methyldiabenzoquinolin (2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin, V)
Hình 22. Sơ đồ dụng cụ đề xuất cho phản ứng demethyl hóa nuciferin
5,5a,7,8-tetrahydro-2-(2-hydroxyethyl)-1-methoxy-6-
methyldiabenzoquinolin (V) là sản phẩm O-alkyl hóa chất (II) bằng tác nhân 2-cloroethanol (EC).
Phương trình phản ứng:
Hình 23. Sơ đồ phản ứng tạo sản phẩm O-alkyl hóa nuciferin
3.3.1 Sử dụng môi trường NaOH loãng
Chuẩn bị phản ứng: Cho vào bình cầu 0,1 g chất (II) (0,28 mmol), thêm 11,6 ml NaOH 0,05M.
Tiến hành phản ứng: Khuấy hỗn hợp trong 20 phút (sục N2 ). Thêm 0,16 ml EC (1,65 mmol). Theo dõi qua trình phản ứng bằng SKLM. Kết thúc phản ứng sau 24 giờ.
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sử dụng dicloromethan chiết hỗn hợp phản ứng. Lấy pha dicloromethan bốc hơi dung môi đến kiệt. Hòa tan hỗn hợp thu đƣợc trong methanol, xử lý tạp màu bằng than hoạt tính. Bay hơi hết dung môi, thêm 3ml dicloromethan để hòa tan. Sử dụng sắc ký điều chế tách sản phẩm từ dịch dicloromethan.
Kết quả:
Dịch trƣớc sắc ký điều chế: thử độ tinh khiết bằng SKLM (triển khai hệ dung môi 2, dịch mẫu là chất (II), dịch thử là dịch xử lý của phản ứng trƣớc sắc ký điều chế), soi dƣới đèn tử ngoại thu đƣợc 2 vết.
- Vết 2 là (V), Rf= 0,46.
Sau sắc ký điều chế:
- Thu đƣợc 0,01g chất (V), hiệu suất 10%.
- Kiểm nghiệm bằng SKLM cho thấy vết tách đƣợc là chất (V), chất tinh khiết.
*Sắc ký điều chế tách sản phẩm được tiến hành như sau: Chấm dung dịch sau xử lý phản ứng chứa 2 hoặc 3 vết lên những bản mỏng có kích thước 20 x 20 cm được tráng chất hấp phụ là silica gel G (Merck), đã hoạt hóa ở 110o
C trong 1 giờ ( một bản mỏng cho một phản ứng với 0,1g nguyên liệu). Hệ dung môi khai triển là CHCl3 : MeOH (60 : 1). Bản mỏng để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó soi dưới “đèn soi UV sắc kí CN6” đánh dấu vùng chứa sản phẩm. Cạo lấy silica gel chứa chất cần tách, phản hấp phụ bằng CHCl3 : MeOH (60 : 1) và lọc lấy dịch. Bay hơi hết dung môi thu được sản phẩm cần tổng hợp.
Nhận xét:
a. Về sắc ký theo dõi phản ứng trong quá trình phản ứng (triển khai hệ dung môi 2): - Trên bản mỏng sắc ký thu đƣợc 4 vết sản phẩm ký hiệu là V1 - V2 - V3 - V4 với giá trị Rf lần lƣợt là: 0,53 – 0,46 – 0,40 – 0,32 , trong đó V1 là nguyên liệu (II) chƣa phản ứng. - Sau khi chiết hỗn hợp phản ứng bằng dicloromethan thì V1 và V2 chuyển sang pha hữu cơ, dự đoán V2 là vết của sản phẩm (V)
cần tổng hợp. Bởi trong môi trƣờng base thì alkaloid tồn tại ở dạng base, có thể chiết dễ dàng sang pha hữu cơ, còn V3, V4 dự đoán là sản phẩm phụ, dự đoán là chất (VI) và chất (VII) (muối amin bậc 4 của alkaloid, tan trong pha nƣớc).
Hình 24. Cấu trúc sản phẩm phụ (VI) của phản ứng O-alkyl hóa
b. Về phƣơng pháp sử dụng dung dịch NaOH loãng làm môi trƣờng phản ứng: Dung dịch NaOH có thẻ là tác nhân kiềm mạnh nên dễ tạo sản phẩm phụ muối amin bậc 4 làm giảm hiệu suất phản ứng.
3.3.2 Sử dụng dung môi DMF, xúc tác K2CO3
Chuẩn bị phản ứng: Cho vào bình cầu 0,1 g chất (II) (0,28 mmol), 0,8 g K2CO3 (khan) thêm 15 ml DMF (sục N2).
Tiến hành phản ứng: Khuấy hỗn hợp trong 30 phút (sục N2 ) ở nhiệt độ 100oC. Thêm 0,8 ml EC. Theo dõi qua trình phản ứng bằng SKLM. Kết thúc phản ứng sau 45 giờ.
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Lọc hỗn hợp phản ứng loại muối vô cơ, dịch thu đƣợc đem cô dƣới áp suất giảm, thêm nhiều lần cồn 96o
để cất cùng làm quá trình bay hơi hết dịch tốn ít thời gian hơn. Thêm nƣớc và dicloromethan vào hỗn hợp thu đƣợc lắc và chiết lấy pha hữu cơ dicloromethan. Sau đó xử lý pha dicloromethan nhƣ phần 3.3.1 và tách lấy sản phẩm bằng sắc ký điều chế.
Kết quả: Thu đƣợc 0,03g chất V, hiệu suất 30%. Thử tinh khiết bằng SKLM cho thấy sản phẩm thu đƣợc tinh khiết.
Nhận xét:
- Sử dụng SKLM theo dõi quá trình phản ứng cho thấy lƣợng sản phẩm phụ tạo ra rất ít V3 và không tạo ra V4.
- Dung môi DMF nhiệt độ sôi khá cao (152-154o
C) nên gây khó khăn trong quá trình xử lý hỗn hợp sản phẩm giai đoạn ngay sau phản ứng cần bay hơi hết dung môi.
3.3.3 Sử dụng dung môi acetonitril, xúc tác K2CO3
Hình 25. Cấu trúc sản phẩm phụ (VII) của phản ứng O-alkyl hóa
Chuẩn bị phản ứng: Cho vào bình cầu 0,1 g chất (II) (0,28 mmol), 0,8 g K2CO3 (khan) thêm 20 ml acetonitril (sục N2).
Tiến hành phản ứng: Khuấy hỗn hợp trong 30 phút (sục N2 ) ở nhiệt độ 80-85oC. Thêm 0,8 ml EC. Theo dõi qua trình phản ứng bằng SKLM. Kết thúc phản ứng sau 24 giờ.
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Lọc hỗn hợp phản ứng loại muối vô cơ, dịch thu đƣợc đem cô dƣới áp suất giảm. Thêm nƣớc và dicloromethan vào hỗn hợp thu đƣợc lắc và chiết lấy pha hữu cơ dicloromethan. Sau đó xử lý pha dicloromethan nhƣ phần 3.3.1 và tách lấy sản phẩm bằng sắc ký điều chế.
Kết quả: Thu đƣợc 0,04 g chất (V), hiệu suất 40%. Thử tinh khiết bằng phƣơng pháp SKLM cho thấy sản phẩm thu đƣợc tinh khiết.
Nhận xét:
- Sử dụng dung môi acetonitril cho hiệu suất cao nhất trong số các dung môi thử.
- SKLM theo dõi quá trình phản ứng cho thấy không tạo ra sản phẩm phụ V3 và V4 trong quá trình phản ứng.
3.3.4 Đề xuất quy trình
Hình 26. Quy trình đề xuất cho phản ứng O-alkyl hóa chất (II) để tổng hợp sản phẩm thế của nuciferin: 2-Hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (V)
Chuẩn bị phản ứng: Cho vào bình cầu 0,1 g chất II (0,28 mmol), 0,8 g K2CO3 (khan) thêm 20 ml acetonitril (sục N2).
Tiến hành phản ứng: Khuấy hỗn hợp trong 30 phút (sục N2 ) ở nhiệt độ 80-85oC. Thêm 0,8 ml EC. Theo dõi qua trình phản ứng bằng SKLM. Kết thúc phản ứng sau 24 giờ.
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Lọc hỗn hợp phản ứng loại muối vô cơ, dịch thu đƣợc đem cô dƣới áp suất giảm. Thêm nƣớc và dicloromethan vào hỗn hợp thu đƣợc lắc và chiết lấy pha hữu cơ dicloromethan. Sau đó xử lý pha dicloromethan nhƣ phần 3.3.1 và tách lấy sản phẩm bằng sắc ký điều chế, hiệu suất thu đƣợc 40%. 0,1gN-Methylasimilobin.HBr 0,8gK2CO3(khan) 20mlAcetonitril 30p 0,8ml2-Cloroethanol
3.4 Kết quả phân tích cấu trúc của nuciferin và các sản phẩm bán tổng hợp hợp
Cấu trúc của sản phẩm chiết xuất và các sản phẩm bán tổng hợp đƣợc khẳng định bởi các phƣơng pháp phổ: IR, NMR và MS. Sau đây là các bảng phân tích các phổ của nuciferin (I), N-methyl-asimilobin hydrobromid (II) và 2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (V). (Bảng 3.3, 3,4, 3.5, 3.6, 3.7).
Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin (IR, KBr) – Phụ lục 11 nuciferin Nhóm chức Đỉnh hấp thụ đặc trƣng (ῡ, cm-1) =C-H (thơm) 3010 -C-H (no) 2958, 2838 C=C (thơm) 1591, 1497, 1452 C-O-C 1243 C-N 1104
Bảng 3.4.Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của nuciferin (1H-NMR, DMSO) – phụ lục 13, 14, 15
Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) Dạng proton
2,34 (2H, m, H-4) Ar-CH2 2,42 (3H, s, H-3’) N-CH3 2,63 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-7α) Ar-CH2- 2,82 (1H, dd, J1 = 4,0 Hz, J2 = 14,0 Hz, H-6a) N-CH- 2,96 (2H, m, H-5) N-CH2-
3,13 (1H, dd, J1 = 3,5 Hz, J2 = 14,0 Hz, H-7β) Ar-CH2- 3,57 (3H, s, H-2’) O-CH3 3,80 (3H, s, H-1’) O-CH3 6,77 (1H, s, H-3) =CH thơm 7,22 (1H, m, H-10) =CH thơm 7,27 (2H, m, H-8, H-9) =CH thơm 8,16 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-11) =CH thơm
Ghi chú: s - singlet, d - doublet, dd - doublet của doublet, m - multiplet, Ar - nhân thơm.
Bảng 3.5.Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của N-methyl-asimilobin hydrobromid (IR, KBr) – phụ lục 1 Nhóm chức Đỉnh hấp thụ đặc trƣng (ῡ, cm-1) OH phenol (liên kết hydro) 3332, 3300 =C-H (thơm) 3010 -C-H (no) 2924, 2845 -NH+ (muối hydrobromid) 2651, 2601, 2536 C=C (thơm) 1612, 1574, 1502, 1464 C-O-C 1283, 1251, 1129, 1024
Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid (1 H-NMR, DMSO) – phụ lục 4, 5, 6 Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) Dạng proton 2,78 (2H, t, J = 14, H-4β) Ar-CH2- 2,94 (2H, m, H-4α) 3,08 (3H, s, H-3’) N+-CH3 3,16-3,22 (1H, m, H-7β) Ar-CH2- 3,42 (1H, m, H-7α) 3,45 (1H, m, H-5β) N+-CH2- 3,72 (1H, m, H-5α) 4,27 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-6a) N + -CH- 3,86 (3H, s, H-1’) O-CH3 6,85 (1H, s, H-3) =CH thơm 7,25 (1H, m, H-10) =CH thơm 7,34 (2H, m, H-8, H-9) =CH thơm 8,34 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-11) =CH thơm
9,11 (1H, s, OH) -OH phenol 9,97 (1H, s, H-6) -NH+-
Bảng 3.7.Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm 2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (1H-NMR, MeOD) – phụ lục 8, 9, 10 Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) Dạng proton 2,55 (2H, m, H-4) Ar-CH2- 2,58 (3H, s, H-4’) N-CH3 2,77 (1H, dd, J1 = 4,5 Hz, J2 = 15,5 Hz, H-7α) Ar-CH2- 3,05 (1H, dd, J1 = 3,5 Hz, J2 = 14,0 Hz, H-6a) N-CH- 3,11 (1H, m, H-7β) Ar-CH2- 3,19 (2H, m, H-5) N-CH2- 3,72 (3H, m, H-1’) O-CH3 3,88 (4H, m, H-2’, H-3’) ArO-CH2-CH2-O 6,80 (1H, s, H-3) =CH thơm 7,24 (1H, m, H-10) =CH thơm 7,30 (2H, m, H-8, H-9) =CH thơm 8,38 (1H, d, J = 7,5 Hz, H- 11) =CH thơm
Ghi chú: s - singlet, d - doublet, dd - doublet của doublet, m - multiplet, Ar - nhân thơm.
3.5 Kết quả thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid (II) và sản phẩm 2-hydroxyethyl-1-methoxy- asimilobin hydrobromid (II) và sản phẩm 2-hydroxyethyl-1-methoxy- aporphin (V)
Thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm theo 2 phƣơng pháp: - Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH (phƣơng pháp DPPH). - Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do superoxid (phƣơng pháp SOD).
Chuẩn bị mẫu thử:
Mẫu thử đƣợc hòa tan trong dung môi DMSO để đƣợc dung dịch gốc có nồng độ 10 mg/ml. Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng dung môi/ đệm thích hợp để thu đƣợc 6 dung dịch có nồng độ trong khoảng từ 1 – 300 µg/ml.
Đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH:
Thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH đƣợc tiến hành trên đĩa 96 giếng Costar 3596 (Corning, Mỹ). Trên mỗi đĩa gồm các giếng chứng và các giếng thử. Song song với mỗi mẫu chứng và mẫu thử, có một mẫu trắng của chứng, trắng của thử đƣợc tiến hành trong cùng điều kiện. Các giếng đƣợc bố trí trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH DMSO dd thử dd DPPH MeOH Giếng thử 20 µl 180 µl Giếng trắng thử 20 µl 180 µl Giếng chứng 20 µl 180 µl Giếng trắng chứng 20 µl 180 µl
Đĩa đƣợc giữ trong bóng tối 15 phút. Sau đó, đo mật độ quang của dung dịch ở bƣớc sóng 517 nm, sử dụng hệ thống máy ELISA (Biotek).
Tác dụng dọn gốc tự do DPPH đƣợc đánh giá thông qua tỷ lệ giảm mật độ quang (OD) của mẫu thử so với mẫu chứng:
I =
Trong đó, chứng = ODchứng – ODtrắng chứng; thử = ODthử – ODtrắng thử. Xác định giá trị IC50 của mỗi mẫu thử, là giá trị nồng độ tại đó mẫu dọn đƣợc 50% số gốc tự do DPPH có trong giếng thử.
Thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD đƣợc tiến hành trên đĩa 96 giếng Costar 3596 (Corning, Mỹ). Trên mỗi đĩa 96 giếng gồm các giếng chứng và các giếng thử. Song song với mỗi mẫu chứng và mẫu thử, có một mẫu trắng của chứng, trắng của thử đƣợc tiến hành trong cùng điều kiện. Các giếng đƣợc bố trí trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD
Nƣớc cất dd thử dd làm việc WST dd enzym làm việc dd đệm pha loãng Giếng thử 20 µl 200 µl 20 µl Giếng trắng thử 20 µl 200 µl 180 µl Giếng chứng 20 µl 200 µl 20 µl Giếng trắng chứng 20 µl 200 µl 180 µl
Đĩa đƣợc ủ ở 37oC trong 20 phút. Sau đó, đo mật độ quang của dung dịch ở bƣớc sóng 450 nm, sử dụng hệ thống máy ELISA (Biotek).
Tác dụng dọn gốc tự do SOD đƣợc đánh giá thông qua tỷ lệ giảm mật độ quang (OD) của mẫu thử so với mẫu chứng:
I =
Trong đó, chứng = ODchứng – ODtrắng chứng; thử = ODthử – ODtrắng thử. Xác định giá trị IC50 của mỗi mẫu thử, là giá trị nồng độ tại đó mẫu dọn đƣợc 50% số gốc tự do SOD có trong giếng thử.
Phƣơng pháp xử lý số liệu:
- Giá trị đƣợc biểu diễn dƣới dạng M ± SD (M lá giá trị trung bình của từng mẫu, SD là độ lệch chuẩn), so sánh giá trị trung bình của các mẫu thử so với chứng bằng t-test. Sự khác biệt đƣợc coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
- Tính IC50 và khoảng tin cậy 95% của IC50 bằng phƣơng pháp phân tích hồi quy không tuyến tính (nonlinear regression) sử dụng phần mềm Graph Prism 5.
Kết quả:
Kết quả đánh giá tác dụng của mẫu THC đƣợc trình bày trong các bảng 3.10 và bảng 3.11:
Bảng 3.10. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC50 của mẫu thử
Mẫu Nồng độ 300µg/ml Nồng độ 100µg/ml Nồng độ 10 µg/ml IC50 (µg/ml) I (%) I (%) I (%) Chứng 0,667±0,011 Chất (II) 0,048±0,007 91,1 0,417±0,022 37,4 0,656±0,039 1,1 570,3 (280,4 - 1160) Chất (V) 0,364±0,039 32,0 0,602±0,035 9,8 0,703±0,044 0 - Bảng 3.11. Tác dụng dọn gốc tự do SOD ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC50 của mẫu thử
Mẫu Nồng độ 300µg/ml Nồng độ 100µg/ml Nồng độ 10 µg/ml IC50 (µg/ml) I (%) I (%) I (%) Chứng 0,798±0,007 Chất (II) 0,384±0,008 52,0 0,531±0,085 33,4 0,689±0,045 13,4 95,47 (31,04 – 293,6) Chất (V) 0,335±0,019 58,2 0,539±0,061 32,5 0,633±0,055 20,4 530,2 (57,14 - 4919)
Kết quả:
- N-methyl-asimilobin hydrobromid (II) có khả năng dọn gốc tự do DPPH với IC50 = 570,3 (µg/ml) và có khả năng dọn gốc tự do SOD với IC50 = 95,47 (µg/ml)
- 2-Hydroxyethyl-1-methoxyaporphin (V) không có khả năng dọn gốc tự do DPPH nhƣng có khả năng dọn gốc tự do SOD với IC50 =530,2 (µg/ml)
BÀN LUẬN
1. Về quy trình O2-demethyl hóa nuciferin
- Vai trò của HBr 48% và KI trong phản ứng monodemethyl nuciferin:
- Vai trò của việc sục N2 trong quá trình phản ứng: Trong quá trình phản ứng tạo ra sản phẩm N-methyl-asimilobin là sản phẩm có nhóm –OH gắn với nhân thơm dễ bị oxy hóa thành các sản phẩm màu khi có mặt O2 và to trong quá trình phản ứng. Vì vậy sự sục N2 có vai trò quan trọng đảm bảo sự oxy hóa tối thiểu sản phẩm tạo thành, không làm giảm hiệu suất phản ứng và dễ dàng tách, tinh chế sản phẩm sau phản ứng do tạo ít tạp.
2. Về quy trình O2-alkyl hóa bằng tác nhân EC
- Ảnh hƣởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng và các sản phẩm phụ:
NaOH môi trƣờng nƣớc có tính kiềm mạnh, khi sử dụng để làm dung môi phản ứng sẽ dễ tạo các sản phẩm muối amin bậc 4 của nguyên liệu (II) cũng nhƣ là của sản phẩm (V) với tác nhân EC tạo sản phẩm phụ tan trong pha nƣớc làm giảm hiệu suất phản ứng.
N,N-Dimethylformamid (CH3)2NCHO là một dung môi phân cực có khả năng hòa tan đƣợc cả những chất phân cực hoặc không phân cực. Là một dung môi phổ biến trong các phản ứng hóa học vì chúng tăng diện tích tiếp xúc của các thành phần trong hỗn hợp phản ứng. Đặc biệt DMF thƣờng đƣợc sử dụng cho các phản ứng theo cơ chế phân cực, nhất là các phản ứng SN2. Nhiệt độ sôi 152-154o
C
Acetonitril CH3CN là một dung môi trung tính phân cực có khả năng hòa tan cả những chất phân cực hoặc không phân cực làm tăng diên tích tiếp xúc giữa các thành phần trong hỗn hợp phản ứng. Là dung môi thƣờng sử dụng trong HPLC. Nhiệt độ sôi 81-82o
C
Cả hai dung môi trên đƣợc chọn cho phản ứng vì khả năng tăng diện tích tiếp xúc giữa pha hữu cơ và vô cơ, đồng thời giữ cho pH của môi trƣờng phản ứng không tăng lên quá cao, tránh tạo ra quá nhiều sản phẩm muối amin bậc 4.