a. Đánh giá theo phương pháp Western blot
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thƣ đại tràng (SW620). Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định đƣợc tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng.chi tiết cách tiến hành dựa trên phƣơng pháp đã đƣợc công bố trƣớc đây [36].
b. Định lượng nồng độ enzym HDAC2 bị ức chế
Tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất tổng hợp đƣợc thử tại Khoa Dƣợc Trƣờng Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc.Phân tích dựa vào phƣơng pháp huỳnh quang trên đĩa 96 lỗ, sử dụng bộ kit định lƣợng enzym HDAC2 (Flour de Lys® - LIFE SCIENCES).Các bƣớc tiến hành đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ Kit thử nghiệm.
Tóm tắt các bƣớc nhƣ sau: enzym HDAC2 đƣợc ủ với cơ chất tripeptid có gắn flourescenc ở nồng độ 30 ng / µL và hòa tan trong 50 mM tris(hydroxymethyl)aminoethan (TRIS), 138 mM NaCl, 10% glycerol, PH 8.0. Phản ứng deacetyl hóa đƣợc tiến hành trong dung dịch đệm chứa 50 mM TRIS / Cl, PH 8.0, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2. Enzym HDAC2 và cơ chất hòa tan trong DMSO đƣợc trộn lẫn trong giếng và ủ ấm. Phần huỳnh quang sẽ đƣợc tách ra sau deacetyl hóa.Cƣờng độ huỳnh quang đƣợc đo bằng thiết bị lọc đĩa huỳnh quang. Dữ liệu đƣợc phân tích và tính toán để xác định nồng độ mẫu thử tối thiểu có thể ức
chế đƣợc 50% hoạt động của enzym HDAC2, từ đó tính đƣợc giá trị IC50. Dữ liệu đƣơc phân tích và tính toán bằng phần mềm GraphPad Prism.Trong phép thử này sự sai lệch mật độ huỳnh quang giữa các lần đo không quá 10%.