết quả cho thấy phản ứng đã hết isatin ban đầu.
* Xử lý phản ứng:
- Trung tính hóa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl 5% để tạo tủa. - Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nƣớc cất cho đến khi dịch lọc trung tính. - Sấy khô tủa ở 60oC.
* Kết quả: - Cảm quan: bột màu vàng. - Hiệu suất: 96%. - Tonc = 207-209oC. - Rf = 0,72 (DCM/MeOH = 9/1). b. Tổng hợp chất 3a Chất N-hydroxy-3-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)
phenyl)acrylamid(3a) đƣợc tổng hợp bằng phản ứng tạo acid hydroxamic giữa chất 2a với hydroxylamin hydroclorid theo sơ đồ 3.3 nhƣ sau:
N O O O OCH3 N N O O NHOH OH NH2OH.HCl , NaOH MeOH, THF, H2O -5oC, 1.5 - 2 h 2a 3a Sơ đồ 3.3:Sơ đồ tổng hợp chất 3a * Tiến hành phản ứng
ml và hòa tan với hỗn hợp dung môi gồm 4 ml THF và 4 ml MeOH. Sau đó thêm 0,6950 g (10 mmol) NH2OH.HCl vào bình cầu chứa hỗn hợp phản ứng. Bình phản ứng đƣợc làm lạnh đến -5o
C bằng hỗn hợp nƣớc đá - muối. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Hòa tan 0,8010 g (20 mmol) NaOH trong 4 ml nƣớc cất trong ống nghiệm và làm lạnh đến -5oC bằng hỗn hợp nƣớc đá muối. Thêm từ từ dung dịch NaOH vào bình phản ứng.
- Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ -5oC.
- Theo dõi tiến trình phản ứng và xác định thời điểm kết thúc bằng cách dùng FeCl3 và sắc ký lớp mỏng (TLC), cụ thể làm nhƣ sau:
+ Lấy 0,1 mL hỗn hợp phản ứng cho vào khay sứ, sau đó acid hóa bằng HCl 5%. Nhỏ 1 giọt FeCl3 5%, nếu xuất hiện màu đỏ vang chứng tỏ phản ứng tạo acid hydroxamic đã xảy ra.
+ Acid hóa 0,1 mL hỗn hợp phản ứng trong ống nghiệm bằng HCl 5%, thêm methanol để hòa tan tủa, kiểm tra bằng TLC với pha động là hỗn hợp dung môi DCM / MeOH / CH3COOH = 90 / 10 / 1. Kết thúc phản ứng khi kết quả cho thấy phản ứng đã hết ester ban đầu.
* Xử lý phản ứng
- Acid hóa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl 5% lạnh đến Ph = 3-4, để lạnh 15 phút để tủa sản phẩm.
- Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nƣớc cất lạnh. - Sấy khô tủa ở 60oC.
-Kết tinh lại bằng hỗn hợp MeOH - H2O thu đƣợc 0,1095 g sản phẩm.
* Kết quả
- Cảm quan: bột kết tinh màu đỏ cam. - Hiệu suất: 65%(0,1095 g).
- Nhiệt độ nóng chảy và Rfcụ thể đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
- Chất 3a tổng hợp đƣợc đƣợc xác định cấu trúc bằng các phổ IR, MS, 1H- NMR, 13C-NMR. Kết quả cụ thể đƣợc trình bày trong phần 3.1.3.
yl)methyl)phenyl)-N-hydroxyacrylamid (3b) a. Tổng hợp chất 2b Để tổng hợp chất 3b cần tổng hợp chất methyl 3-(4-((5-fluoro-2,3- dioxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)acrylat (2b). O OCH3 Br + K2CO3 24 h N H O O F N O O O OCH3 F 2b 1b Sơ đồ 3.4:Sơ đồ tổng hợp chất 2b
Qui trình tổng hợp chất 2b từ 0,1637 g (1 mmol) chất 5-fluoroisatin (1b) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất 2a.
* Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: - Cảm quan: bột màu vàng. - Hiệu suất: 77,13% (0,2615 g). - Rf = 0,57 (hexan/aceton = 6/4). b. Tổng hợp chất 3b N O O O OCH3 F N N O O NHOH F OH NH2OH.HCl , NaOH MeOH, THF, H2O -5oC, 1.5 - 2 h 2b 3b Sơ đồ 3.5: Sơ đồ tổng hợp chất 3b Tổng hợp chất 3-(4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)
methyl)phenyl)-N-hydroxyacrylamid(3b) từ 0,1670 g (0,5 mmol) chất 2b đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất 3a.
* Kết quả nhƣ sau:
- Cảm quan: bột kết tinh màu đỏ cam. - Hiệu suất: 62,0% (0,1101 g).
- Nhiệt độ nóng chảy và Rfcụ thể đƣợc trình bày trong bảng 3.1.
trình bày trong phần 3.1.3. 3.1.1.3: Tổng hợp 3-(4-((5-chloro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1- yl)methyl)phenyl)-N-hydroxyacrylamid (3c) a. Tổng hợp chất 2c Để tổng hợp chất 3c cần tổng hợp chất methyl 3-(4-((5-chloro-2,3- dioxoindolin-1-yl)methyl)phenyl)acrylat (2c). O OCH3 Br + K2CO3 24 h N H O O Cl N O O O OCH3 Cl 2c 1c Sơ đồ 3.6: Sơ đồ tổng hợp chất 2c
Qui trình tổng hợp chất 2c từ 0,1820 g (1 mmol) chất 5-chloroisatin (1c) đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ tổng hợp chất 2a. * Kết quả nhƣ sau: - Cảm quan: bột màu vàng. - Hiệu suất: 84,8% (0,3012 g). - Rf = 0,72 (DCM). b. Tổng hợp chất 3c N O O O OCH3 Cl N N O O NHOH Cl OH NH2OH.HCl , NaOH MeOH, THF, H2O -5oC, 1.5 - 2 h 2c 3c Sơ đồ 3.7:Sơ đồ tổng hợp chất 3c