asimilobin hydrobromid (II) và sản phẩm 2-hydroxyethyl-1-methoxy- aporphin (V)
Thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm theo 2 phƣơng pháp: - Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH (phƣơng pháp DPPH). - Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do superoxid (phƣơng pháp SOD).
Chuẩn bị mẫu thử:
Mẫu thử đƣợc hòa tan trong dung môi DMSO để đƣợc dung dịch gốc có nồng độ 10 mg/ml. Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng dung môi/ đệm thích hợp để thu đƣợc 6 dung dịch có nồng độ trong khoảng từ 1 – 300 µg/ml.
Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH:
Thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH đƣợc tiến hành trên đĩa 96 giếng Costar 3596 (Corning, Mỹ). Trên mỗi đĩa gồm các giếng chứng và các giếng thử. Song song với mỗi mẫu chứng và mẫu thử, có một mẫu trắng của chứng, trắng của thử đƣợc tiến hành trong cùng điều kiện. Các giếng đƣợc bố trí trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH DMSO dd thử dd DPPH MeOH Giếng thử 20 µl 180 µl Giếng trắng thử 20 µl 180 µl Giếng chứng 20 µl 180 µl Giếng trắng chứng 20 µl 180 µl
Đĩa đƣợc giữ trong bóng tối 15 phút. Sau đó, đo mật độ quang của dung dịch ở bƣớc sóng 517 nm, sử dụng hệ thống máy ELISA (Biotek).
Tác dụng dọn gốc tự do DPPH đƣợc đánh giá thông qua tỷ lệ giảm mật độ quang (OD) của mẫu thử so với mẫu chứng:
I =
Trong đó, chứng = ODchứng – ODtrắng chứng; thử = ODthử – ODtrắng thử. Xác định giá trị IC50 của mỗi mẫu thử, là giá trị nồng độ tại đó mẫu dọn đƣợc 50% số gốc tự do DPPH có trong giếng thử.
Thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD đƣợc tiến hành trên đĩa 96 giếng Costar 3596 (Corning, Mỹ). Trên mỗi đĩa 96 giếng gồm các giếng chứng và các giếng thử. Song song với mỗi mẫu chứng và mẫu thử, có một mẫu trắng của chứng, trắng của thử đƣợc tiến hành trong cùng điều kiện. Các giếng đƣợc bố trí trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD
Nƣớc cất dd thử dd làm việc WST dd enzym làm việc dd đệm pha loãng Giếng thử 20 µl 200 µl 20 µl Giếng trắng thử 20 µl 200 µl 180 µl Giếng chứng 20 µl 200 µl 20 µl Giếng trắng chứng 20 µl 200 µl 180 µl
Đĩa đƣợc ủ ở 37oC trong 20 phút. Sau đó, đo mật độ quang của dung dịch ở bƣớc sóng 450 nm, sử dụng hệ thống máy ELISA (Biotek).
Tác dụng dọn gốc tự do SOD đƣợc đánh giá thông qua tỷ lệ giảm mật độ quang (OD) của mẫu thử so với mẫu chứng:
I =
Trong đó, chứng = ODchứng – ODtrắng chứng; thử = ODthử – ODtrắng thử. Xác định giá trị IC50 của mỗi mẫu thử, là giá trị nồng độ tại đó mẫu dọn đƣợc 50% số gốc tự do SOD có trong giếng thử.
Phƣơng pháp xử lý số liệu:
- Giá trị đƣợc biểu diễn dƣới dạng M ± SD (M lá giá trị trung bình của từng mẫu, SD là độ lệch chuẩn), so sánh giá trị trung bình của các mẫu thử so với chứng bằng t-test. Sự khác biệt đƣợc coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
- Tính IC50 và khoảng tin cậy 95% của IC50 bằng phƣơng pháp phân tích hồi quy không tuyến tính (nonlinear regression) sử dụng phần mềm Graph Prism 5.
Kết quả:
Kết quả đánh giá tác dụng của mẫu THC đƣợc trình bày trong các bảng 3.10 và bảng 3.11:
Bảng 3.10. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC50 của mẫu thử
Mẫu Nồng độ 300µg/ml Nồng độ 100µg/ml Nồng độ 10 µg/ml IC50 (µg/ml) I (%) I (%) I (%) Chứng 0,667±0,011 Chất (II) 0,048±0,007 91,1 0,417±0,022 37,4 0,656±0,039 1,1 570,3 (280,4 - 1160) Chất (V) 0,364±0,039 32,0 0,602±0,035 9,8 0,703±0,044 0 - Bảng 3.11. Tác dụng dọn gốc tự do SOD ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC50 của mẫu thử
Mẫu Nồng độ 300µg/ml Nồng độ 100µg/ml Nồng độ 10 µg/ml IC50 (µg/ml) I (%) I (%) I (%) Chứng 0,798±0,007 Chất (II) 0,384±0,008 52,0 0,531±0,085 33,4 0,689±0,045 13,4 95,47 (31,04 – 293,6) Chất (V) 0,335±0,019 58,2 0,539±0,061 32,5 0,633±0,055 20,4 530,2 (57,14 - 4919)
Kết quả:
- N-methyl-asimilobin hydrobromid (II) có khả năng dọn gốc tự do DPPH với IC50 = 570,3 (µg/ml) và có khả năng dọn gốc tự do SOD với IC50 = 95,47 (µg/ml)
- 2-Hydroxyethyl-1-methoxyaporphin (V) không có khả năng dọn gốc tự do DPPH nhƣng có khả năng dọn gốc tự do SOD với IC50 =530,2 (µg/ml)
BÀN LUẬN
1. Về quy trình O2-demethyl hóa nuciferin
- Vai trò của HBr 48% và KI trong phản ứng monodemethyl nuciferin: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Vai trò của việc sục N2 trong quá trình phản ứng: Trong quá trình phản ứng tạo ra sản phẩm N-methyl-asimilobin là sản phẩm có nhóm –OH gắn với nhân thơm dễ bị oxy hóa thành các sản phẩm màu khi có mặt O2 và to trong quá trình phản ứng. Vì vậy sự sục N2 có vai trò quan trọng đảm bảo sự oxy hóa tối thiểu sản phẩm tạo thành, không làm giảm hiệu suất phản ứng và dễ dàng tách, tinh chế sản phẩm sau phản ứng do tạo ít tạp.
2. Về quy trình O2-alkyl hóa bằng tác nhân EC
- Ảnh hƣởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng và các sản phẩm phụ:
NaOH môi trƣờng nƣớc có tính kiềm mạnh, khi sử dụng để làm dung môi phản ứng sẽ dễ tạo các sản phẩm muối amin bậc 4 của nguyên liệu (II) cũng nhƣ là của sản phẩm (V) với tác nhân EC tạo sản phẩm phụ tan trong pha nƣớc làm giảm hiệu suất phản ứng.
N,N-Dimethylformamid (CH3)2NCHO là một dung môi phân cực có khả năng hòa tan đƣợc cả những chất phân cực hoặc không phân cực. Là một dung môi phổ biến trong các phản ứng hóa học vì chúng tăng diện tích tiếp xúc của các thành phần trong hỗn hợp phản ứng. Đặc biệt DMF thƣờng đƣợc sử dụng cho các phản ứng theo cơ chế phân cực, nhất là các phản ứng SN2. Nhiệt độ sôi 152-154o
C
Acetonitril CH3CN là một dung môi trung tính phân cực có khả năng hòa tan cả những chất phân cực hoặc không phân cực làm tăng diên tích tiếp xúc giữa các thành phần trong hỗn hợp phản ứng. Là dung môi thƣờng sử dụng trong HPLC. Nhiệt độ sôi 81-82o
C
Cả hai dung môi trên đƣợc chọn cho phản ứng vì khả năng tăng diện tích tiếp xúc giữa pha hữu cơ và vô cơ, đồng thời giữ cho pH của môi trƣờng phản ứng không tăng lên quá cao, tránh tạo ra quá nhiều sản phẩm muối amin bậc 4.
- Vai trò của việc làm khan dụng cụ và hóa chất trƣớc khi phản ứng và sục N2 trong quá trình phản ứng:
Khi có mặt H2O cũng nhƣ O2 trong phản ứng sẽ tạo điều kiện cho sự oxy hóa N-methyl-asimilobin thành các tạp màu làm giảm hiệu suất của phản ứng.
3. Về phần xác định cấu trúc
Cấu trúc của sản phẩm chiết xuất và các sản phẩm bán tổng hợp đã đƣợc khẳng định bởi các phƣơng pháp phổ: IR, NMR và MS. Sau đây là bàn luận về dữ liệu phân tích từ các phổ của nuciferin (I), N-methyl-asimilobin
hydrobromid (II) và 2-hydroxyethyl-1-methoxyaporphin (V).
Kết quả phân phổ hồng ngoại của nuciferin chiết xuất từ lá sen đã được dẫn ra ở bảng 3.3.
Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm chiết xuất xuất hiện các dải hấp thụ đặc trƣng của các nhân thơm: C-H thơm đặc trƣng tại 3010 cm-1, C=C thơm - tại 1591, 1497 và 1452 cm-1. Các liên kết ether C-O cho dải hấp thụ đặc trƣng xung quanh 1243 cm-1. C-N (amin no bậc 3) cho đỉnh hấp thụ tại 1104 cm-1.
Kết quả phân phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của nuciferin đã được dẫn ra ở bảng 3.4.
Trên phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của sản phẩm xuất hiện các tín hiệu đặc trƣng của 2 nhân thơm nuciferin, trong đó proton tại carbon số 11 (H-
11) có độ chuyển dịch hóa học trong trƣờng yếu nhất (8,16 ppm) dƣới dạng doublet với hằng số tƣơng tác 7,5 Hz (ortho với H-10). Proton thơm H-3 đứng độc lập - không tƣơng tác với các vị trí xung quanh - nên cho tín hiệu singlet tại 6,77 ppm. Hai nhóm methyl gắn với oxy có độ chuyển dịch hóa học là 3,57 và 3,80 ppm. Trong khi đó tín hiệu của nhóm methyl gắn với nitơ xuất hiện ở 2,42 ppm. Bộ tín hiệu của các proton còn lại trong cấu trúc của nuciferin đều quan sát thấy trên phổ. Tín hiệu do dung môi DMSO xuất hiện ở 2,50 ppm. Trên phổ cũng quan sát thấy tín hiệu của tạp nƣớc trong DMSO với độ chuyển dịch hóa học là 3,36 ppm.
Trên phổ khối lƣợng quan sát thấy pic phân tử là: [M+H]+
(m/z 296,0). Điều này phù hợp với công thức phân tử của sản phẩm dự kiến là C19H21NO2 (M = 295,38).
Từ kết quả phân tích các phổ, chúng tôi kết luận sản phẩm chiết xuất đƣợc từ lá sen là nuciferin (1,2-dimethoxy-6-methyl-5,6,6a,7-tetrahydro-4H- dibenzo[de,g]quinolin hay 1,2-dimethoxyaporphin).
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của sản phẩm phản ứng demethyl hóa nuciferin đã được dẫn ra ở bảng 3.5.
Trên phổ hồng ngoại của sản phẩm phản ứng demethyl hóa xuất hiện các dải hấp thụ đặc trƣng của nhóm OH phenol (tồn tại dạng liên kết hydro nội, ngoại phân tử) tại vùng xung quanh giá trị 3300 cm-1. Các nhân thơm khung aporphin cho các đỉnh hấp thụ đặc trƣng tại: 3010 cm-1 (C-H thơm); và 1612, 1574, 1502, 1464 cm-1 (C=C thơm). Các liên kết C-H no có giá trị số sóng đặc trƣng tại 2924 và 2845 tƣơng ứng với dao động bất đối xứng và đối xứng. Các liên kết C-O (ether và phenol) cho các dải hấp thụ đặc trƣng trong vùng 1024- 1283 cm-1. Nhƣ vậy kết quả phổ IR đã chỉ ra rằng demethyl hóa xảy ra trên 1 trong 2 nhóm methoxy của nuciferin. Các dải hấp thụ tại 2651, 2601, 2536 cm- 1
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm phản ứng demethyl hóa nuciferin đã được dẫn ra ở bảng 3.6.
Trên phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của sản phẩm phản ứng demethyl hóa xuất hiện tín hiệu singlet đặc trƣng của nhóm OH phenol tại 9,97 ppm. Mặt khác, chỉ quan sát thấy tín hiệu của một nhóm O-CH3 tại 3,86 ppm. Điều này chứng tỏ đã xảy ra phản ứng monodemethyl hóa nuciferin. Độ chuyển dịch hóa học của CH thơm tại vị trí số 3 (H-3) của nuciferin nguyên liệu là 6,77, trong khi đó giá trị này của sản phẩm là lớn hơn - 6,85 ppm. Điều này là do sự ảnh hƣởng khác nhau của 2 nhóm thế ở vị trí ortho so với H-3 (OH và OCH3), trong đó nhóm OH sẽ cho giá trị δ lớn hơn. Nhƣ vậy demethyl hóa đã xảy tại C-2 của khung aporphin. Nhóm methoxy tại C-1 vẫn đƣợc giữ nguyên trên khung, có độ chuyển dịch hóa học 3,86 ppm (trùng với giá trị của methoxy tại C-1 trong nuciferin). Các tín hiệu còn lại của khung aporphin đều quan sát thấy trên phổ. Đáng chú ý là sản phẩm thu đƣợc là dạng muối hydrobromid của amin bậc 3. Điều này thể hiện ở sự chuyển dịch mạnh sang trƣờng yếu của các tín hiệu proton tại vị trí 5 và 6a (H-5, H-6a). Đồng thời quan sát thấy tín hiệu của NH+
tại 9,97 ppm. Tín hiệu do dung môi DMSO xuất hiện ở 2,50 ppm. Trên phổ cũng quan sát thấy tín hiệu của tạp nƣớc trong DMSO với độ chuyển dịch hóa học là 3,33 ppm.
Trên phổ khối lƣợng quan sát thấy pic phân tử là: [M-HBr+H]+
(m/z 282,36) và [2M-HBr+H]+ (m/z 563,20). Điều này phù hợp với công thức phân tử của sản phẩm dự kiến là C18H20BrNO2 hay C18H19NO2.HBr (M = 362,26, M - HBr = 281,35).
Kết quả phân tích các phổ trên cho phép chúng tôi khẳng định sản phẩm thu đƣợc từ phản ứng demethyl hóa nuciferin là 2-hydroxy-1-methoxy- aporphin hydrobromid hay N-methyl-asimilobin hydrobromid. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
N-Methyl-asimilobin (dạng base tự do) là chất đã đƣợc công bố trong tài liệu [20] với nhiệt độ nóng chảy là 195-197oC. Dạng hydrobromid không thấy công bố trong các tài liệu chuyên ngành. Mặt khác theo [23] sản phẩm thu đƣợc trong điều kiện phản ứng tƣơng tự nhƣ chúng tôi tiến hành là didemethyl của nuciferin (1,2-dihydroxy-aporphin hydrobromid) với nhiệt độ nóng chảy là 226-228oC. Kết quả của chúng tôi đã đính chính kết quả này: sản phẩm thu đƣợc trong điều kiện nhƣ trên (đun sôi nuciferin trong HBr 48% liên tục 4 giờ) phải là 2-hydroxy-1-methoxy-aporphin hydrobromid.
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm phản ứng hydroxyethyl hóa N-methyl-asimilobin hydrobromid đã được dẫn ra ở bảng 3.7.
Trên phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của sản phẩm phản ứng hydroxyethyl hóa xuất hiện tín hiệu đặc trƣng của nhóm -O-CH2-CH2-O tại 3,88 ppm. Nhóm methoxy tại C-1 cho tín hiệu tại 3,72 ppm. Các tín hiệu của khung aporphin đều quan sát thấy trên phổ. Do phổ của sản phẩm ghi trong dung môi methanol nên không quan sát thấy tín hiệu OH của nhóm hydroxyethyl. Ngoài ra, methanol là dung môi phân cực, nên có ảnh hƣởng nhẹ tới các proton của carbon gắn với oxy và nito, nhƣ H-5, H-6a, H-1’, H-4’, trong đó giá trị chuyển dịch hóa học đo trong methanol lớn hơn so với trong DMSO - theo kết quả của nuciferin - khoảng 0,1-0,2 ppm. Tín hiệu do dung môi methanol (chƣa bị deuteri hóa hoàn toàn) xuất hiện ở 3,33 ppm. Trên phổ cũng quan sát thấy tín hiệu của tạp nƣớc trong methanol với độ chuyển dịch hóa học là 4,88 ppm.
Trên phổ khối lƣợng quan sát thấy các pic phân tử là: [M+H]+
(m/z 326,13), [M+Na]+ (m/z 348,10) và [2M+Na]+ (m/z 673,19). Điều này phù hợp với công thức phân tử của sản phẩm dự kiến là C20H23NO3 (M = 325,40).
Kết quả phân tích các phổ trên cho phép chúng tôi khẳng định sản phẩm thu đƣợc từ phản ứng hydroxyethyl hóa là 2-hydroxyethyl-1-methoxy- aporphin. Đây là dẫn chất mới, không đƣợc tìm thấy trong các tài liệu đã công bố.
4. Về phần tác dụng chống oxy hóa của các sản phẩm:
Tác động của các gốc tự do đã đƣợc chứng mình có mỗi liên hệ mật thiết với một loạt các bệnh nhƣ: Lão hóa, ung thƣ, tiểu đƣờng, rối loạn tim mạch, viêm khớp dạng thấp,.. Do đó mối quan tâm hiện nay của các nhà khoa học nghiên cứu về vấn đề này chính là các vai trò tiềm năng của các chất chống oxy hóa trong điều trị và phòng ngừa các bệnh trên. Bƣớc đầu của quá trình nghiên cứu chính là việc thử tác dụng dọn gốc tự do của các hoạt chất, sử dụng phƣơng pháp DPPH, phƣơng pháp nitric oxid hay cả SOD (superoxide) [37].
Kết quả thử tác dụng chống oxy hóa cho thấy:
- N-Methyl-asimilobin hydrobromid (II) có khả năng dọn gốc tự do DPPH với IC50 =570,3 (µg/ml) và có khả năng dọn gốc tự do SOD với IC50 =95,47 (µg/ml).
- 2-Hydroxyethyl-1-methoxyaporphin (V) không có khả năng dọn gốc tự do DPPH nhƣng có khả năng dọn gốc tự do SOD với IC50 =530,2 (µg/ml).
Với những giá trị IC50 trên cho thấy rằng: Với thử nghiệm trên mô hình
in vitro cho thấy tác dụng chống oxy hóa của 2 sản phẩm kém hơn so với dịch chiết cồn của hạt sen (phƣơng pháp DPPH, IC50 có giá trị là 6,12 ± 0,41 µg/ml) (phần 1.2.3.2).
Hiện nay trên thế giới chƣa có thử nghiệm nào về tác dụng chống oxy hóa của chất (II) và (V), đặc biệt chất (V) còn là một chất mới chƣa từng đƣợc tổng hợp và nghiên cứu. Chính vì vậy tuy chƣa có nhiều ý nghĩa về mặt tác dụng chống oxy hóa, nhƣng các thử nghiệm trên có ý nghĩa lớn về mặt khoa học. Chúng tôi đề xuất việc hoàn thiện quy trình bán tổng
hợp, tách và tinh chế sản phẩm để có đƣợc nguồn nguyên liệu tinh khiết, đồng thời thử thêm nhiều tác dụng sinh học khác nhƣ tác dụng chống ung thƣ, chống HIV, chống béo phì, hạ lipid máu,…
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.