2-cloroethanol là một tác nhân alkyl hóa quan trọng, đặc biệt nhất là tác nhân để tạo ra nhiều thuốc chống ung thƣ nhƣ Clorambucil, Melphalan,…
Một ví dụ quan trọng khác là Troxerutin – một hoạt chất có ý nghĩa quan trọng trong điều trị suy tĩnh mạch mạn tính, là sản phẩm của quá trình O-alkyl hóa rutin bằng tác nhân 2-cloroethanol.
Dƣới đây là một số phản ứng quan trọng có cơ chế tƣơng tự với phản ứng O-alkyl hóa tạo dẫn chất của nuciferin:
1.4.1 Phương pháp sử dụng K2CO3 trong dung môi acetonitril
Cho vào bình cầu nguyên liệu, dung môi acetonitril. Thêm vào tác nhân 2-chloroethanol và xúc tác K2CO3. Đun hồi lƣu phản ứng trong 18 giờ.
Hình 15. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48%
Kết thúc phản ứng: lọc lấy dịch lọc đi bốc hơi và xử lý thu đƣợc sản phẩm với hiệu suất 99% theo lý thuyết [34].
1.4.2 Phương pháp sử dụng K2CO3 trong dung môi DMF
Nguyên liệu và 2-cloroethanol đƣợc hòa tan trong DMF (5 mL), bổ xung K2CO3, phản ứng ở 100o
C trong 50 giờ. Sau 12 giờ, thêm tác nhân 2- cloroethanol để phản ứng tiếp tục diễn ra.
Kết thúc phản ứng: Thêm nƣớc cất vào hỗn hợp phản ứng, chiết bằng CHCl3. Làm khan pha hữu cơ có chứa sản phẩm bằng Na2SO4. Bốc hơi dung môi và xử lý thu đƣợc sản phẩm với hiệu suất 99,4% [35].
1.4.3 Phương pháp sử dụng NaOH trong nước
Cho vào bình cầu nguyên liệu cùng một lƣợng nƣớc cất, khuấy tạo huyền phù
và sục khí N2 liên tục. Thêm vào NaOH và nâng nhiệt độ lên 55oC. Thêm tác
Hình 18. Phản ứng O-alkyl hóa trong môi trƣờng NaOH loãng
NaOH
+ HO-CH2-CH2 -Cl
nhân 2-cloroethanol để phản ứng diễn ra. Sau khi cho hết tác nhân alkyl hóa, duy trì ở nhiệt độ trong thời gian 2 giờ.
Kết thúc phản ứng: Xử lý hỗn hợp phản ứng thu đƣợc sản phẩm với hiệu suất khoảng 75-78% [4].
CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu
Nguyên liệu: lá Sen mua tại phố Lãn Ông, Hà Nội đã đƣợc phơi khô. Qua quá trình chiết, phân lập và tinh chế tại phòng Tổng hợp Hóa dƣợc Bộ môn Công nghiệp Dƣợc- Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội thu đƣợc nuciferin làm nguyên liệu cho các phản ứng bán tổng hợp.
Các hóa chất và dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm đã đƣợc thống kê trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm
stt Nguyên liệu Xuất xứ
1 2-Cloroethanol Merck – Đức
2 Acetonitril Merck – Đức
3 Acid acetic Trung Quốc
4 Acid sulfuric Trung Quốc
5 Bản mỏng Silica gel 60 F254 Merck – Đức
6 Dầu hỏa Việt Nam (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7 Dimethylformamid Trung Quốc
8 Ethanol 96 độ Việt Nam
9 Acid hydrobromic 48% Trung Quốc
10 Kali iodid Trung Quốc
11 Methanol Trung Quốc
12 Natri carbonat Trung Quốc
13 Natri hydroxyd Trung Quốc
14 n-Butanol Trung Quốc
học Dƣợc Hà Nội
16 Than hoạt tính Việt Nam
2.2 Thiết bị và dụng cụ
Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm đƣợc liệt kê trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm
STT Tên dụng cụ, thiết bị Xuất xứ
1 Bản mỏng silica gel GF254 Merck
2 Bình cầu 2 cổ 100mL Đức
3 Bình cầu 1 cổ 50mL, 100mL, 250mL Đức
4 Bình chiết 50mL, 100mL, 250mL Trung Quốc
5 Bình sắc ký Trung Quốc
6 Bộ lọc hút chân không Trung Quốc
7 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ nhạy 10-2 Thụy Sỹ
8 Cốc có mỏ 50mL, 100mL, 250mL Đức
9 Đèn tử ngoại Đức
10 Đĩa petri Trung Quốc
11 Đũa thủy tinh Trung Quốc
12 Giấy lọc Việt Nam
13 Mao quản (chấm sắc ký, đo nhiệt độ nóng chảy) Việt Nam
14 Máy cất quay chân không Buchi B480 Thụy Sỹ
15 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ
16 Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker AV- 500MHz (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mỹ
17 Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer Mỹ
18 Máy đo phổ khối lƣợng LC/MSD Trap - SL và LC/MS/MS - Xevo TQ
19 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Đức
20 Nhiệt kế thủy ngân Trung Quốc
21 Bếp ôm Hàn Quốc
22 Ống đong 25mL, 50mL Trung Quốc
23 Ống nghiệm Trung Quốc
24 Phễu lọc thủy tinh Trung Quốc
25 Phễu lọc tinh thể Đức
26 Pipet chia vạch 1mL, 5mL, 10mL Đức
27 Quả bóp Đức
28 Sinh hàn hồi lƣu Đức
29 Tủ lạnh Hàn Quốc
30 Tủ sấy Memmert Đức
2.3 Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Chiết nuciferin từ lá sen
- Thực hiện chiết alkaloid toàn phần trong lá sen.
- Phân lập và tinh chế alkaloid toàn phần thu đƣợc nuciferin.
- Kiểm tra độ tinh khiết của nuciferin bằng phƣơng pháp SKLM và đo to nc.
2.3.2 Thực hiện demethyl hóa nuciferin
- Thực hiện demethyl hóa nuciferin bằng HBr 48%, khảo sát lƣợng HBr 48% và xúc tác KI ảnh hƣởng đến hiệu suất và thời gian phản ứng.
- Tách, tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm demethyl hóa thu đƣợc.
- Xác định cấu trúc sản phẩm thông qua dữ liệu phân tích các phổ 1 H- NMR, phổ MS và phổ IR.
2.3.3 Thực hiện O-alkyl hóa sản phẩm O-demethylnuciferin bằng tác nhân EC EC
- Thực hiện phản ứng trong môi trƣờng NaOH loãng, dung môi DMF và dung môi acetonitril.
- Tách sản phẩm tinh khiết bằng phƣơng pháp sắc ký điều chế.
- Xác định cấu trúc sản phẩm thông qua dữ liệu phân tích các phổ 1 H- NMR, phổ MS.
2.3.4 Thử tác dụng sinh học
- Thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm demethyl hóa và sản phẩm O-alkyl hóa tại Bộ môn Dƣợc lực – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1 Bán tổng hợp dẫn chất của nuciferin
- Sử dụng phƣơng pháp chiết alkaloid bằng dung môi hữu cơ ở môi trƣờng kiềm.
- Sử dụng các phƣơng pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến: phƣơng pháp demethyl hóa, O-alkyl hóa…
- Sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với bản mỏng silica gel GF254 Merck 70-230 mesh và hệ dung môi khai triển thích hợp (Hệ dung môi 1 = dicloromethan : methanol = 9 : 1; Hệ dung môi 2 = n-butanol : acid acetic : methanol = 9 : 2 : 2,5); pha dung dịch thử và dung dịch mẫu (hòa tan chất thử, chất mẫu vào methanol nồng độ khoảng 0,25%); để khô bản mỏng ngoài không khí sau đó triển khai sắc ký đến khi dung môi đi đƣợc 10 cm; quan sát dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254 nm để theo dõi tiến triển của phản ứng và sơ bộ xác định độ tinh khiết.
- Sử dụng phƣơng pháp đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt để sơ bộ định tính và xác định độ tinh khiết.
- Sử dụng các phƣơng pháp kết tinh, sắc ký điều chế để tách và tinh chế sản phẩm.
Tổng hợp hóa học thực hiện tại Phòng Tổng hợp Hóa dƣợc, Bộ môn Công nghiệp Dƣợc, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
2.4.2 Xác định cấu trúc sản phẩm
Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phổ: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng phân tử (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1
H-NMR).
- Phổ hồng ngoại (IR)
Đƣợc ghi tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1. Mẫu rắn đƣợc phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dƣới dạng viên nén dƣới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
- Phổ khối lượng phân tử (MS):
Đƣợc ghi theo phƣơng pháp ESI tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy LC/MSD Trap - SL và máy LC/MS/MS-Xevo TQ.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1
H - NMR):
Đƣợc ghi tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Brucker AV-500MHz, sử dụng dung môi là DMSO và MEOD với chất chuẩn nội là tetramethylsilan.
2.4.3 Thử tác dụng sinh học
Thử tác dụng chống oxy hóa: Phƣơng pháp đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ) và SOD (superoxide).
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Chiết, phân lập và tinh chế nuciferin từ lá sen
3.1.1 Quy trình chiết nuciferin
- Nguyên liệu: 4 kg lá sen đƣợc xay nhỏ thành bột.
- Quy trình: Bột lá sen đƣợc làm ẩm bằng nƣớc vôi trong (ủ trong 24 giờ để thấm đều dƣợc liệu), sau đó chiết nóng bằng dầu hỏa: mỗi mẻ 1kg bột lá sen với 6 lít dầu hỏa ở nhiệt độ khoảng 130o
C trong 2,5 giờ. Dịch chiết dầu hỏa đƣợc lắc với 0,5 lít acid H2SO4 0,5%. Sau đó gạn lấy lớp dầu đổ lại vào chiết tiếp bã lá sen vừa rồi. sau đó lại gạn lấy lớp dầu và chiết bằng 0,5 lít acid H2SO4 0,5%. Nhƣ vậy cứ mỗi kg lá sen sẽ sử dụng 6 lít dầu hỏa và 1 lít H2SO4 0,5% (chiết 2 lần). Gộp dịch acid thu đƣợc, kiềm hóa dịch acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa cho đến pH 8, lọc thu đƣợc tủa alkaloid toàn phần, sấy khô ở 70oC.
- Kết quả: Khối lƣợng alkaloid toàn phần thu đƣợc từ 4 kg lá sen là 25 g (0,625%).
3.1.2 Tinh chế Nuciferin.
- Sử dụng phƣơng pháp kết tinh lại trong cồn.
- Cứ 5g alkaloid toàn phần hòa tan nóng hoàn toàn vào 250 ml cồn 96o để lạnh cho kết tinh sau 24 giờ lọc thu đƣợc 3,45g nuciferin.
- Kiểm tra độ tinh khiết của nuciferin thu đƣợc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đo to
nc: 166-167oC.
Độ tinh khiết kiểm tra sơ bộ bằng SKLM (triển khai bản mỏng bằng Hệ dung môi 1): Quan sát bản mỏng dƣởi đèn tử ngoại thấy trên bản mỏng có một vết duy nhất là nuciferin.
3.2 Bán tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-hydroxy-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin (N-methyl-asimilobin, II) methyldiabenzoquinolin (N-methyl-asimilobin, II)
- Phương trình phản ứng:
Hình 19. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng HBr 48%
Chuẩn bị phản ứng: Cho nuciferin (0,48g, 0,0015 mol), HBr 48% (25 ml) vào bình cầu 2 cổ 100 ml, khuấy từ, có thiết bị sục khí N2 và sinh hàn hồi lƣu.
Tiến hành phản ứng: đƣa phản ứng lên nhiệt độ 120 – 125 oC trong 4 giờ.
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Hỗn hợp đƣợc cất dƣới áp suất giảm đến kiệt dung môi. Chất rắn thu đƣợc hòa tan trong cồn 96o (khoảng 250ml) nóng và đƣợc xử lý bằng than hoạt tính. Sau đó cất thu hồi bớt dung môi còn 50 ml dịch thì để lạnh kết tinh. Sau khoảng 24 giờ lọc lấy tinh thể, sấy ở 70o
C.
Kết quả:
mII = 0,37g (hiệu suất 62,9%).
tonc = 214-217oC.
SKLM (triển khai với hệ dung môi 1) chấm 2 vết: vết dung dịch mẫu là chất (I), vết dung dịch thử là chất (II). Kết quả cho thấy sản phẩm tinh khiết với Rf (I)= 0,67 và Rf (II)= 0,60.
Kết luận: Sau khi phân tích cấu trúc sản phẩm bằng phổ IR, MS, 1H- NMR (mục 3.4) chúng tôi chứng minh đƣợc sản phẩm là 5,5a,7,8-tetrahydro- 2-hydroxy-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin.
Nhận xét: Thời gian phản ứng cũng là một yếu tố quan trọng trong việc tạo thành sản phẩm (II) thể hiện ở chỗ:
Một mặt: Nếu thời gian ngắn có thể phản ứng không xảy ra hoàn toàn.
Mặt khác: Thời gian kéo dài có thể xảy ra sự O1-demethyl hóa của (II) để tạo thành sản phẩm O1,O2-didemethyl hóa (III) hoặc xảy ra sự N-demethyl hóa của (II) để tạo thành sản phẩm O2, N-didemethyl hóa (IV).
Chính vì thế chúng tôi quyết định khảo sát lƣợng HBr 48% (ml) ảnh hƣởng đến thời gian phản ứng. Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khảo sát lƣợng HBr 48% (ml) ảnh hƣởng đến thời gian phản ứng bán tổng hợp (II) stt Nguyên liệu (g) VHBr 48% (ml) Thời gian phản ứng (giờ) Hiệu suất (%) tonc (oC) 1 0,2 5,2 5,5 59,0 215-219 2 0,2 10,4 4,0 58,3 214-218 3 0,2 15,6 3,5 60,0 214-217 4 0,2 20,8 3,5 57,2 214-217 5 0,2 26,0 3,25 58,0 214-218
Nhận xét: Lƣợng HBr 48% cho vào phản ứng tỉ lệ nghịch với thời gian phản ứng. Tuy nhiên, một mặt lƣợng HBr không ảnh hƣởng nhiều tới hiệu suất của phản ứng. Mặt khác HBr 48% có nhiệt độ sôi ở 122o
C, khó để cất đi trong
Hình 20. Cấu trúc sản phẩm phụ (III) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin
Hình 21. Cấu trúc sản phẩm phụ (IV) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin
quá trình tinh chế sản phẩm. Chính vì vậy chúng tôi quyết định chọn điều kiện phản ứng theo tỉ lệ 0,48 g nuciferin : 25ml HBr 48%.
3.2.2 Tiến hành demethyl hóa nuciferin sử dụng tác nhân HBr xúc tác KI
- KI có tác dụng tạo ion I-
là tác nhân ái nhân có vai trò xúc tác làm tăng tốc độ phản ứng. Chính vì thế chúng tôi quyết định khảo sát lƣợng KI (mmol) ảnh hƣởng đến thời gian phản ứng monodemethyl hóa nuciferin.
- Thiết kế thí nghiệm: Tƣơng tự nhƣ phần 3.2.1, kết quả khảo sát đƣợc trình bày ở bảng 3.2.
Nhận xét: Có mặt ion I- làm tốc độ phản ứng tăng lên và làm giảm thời gian phản ứng, KI không ảnh hƣởng đến hiệu suất của phản ứng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.3 Đề xuất quy trình bán tổng hợp sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid hydrobromid
Bảng 3.2.Khảo sát lượng KI ảnh hưởng đến thời gian phản ứng monodemethyl hóa nuciferin stt Nuciferin (g) HBr 48% (ml) KI (mmol) Thời gian phản ứng (giờ) Hiệu suất (%) tonc (oC) 1 0,2 10,4 0,00 4,00 59,6 214-218 2 0,2 10,4 0,34 3,25 61,0 214-220 3 0,2 10,4 0.68 3,00 62,5 214-217 4 0,2 10,4 1,01 2,75 58,0 215-218 5 0,2 10,4 1,36 2,75 60,0 214-217
Chuẩn bị phản ứng: Cho nuciferin (0,48g, 0,0015 mol), KI (0,28g, 0,0017 mol), HBr 48% (25 ml) vào bình cầu 2 cổ 100 ml, khuấy từ, có thiết bị sục khí N2 và sinh hàn hồi lƣu.
Tiến hành phản ứng: đƣa phản ứng lên nhiệt độ 120 – 125 oC trong 3 giờ.
Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Cất sạch dịch trong phản ứng thu đƣợc cặn chất rắn màu vàng. Hòa tan tủa vào 250 ml cồn 96o
nóng, xử lý màu bằng than hoạt tính. Bay hơi bớt dịch còn khoảng 50ml, để lạnh kết tinh thành tinh thể hình kim, mịn. Sau 24h lọc lấy tinh thể, sấy khô ở 70o
C. Hiệu suất 60-62%.
3.3 Tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-(2-hydroxyethyl)-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin (2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin, V) methyldiabenzoquinolin (2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin, V)
Hình 22. Sơ đồ dụng cụ đề xuất cho phản ứng demethyl hóa nuciferin
5,5a,7,8-tetrahydro-2-(2-hydroxyethyl)-1-methoxy-6-
methyldiabenzoquinolin (V) là sản phẩm O-alkyl hóa chất (II) bằng tác nhân 2-cloroethanol (EC).
Phương trình phản ứng:
Hình 23. Sơ đồ phản ứng tạo sản phẩm O-alkyl hóa nuciferin
3.3.1 Sử dụng môi trường NaOH loãng
Chuẩn bị phản ứng: Cho vào bình cầu 0,1 g chất (II) (0,28 mmol), thêm 11,6 ml NaOH 0,05M.
Tiến hành phản ứng: Khuấy hỗn hợp trong 20 phút (sục N2 ). Thêm 0,16 ml EC (1,65 mmol). Theo dõi qua trình phản ứng bằng SKLM. Kết thúc phản ứng sau 24 giờ.
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sử dụng dicloromethan chiết hỗn hợp phản ứng. Lấy pha dicloromethan bốc hơi dung môi đến kiệt. Hòa tan hỗn hợp thu đƣợc trong methanol, xử lý tạp màu bằng than hoạt tính. Bay hơi hết dung môi, thêm 3ml dicloromethan để hòa tan. Sử dụng sắc ký điều chế tách sản phẩm từ dịch dicloromethan.
Kết quả:
Dịch trƣớc sắc ký điều chế: thử độ tinh khiết bằng SKLM (triển khai hệ dung môi 2, dịch mẫu là chất (II), dịch thử là dịch xử lý của phản ứng trƣớc sắc ký điều chế), soi dƣới đèn tử ngoại thu đƣợc 2 vết.
- Vết 2 là (V), Rf= 0,46.
Sau sắc ký điều chế:
- Thu đƣợc 0,01g chất (V), hiệu suất 10%.
- Kiểm nghiệm bằng SKLM cho thấy vết tách đƣợc là chất (V), chất tinh khiết.
*Sắc ký điều chế tách sản phẩm được tiến hành như sau: Chấm dung dịch sau xử lý phản