Xác định cấu trúc sản phẩm

Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phổ: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng phân tử (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1

H-NMR).

- Phổ hồng ngoại (IR)

Đƣợc ghi tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1. Mẫu rắn đƣợc phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dƣới dạng viên nén dƣới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.

- Phổ khối lượng phân tử (MS):

Đƣợc ghi theo phƣơng pháp ESI tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy LC/MSD Trap - SL và máy LC/MS/MS-Xevo TQ.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1

H - NMR):

Đƣợc ghi tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Brucker AV-500MHz, sử dụng dung môi là DMSO và MEOD với chất chuẩn nội là tetramethylsilan.

2.4.3 Thử tác dụng sinh học

Thử tác dụng chống oxy hóa: Phƣơng pháp đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ) và SOD (superoxide).

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Chiết, phân lập và tinh chế nuciferin từ lá sen

3.1.1 Quy trình chiết nuciferin

- Nguyên liệu: 4 kg lá sen đƣợc xay nhỏ thành bột.

- Quy trình: Bột lá sen đƣợc làm ẩm bằng nƣớc vôi trong (ủ trong 24 giờ để thấm đều dƣợc liệu), sau đó chiết nóng bằng dầu hỏa: mỗi mẻ 1kg bột lá sen với 6 lít dầu hỏa ở nhiệt độ khoảng 130o

C trong 2,5 giờ. Dịch chiết dầu hỏa đƣợc lắc với 0,5 lít acid H2SO4 0,5%. Sau đó gạn lấy lớp dầu đổ lại vào chiết tiếp bã lá sen vừa rồi. sau đó lại gạn lấy lớp dầu và chiết bằng 0,5 lít acid H2SO4 0,5%. Nhƣ vậy cứ mỗi kg lá sen sẽ sử dụng 6 lít dầu hỏa và 1 lít H2SO4 0,5% (chiết 2 lần). Gộp dịch acid thu đƣợc, kiềm hóa dịch acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa cho đến pH 8, lọc thu đƣợc tủa alkaloid toàn phần, sấy khô ở 70oC.

- Kết quả: Khối lƣợng alkaloid toàn phần thu đƣợc từ 4 kg lá sen là 25 g (0,625%).

3.1.2 Tinh chế Nuciferin.

- Sử dụng phƣơng pháp kết tinh lại trong cồn.

- Cứ 5g alkaloid toàn phần hòa tan nóng hoàn toàn vào 250 ml cồn 96o để lạnh cho kết tinh sau 24 giờ lọc thu đƣợc 3,45g nuciferin.

- Kiểm tra độ tinh khiết của nuciferin thu đƣợc.

 Đo to

nc: 166-167oC.

 Độ tinh khiết kiểm tra sơ bộ bằng SKLM (triển khai bản mỏng bằng Hệ dung môi 1): Quan sát bản mỏng dƣởi đèn tử ngoại thấy trên bản mỏng có một vết duy nhất là nuciferin.

3.2 Bán tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-hydroxy-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin (N-methyl-asimilobin, II) methyldiabenzoquinolin (N-methyl-asimilobin, II)

- Phương trình phản ứng:

Hình 19. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng HBr 48%

Chuẩn bị phản ứng: Cho nuciferin (0,48g, 0,0015 mol), HBr 48% (25 ml) vào bình cầu 2 cổ 100 ml, khuấy từ, có thiết bị sục khí N2 và sinh hàn hồi lƣu.

Tiến hành phản ứng: đƣa phản ứng lên nhiệt độ 120 – 125 oC trong 4 giờ.

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Hỗn hợp đƣợc cất dƣới áp suất giảm đến kiệt dung môi. Chất rắn thu đƣợc hòa tan trong cồn 96o (khoảng 250ml) nóng và đƣợc xử lý bằng than hoạt tính. Sau đó cất thu hồi bớt dung môi còn 50 ml dịch thì để lạnh kết tinh. Sau khoảng 24 giờ lọc lấy tinh thể, sấy ở 70o

Kết quả:

 mII = 0,37g (hiệu suất 62,9%).

 tonc = 214-217oC.

 SKLM (triển khai với hệ dung môi 1) chấm 2 vết: vết dung dịch mẫu là chất (I), vết dung dịch thử là chất (II). Kết quả cho thấy sản phẩm tinh khiết với Rf (I)= 0,67 và Rf (II)= 0,60.

Kết luận: Sau khi phân tích cấu trúc sản phẩm bằng phổ IR, MS, 1H- NMR (mục 3.4) chúng tôi chứng minh đƣợc sản phẩm là 5,5a,7,8-tetrahydro- 2-hydroxy-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin.

Nhận xét: Thời gian phản ứng cũng là một yếu tố quan trọng trong việc tạo thành sản phẩm (II) thể hiện ở chỗ:

 Một mặt: Nếu thời gian ngắn có thể phản ứng không xảy ra hoàn toàn.

 Mặt khác: Thời gian kéo dài có thể xảy ra sự O1-demethyl hóa của (II) để tạo thành sản phẩm O1,O2-didemethyl hóa (III) hoặc xảy ra sự N-demethyl hóa của (II) để tạo thành sản phẩm O2, N-didemethyl hóa (IV).

Chính vì thế chúng tôi quyết định khảo sát lƣợng HBr 48% (ml) ảnh hƣởng đến thời gian phản ứng. Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Khảo sát lƣợng HBr 48% (ml) ảnh hƣởng đến thời gian phản ứng bán tổng hợp (II) stt Nguyên liệu (g) VHBr 48% (ml) Thời gian phản ứng (giờ) Hiệu suất (%) tonc (oC) 1 0,2 5,2 5,5 59,0 215-219 2 0,2 10,4 4,0 58,3 214-218 3 0,2 15,6 3,5 60,0 214-217 4 0,2 20,8 3,5 57,2 214-217 5 0,2 26,0 3,25 58,0 214-218

Nhận xét: Lƣợng HBr 48% cho vào phản ứng tỉ lệ nghịch với thời gian phản ứng. Tuy nhiên, một mặt lƣợng HBr không ảnh hƣởng nhiều tới hiệu suất của phản ứng. Mặt khác HBr 48% có nhiệt độ sôi ở 122o

C, khó để cất đi trong

Hình 20. Cấu trúc sản phẩm phụ (III) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin

Hình 21. Cấu trúc sản phẩm phụ (IV) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin

quá trình tinh chế sản phẩm. Chính vì vậy chúng tôi quyết định chọn điều kiện phản ứng theo tỉ lệ 0,48 g nuciferin : 25ml HBr 48%.

3.2.2 Tiến hành demethyl hóa nuciferin sử dụng tác nhân HBr xúc tác KI

- KI có tác dụng tạo ion I-

là tác nhân ái nhân có vai trò xúc tác làm tăng tốc độ phản ứng. Chính vì thế chúng tôi quyết định khảo sát lƣợng KI (mmol) ảnh hƣởng đến thời gian phản ứng monodemethyl hóa nuciferin.

- Thiết kế thí nghiệm: Tƣơng tự nhƣ phần 3.2.1, kết quả khảo sát đƣợc trình bày ở bảng 3.2.

Nhận xét: Có mặt ion I- làm tốc độ phản ứng tăng lên và làm giảm thời gian phản ứng, KI không ảnh hƣởng đến hiệu suất của phản ứng.

3.2.3 Đề xuất quy trình bán tổng hợp sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid hydrobromid

Bảng 3.2.Khảo sát lượng KI ảnh hưởng đến thời gian phản ứng monodemethyl hóa nuciferin stt Nuciferin (g) HBr 48% (ml) KI (mmol) Thời gian phản ứng (giờ) Hiệu suất (%) tonc (oC) 1 0,2 10,4 0,00 4,00 59,6 214-218 2 0,2 10,4 0,34 3,25 61,0 214-220 3 0,2 10,4 0.68 3,00 62,5 214-217 4 0,2 10,4 1,01 2,75 58,0 215-218 5 0,2 10,4 1,36 2,75 60,0 214-217

Chuẩn bị phản ứng: Cho nuciferin (0,48g, 0,0015 mol), KI (0,28g, 0,0017 mol), HBr 48% (25 ml) vào bình cầu 2 cổ 100 ml, khuấy từ, có thiết bị sục khí N2 và sinh hàn hồi lƣu.

Tiến hành phản ứng: đƣa phản ứng lên nhiệt độ 120 – 125 oC trong 3 giờ.

Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Cất sạch dịch trong phản ứng thu đƣợc cặn chất rắn màu vàng. Hòa tan tủa vào 250 ml cồn 96o

nóng, xử lý màu bằng than hoạt tính. Bay hơi bớt dịch còn khoảng 50ml, để lạnh kết tinh thành tinh thể hình kim, mịn. Sau 24h lọc lấy tinh thể, sấy khô ở 70o

C. Hiệu suất 60-62%.

3.3 Tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-(2-hydroxyethyl)-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin (2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin, V) methyldiabenzoquinolin (2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin, V)

Hình 22. Sơ đồ dụng cụ đề xuất cho phản ứng demethyl hóa nuciferin

5,5a,7,8-tetrahydro-2-(2-hydroxyethyl)-1-methoxy-6-

methyldiabenzoquinolin (V) là sản phẩm O-alkyl hóa chất (II) bằng tác nhân 2-cloroethanol (EC).

Phương trình phản ứng:

Hình 23. Sơ đồ phản ứng tạo sản phẩm O-alkyl hóa nuciferin

3.3.1 Sử dụng môi trường NaOH loãng

Chuẩn bị phản ứng: Cho vào bình cầu 0,1 g chất (II) (0,28 mmol), thêm 11,6 ml NaOH 0,05M.

Tiến hành phản ứng: Khuấy hỗn hợp trong 20 phút (sục N2 ). Thêm 0,16 ml EC (1,65 mmol). Theo dõi qua trình phản ứng bằng SKLM. Kết thúc phản ứng sau 24 giờ.

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sử dụng dicloromethan chiết hỗn hợp phản ứng. Lấy pha dicloromethan bốc hơi dung môi đến kiệt. Hòa tan hỗn hợp thu đƣợc trong methanol, xử lý tạp màu bằng than hoạt tính. Bay hơi hết dung môi, thêm 3ml dicloromethan để hòa tan. Sử dụng sắc ký điều chế tách sản phẩm từ dịch dicloromethan.

Kết quả:

 Dịch trƣớc sắc ký điều chế: thử độ tinh khiết bằng SKLM (triển khai hệ dung môi 2, dịch mẫu là chất (II), dịch thử là dịch xử lý của phản ứng trƣớc sắc ký điều chế), soi dƣới đèn tử ngoại thu đƣợc 2 vết.

- Vết 2 là (V), Rf= 0,46.

 Sau sắc ký điều chế:

- Thu đƣợc 0,01g chất (V), hiệu suất 10%.

- Kiểm nghiệm bằng SKLM cho thấy vết tách đƣợc là chất (V), chất tinh khiết.

*Sắc ký điều chế tách sản phẩm được tiến hành như sau: Chấm dung dịch sau xử lý phản ứng chứa 2 hoặc 3 vết lên những bản mỏng có kích thước 20 x 20 cm được tráng chất hấp phụ là silica gel G (Merck), đã hoạt hóa ở 110o

C trong 1 giờ ( một bản mỏng cho một phản ứng với 0,1g nguyên liệu). Hệ dung môi khai triển là CHCl3 : MeOH (60 : 1). Bản mỏng để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó soi dưới “đèn soi UV sắc kí CN6” đánh dấu vùng chứa sản phẩm. Cạo lấy silica gel chứa chất cần tách, phản hấp phụ bằng CHCl3 : MeOH (60 : 1) và lọc lấy dịch. Bay hơi hết dung môi thu được sản phẩm cần tổng hợp.

Nhận xét:

a. Về sắc ký theo dõi phản ứng trong quá trình phản ứng (triển khai hệ dung môi 2): - Trên bản mỏng sắc ký thu đƣợc 4 vết sản phẩm ký hiệu là V1 - V2 - V3 - V4 với giá trị Rf lần lƣợt là: 0,53 – 0,46 – 0,40 – 0,32 , trong đó V1 là nguyên liệu (II) chƣa phản ứng. - Sau khi chiết hỗn hợp phản ứng bằng dicloromethan thì V1 và V2 chuyển sang pha hữu cơ, dự đoán V2 là vết của sản phẩm (V)

cần tổng hợp. Bởi trong môi trƣờng base thì alkaloid tồn tại ở dạng base, có thể chiết dễ dàng sang pha hữu cơ, còn V3, V4 dự đoán là sản phẩm phụ, dự đoán là chất (VI) và chất (VII) (muối amin bậc 4 của alkaloid, tan trong pha nƣớc).

Hình 24. Cấu trúc sản phẩm phụ (VI) của phản ứng O-alkyl hóa

b. Về phƣơng pháp sử dụng dung dịch NaOH loãng làm môi trƣờng phản ứng: Dung dịch NaOH có thẻ là tác nhân kiềm mạnh nên dễ tạo sản phẩm phụ muối amin bậc 4 làm giảm hiệu suất phản ứng.

3.3.2 Sử dụng dung môi DMF, xúc tác K2CO3

Chuẩn bị phản ứng: Cho vào bình cầu 0,1 g chất (II) (0,28 mmol), 0,8 g K2CO3 (khan) thêm 15 ml DMF (sục N2).

Tiến hành phản ứng: Khuấy hỗn hợp trong 30 phút (sục N2 ) ở nhiệt độ 100oC. Thêm 0,8 ml EC. Theo dõi qua trình phản ứng bằng SKLM. Kết thúc phản ứng sau 45 giờ.

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Lọc hỗn hợp phản ứng loại muối vô cơ, dịch thu đƣợc đem cô dƣới áp suất giảm, thêm nhiều lần cồn 96o

để cất cùng làm quá trình bay hơi hết dịch tốn ít thời gian hơn. Thêm nƣớc và dicloromethan vào hỗn hợp thu đƣợc lắc và chiết lấy pha hữu cơ dicloromethan. Sau đó xử lý pha dicloromethan nhƣ phần 3.3.1 và tách lấy sản phẩm bằng sắc ký điều chế.

Kết quả: Thu đƣợc 0,03g chất V, hiệu suất 30%. Thử tinh khiết bằng SKLM cho thấy sản phẩm thu đƣợc tinh khiết.

Nhận xét:

- Sử dụng SKLM theo dõi quá trình phản ứng cho thấy lƣợng sản phẩm phụ tạo ra rất ít V3 và không tạo ra V4.

- Dung môi DMF nhiệt độ sôi khá cao (152-154o

C) nên gây khó khăn trong quá trình xử lý hỗn hợp sản phẩm giai đoạn ngay sau phản ứng cần bay hơi hết dung môi.

3.3.3 Sử dụng dung môi acetonitril, xúc tác K2CO3

Hình 25. Cấu trúc sản phẩm phụ (VII) của phản ứng O-alkyl hóa

Chuẩn bị phản ứng: Cho vào bình cầu 0,1 g chất (II) (0,28 mmol), 0,8 g K2CO3 (khan) thêm 20 ml acetonitril (sục N2).

Tiến hành phản ứng: Khuấy hỗn hợp trong 30 phút (sục N2 ) ở nhiệt độ 80-85oC. Thêm 0,8 ml EC. Theo dõi qua trình phản ứng bằng SKLM. Kết thúc phản ứng sau 24 giờ.

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Lọc hỗn hợp phản ứng loại muối vô cơ, dịch thu đƣợc đem cô dƣới áp suất giảm. Thêm nƣớc và dicloromethan vào hỗn hợp thu đƣợc lắc và chiết lấy pha hữu cơ dicloromethan. Sau đó xử lý pha dicloromethan nhƣ phần 3.3.1 và tách lấy sản phẩm bằng sắc ký điều chế.

Kết quả: Thu đƣợc 0,04 g chất (V), hiệu suất 40%. Thử tinh khiết bằng phƣơng pháp SKLM cho thấy sản phẩm thu đƣợc tinh khiết.

Nhận xét:

- Sử dụng dung môi acetonitril cho hiệu suất cao nhất trong số các dung môi thử.

- SKLM theo dõi quá trình phản ứng cho thấy không tạo ra sản phẩm phụ V3 và V4 trong quá trình phản ứng.

3.3.4 Đề xuất quy trình

Hình 26. Quy trình đề xuất cho phản ứng O-alkyl hóa chất (II) để tổng hợp sản phẩm thế của nuciferin: 2-Hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (V)

Chuẩn bị phản ứng: Cho vào bình cầu 0,1 g chất II (0,28 mmol), 0,8 g K2CO3 (khan) thêm 20 ml acetonitril (sục N2).

3.4 Kết quả phân tích cấu trúc của nuciferin và các sản phẩm bán tổng hợp hợp

Cấu trúc của sản phẩm chiết xuất và các sản phẩm bán tổng hợp đƣợc khẳng định bởi các phƣơng pháp phổ: IR, NMR và MS. Sau đây là các bảng phân tích các phổ của nuciferin (I), N-methyl-asimilobin hydrobromid (II) và 2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (V). (Bảng 3.3, 3,4, 3.5, 3.6, 3.7).

Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin (IR, KBr) – Phụ lục 11 nuciferin Nhóm chức Đỉnh hấp thụ đặc trƣng (ῡ, cm-1) =C-H (thơm) 3010 -C-H (no) 2958, 2838 C=C (thơm) 1591, 1497, 1452 C-O-C 1243 C-N 1104

Bảng 3.4.Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của nuciferin (1H-NMR, DMSO) – phụ lục 13, 14, 15

Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) Dạng proton

2,34 (2H, m, H-4) Ar-CH2 2,42 (3H, s, H-3’) N-CH3 2,63 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-7α) Ar-CH2- 2,82 (1H, dd, J1 = 4,0 Hz, J2 = 14,0 Hz, H-6a) N-CH- 2,96 (2H, m, H-5) N-CH2-

3,13 (1H, dd, J1 = 3,5 Hz, J2 = 14,0 Hz, H-7β) Ar-CH2- 3,57 (3H, s, H-2’) O-CH3 3,80 (3H, s, H-1’) O-CH3 6,77 (1H, s, H-3) =CH thơm 7,22 (1H, m, H-10) =CH thơm 7,27 (2H, m, H-8, H-9) =CH thơm 8,16 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-11) =CH thơm

Ghi chú: s - singlet, d - doublet, dd - doublet của doublet, m - multiplet, Ar - nhân thơm.

Bảng 3.5.Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của N-methyl-asimilobin hydrobromid (IR, KBr) – phụ lục 1 Nhóm chức Đỉnh hấp thụ đặc trƣng (ῡ, cm-1) OH phenol (liên kết hydro) 3332, 3300 =C-H (thơm) 3010 -C-H (no) 2924, 2845 -NH+ (muối hydrobromid) 2651, 2601, 2536 C=C (thơm) 1612, 1574, 1502, 1464 C-O-C 1283, 1251, 1129, 1024

Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid (1 H-NMR, DMSO) – phụ lục 4, 5, 6 Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) Dạng proton 2,78 (2H, t, J = 14, H-4β) Ar-CH2- 2,94 (2H, m, H-4α) 3,08 (3H, s, H-3’) N+-CH3 3,16-3,22 (1H, m, H-7β) Ar-CH2- 3,42 (1H, m, H-7α) 3,45 (1H, m, H-5β) N+-CH2- 3,72 (1H, m, H-5α) 4,27 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-6a) N + -CH- 3,86 (3H, s, H-1’) O-CH3 6,85 (1H, s, H-3) =CH thơm 7,25 (1H, m, H-10) =CH thơm 7,34 (2H, m, H-8, H-9) =CH thơm 8,34 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-11) =CH thơm

9,11 (1H, s, OH) -OH phenol 9,97 (1H, s, H-6) -NH+-

Bảng 3.7.Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm 2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (1H-NMR, MeOD) – phụ lục 8, 9, 10 Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) Dạng proton 2,55 (2H, m, H-4) Ar-CH2- 2,58 (3H, s, H-4’) N-CH3 2,77 (1H, dd, J1 = 4,5 Hz, J2

Demethyl hóa Nuciferin sử dụng tác nhân HBr

Tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-(2-hydroxyethyl)-1-methoxy-6-